趙笑，白沙沙，孔凡華，徐佳佳，柴艷兵，張耀廣，李興佳，李飛，李東，崔亞娟

（1.北京市營養(yǎng)源研究所，北京 100069；2.北京市科學技術研究院，北京 100089；3.石家莊君樂寶乳業(yè)有限公司，石家莊 050221；4.河北君樂寶君源乳業(yè)有限公司，石家莊 050011）

0 引 言

乳蛋白是牛乳中最主要的成分，主要包括酪蛋白和乳清蛋白，同時還有少量的脂肪球膜蛋白[1]。牛奶中的蛋白會因品種、個體、哺乳期等的差異而有所不同，且牛乳中主要蛋白含有多種變異體，使得同種蛋白的功能存在差異[2]。隨著新的蛋白檢測技術和蛋白質組學的發(fā)展，牛乳中越來越多的蛋白被發(fā)現(xiàn)，且其生物活性也被進一步研究[3]。但乳蛋白種類多樣，結構復雜，使得不同蛋白的分離檢測存在一定的難度，其檢測方法依然是限制研究深入的主要瓶頸。

本文綜述了乳蛋白組分的功能性及其不同分析檢測方法的特點，為全面了解乳蛋白質的功能特性，提高牛奶品質，促進健康消費提供指導意義，也為今后乳蛋白的檢測和應用提供借鑒。

1 乳蛋白的功能特性

1.1 乳清蛋白的功能特性

乳清蛋白是高質量的動物蛋白，主要由結構緊湊的球蛋白組成，包含8種必需氨基酸，其比例可以完全滿足人體的需求。乳清蛋白其基本營養(yǎng)功能取決于其獨特的氨基酸序列和蛋白質的空間結構。乳清蛋白含有豐富的蛋氨酸和半胱氨酸，是人體內重要的抗氧化劑；能通過消耗谷胱甘肽（GSH）而使腫瘤細胞對化療更敏感，實現(xiàn)抗癌作用[4]；可促進胰島素釋放進而降低Ⅱ型糖尿病患者的血糖水平[5]；乳清蛋白活性多肽能夠增強免疫細胞功能、抑制腫瘤的生長[6]；乳清蛋白還可以應用于保健品中，實現(xiàn)提高記憶力的功能[7]。此外，乳清蛋白具有起泡能力、乳化特性、微膠束化、持水性、涂層性、成膠性等功能，這些獨特的特性使乳清蛋白作為食品成分應用于食品工業(yè)等領域[8]。

α-La含量約占乳清蛋白的20%，分子量約為14.2 ku，由123個氨基酸組成，包含8個半胱氨酸，形成了4個二硫鍵[9]。該蛋白由泌乳期的乳腺上皮細胞產(chǎn)生，是乳清蛋白產(chǎn)品中的重要過敏原，經(jīng)巴氏滅菌后大部分的α-La可以完整存活。牛乳中α-La的功能特性與人乳中的相似，能提供最接近母乳的氨基酸組合，促進嬰兒的大腦發(fā)育，同時還可以提高蛋白質的生物利用率，降低蛋白質總量，從而有效減輕腎臟負擔，因此廣泛用于保健品，藥品和嬰兒配方食品中[10]。α-La可以與Ca2+，Mg2+，Mn2+，Na+和其他金屬離子合，增強其穩(wěn)定性，改變其功能和特性[11]。α-La含有豐富的色氨酸，色氨酸是神經(jīng)發(fā)育的關鍵因素，是與食欲，情緒和睡眠調節(jié)有關的核心營養(yǎng)成分，還可以調節(jié)泌乳并緩解壓力[12]。有關研究表明，α-La在癲癇發(fā)生的小鼠模型中顯示出保護作用，減少了自發(fā)性癲癇的發(fā)生，其作用機制很可能與色氨酸的轉化有關[13]。此外，α-La經(jīng)蛋白酶解可產(chǎn)生各種活性肽，有助于礦物質的吸收，抗菌和抗腫瘤等的活性[14]。體外實驗已表明含色氨酸的多肽具有廣泛的生物活性，如血管緊張素轉換酶（ACE）抑制以及抗氧化、抗糖尿病活性等[15]。

β-Lg含量約占乳清蛋白的60%，分子量為18.4 ku，由162個氨基酸組成，包含兩個二硫鍵和1個SH鍵[16]，該蛋白由乳腺上皮細胞合成，是牛乳中的主要過敏蛋白，而在人乳中未發(fā)現(xiàn)β-Lg[17]。β-Lg具有增強免疫力和其它生物活性的作用[18]。β-Lg可以結合各種礦物質，脂溶性維生素、磷脂和脂肪酸，從而增強了β-Lg在體內的吸收，以及在低脂、無脂和脂溶性維生素營養(yǎng)保健食品中的使用[19-20]。此外，β-乳球蛋白還具有抗氧化功能，可通過抑制細胞衰老，促進成肌細胞的分化和成熟，減輕氧化應激引起的衰老相關損傷[21]。

BSA質量分數(shù)約占乳清蛋白的10%，分子量為68 ku，存在于血液中，由581個氨基酸組成，包括35個半胱氨酸，形成了17個二硫鍵。BSA具有與脂肪酸和其他小分子結合的疏水性分子結構，具有與β-Lg類似的功能[22]。免疫球蛋白含量約占乳清蛋白的10%，是具有抗體（Ab）活性或化學結構與抗體分子相似的球蛋白，具有抗氧化、提高免疫力的作用[23]。乳鐵蛋白是一個80 ku的鐵結合糖蛋白，牛初乳中質量濃度較高約為1～2 mg/mL，正常乳質量濃度約為0.02～0.35 mg/mL。乳鐵蛋白不僅參與鐵的轉運，而且具有廣譜抗菌、抗氧化、抗癌、調節(jié)免疫系統(tǒng)等強大的生物功能，被認為是一種新型抗菌、抗癌藥物和極具開發(fā)潛力的食品和飼料添加劑[24]。過氧化物酶是牛奶中最豐富的酶，也是乳清蛋白中的主要抗菌成分[25]。

1.2 酪蛋白的功能特性

酪蛋白具有很高的營養(yǎng)價值，其特定的功能性與氨基酸序列有關，由于序列中極性和非極性殘基的不對稱分布形成了酪蛋白分子的親水性和疏水性區(qū)域，使酪蛋白具有良好的乳化能力和發(fā)泡性[26]。酪蛋白存在多個共價磷酸化位置，多數(shù)磷酸化基團以簇狀存在，磷酸化的絲氨酸簇與鈣離子牢固結合，形成了酪蛋白各種生理和營養(yǎng)功能的主要特征[27]。酪蛋白是多種活性肽的來源，包括阿片肽、阿片拮抗劑、血管緊張素轉換酶（ACE）抑制劑、免疫調節(jié)肽、抗菌肽肽、抗血栓形成肽和礦物元素結合肽。酪蛋白脯氨酸含量高，α-螺旋和β-折疊含量低的特點，使得酪蛋白容易被蛋白酶水解，產(chǎn)生多種生物活性多肽[28]。據(jù)報道，酪蛋白及其酶解產(chǎn)物對高濃度葡萄糖誘導的HepG2細胞胰島素抵抗具有改善特性[29]，對肝細胞HHL-5沒有明顯毒性而有促進其增殖的特性[30]。酪蛋白在糖尿病患者的預防和治療方面的應用比較多，酪蛋白水解制備的抗菌肽穩(wěn)定好、能抑制細菌種類多，對禽流感病毒和牛皰疹病毒也有一定的抑制作用[31]。

αs1-CN含量約占牛乳蛋白總量的38%，分子量為23 600 u，由199個氨基酸殘基和8個磷酸基團組成。經(jīng)酶水解產(chǎn)生酪蛋白磷酸肽（CPP），這些肽在體內起重要作用[32]。據(jù)報道，CPP除可增強動物的免疫力和繁殖能力[33-34]，還可以與小腸中的二價離子如鈣，鐵，鋅，硒等結合，從而增加了離子的可溶性，促進了鈣，鐵，鋅和硒的吸收和利用[35]。αs1-CN能夠為動物體的生長發(fā)育提供活性肽、必需氨基酸等營養(yǎng)物質。αs1-CN可被消化酶水解以產(chǎn)生多種活性肽，可以調節(jié)乳腺上皮細胞等多種細胞的生理狀態(tài)及功能[36]。其中23～34個氨基酸片段抑制了血管緊張素轉化酶（ACE）的活性，從而促降低血壓和維持身體健康[37]。αs1-CN的90～96氨基酸片段具有嗎啡肽和阿片肽的作用，可調節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的其他功能[38]。

β-CN含量約占牛乳蛋白總量的35%，分子量為24 000 u，由209個氨基酸組成，包含5個磷酸基團。β-酪蛋白具有高度疏水性，可與磷酸鈣形成穩(wěn)定的微膠粒，從而提高牛乳中的鈣、磷含量[39]。與αs-CN相似，β-CN的15～30氨基酸片段可促進鈣吸收，60～66氨基酸片段具有阿片肽活性，而177～185氨基酸片段具有ACE抑制能力和增強胰高血糖酶素的能力[40]。Nagaoka等[41]利用胰蛋白酶酶解牛乳β-Lg，從酶解液中分離出的一種5肽Ile-Ile-Ala-Glu-Lys，通過動物實驗證明與β-谷甾醇（一種降膽固醇藥物）相比，該肽可以顯著降低小鼠血清膽固醇水平。

κ-CN含量約占牛乳蛋白總量的12%，分子量為19 000 u，由169個氨基酸殘基組成，具有一個磷酸基團和兩個SH鍵。κ-CN很容易被凝乳酶水解，主要斷裂位點在在105位苯丙氨和106位的蛋氨酸。κ-CN的1～105片段可促進人雜交瘤細胞（HB4C5）中免疫球蛋白的產(chǎn)生[42]，106～169區(qū)段為長糖肽鏈，包含多個糖鏈，不同的糖鏈會產(chǎn)生不同的抑制活性肽，在脂多糖（LPS）存在的情況下部分抑制小鼠B淋巴細胞的分化和增殖[43]。

αs2-CN含量約占牛乳蛋白總量的8%～11%，分子量為25 150 u，由207個氨基酸組成，包括10～13個磷酸鹽基團和兩個巰基（SH）鍵，在酪蛋白中磷酸化程度最高[44]。由于蛋白磷酸化程度與礦物螯合親和力之間有直接關系，αs2-CN相比于其它酪蛋白組分，有更高的礦物質螯合能力[45]。牛奶中γ-CN含量非常低，是由β-CN部分降解而產(chǎn)生的。因此，γ-CN的某些生物學特性類似于β-CN[46]。

2 乳蛋白檢測技術

2.1 高效毛細管電泳法

毛細管電泳（capillary electropho resis，CE）也常稱高效毛細管電泳（high performance capillary electro.phoresis，HPCE），是以內徑20～200 μm的柔性毛細管柱作為分離通道、以高壓直流電場為驅動力，對各種小分子、大分子以及細胞等進行高效分離、檢測或微量制備等的有關技術的總稱。毛細管電泳因其靈敏度高、快速、自動化高等優(yōu)點被廣泛用于蛋白的分析[47]。Clément等[48]采用未涂層毛細管對澳大利亞本地和進口的羊乳制品中的乳蛋白的多態(tài)性進行研究，4種主要的酪蛋白成分（αs1-CN、αs2-CN、β-CN、κ-CN）和2種乳清蛋白（α-La、β-Lg）均能很好地分離。但該方法由于進樣量少，毛細管直徑小，因而制備能力差，用一些檢測方法（如紫外吸收光譜法）時，靈敏度較低；且電滲會因樣品組成而變化，進而影響分離重現(xiàn)性。

2.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳法

聚丙烯酰胺凝膠電泳是根據(jù)蛋白分子量亞基的不同而分離蛋白，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大小，電荷因素可以忽視。它有兩種形式：非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（Native-PAGE）及SDS-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）。非變性聚丙烯酰胺凝膠，在電泳的過程中，蛋白質能夠保持完整狀態(tài)，并依據(jù)蛋白質的分子量大小、蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。SDS-PAGE是蛋白分析常用的電泳法，耗時長，重現(xiàn)性較差。不同濃度的膠遷移出不同長度的蛋白條帶，對于聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離膠濃度越大分離蛋白分子量越小。分離膠濃度太大，分子量大的蛋白分不開，分離膠濃度太小，分子量小的蛋白分不開。雖然其它技術的靈敏度高又可靠但實際操作繁瑣，隨身攜帶不方便，在實地檢測時電泳法比較理想[49]。目前可在電泳技術的基礎上進一步提高檢測的靈敏度以及研發(fā)檢測試紙，提高檢測的效率。該技術多用于新型蛋白的初步鑒定和不同蛋白的差異分析，如常用的乳蛋白摻偽分析。宋宏新等[50]運用SDS-PAGE法對5種市售嬰幼兒奶粉進行鑒定，表明該法能較快速準確地表征乳蛋白組成，為乳及乳品質量的監(jiān)控提供了一種直觀有效的手段。

2.3 層析法

層析法是分離蛋白質的通用方法。其原理都是通過蛋白質在流動相和固定相之間的性質不同而達到分離的效果。層析法可分為紙層析法，凝膠過濾層析法，離子交換層析法等。凝膠過濾層析法是最為常用的，在分離蛋白質時只需要把蛋白質混合液加到凝膠柱的上部，并加少許洗脫液來產(chǎn)生一定的液壓使蛋白質能向下運動，在凝膠柱底部用試管接流下來的蛋白質液體。王瑞雪[51]等以駝乳和牛乳的乳清蛋白為原料，經(jīng)胃蛋白酶水解后，超濾后通過葡聚糖凝膠層析（Sephadex G-25脫鹽柱）對其水解物進行分離純化，得到較高純度的抑菌肽。趙玉娟[52]等采用Sepha.dex G-75和DEAE離子交換層析對硫酸銨沉淀法得到的牛乳乳清中的主要成分α-La和β-Lg進行分離純化，所獲得的α-La和β-Lg樣品純度達到85%。此種方法簡單，不需要貴重儀器，但分離的蛋白質不是很好，這些液體仍然是很多蛋白質的混合液，通過紫外吸收來確定目的蛋白的含量的最高值，因此，這種方法只能對蛋白質進行一些粗篩。

2.4 雙向電泳法

雙向電泳（two-dimentionlal gel electrophoresis，2-DE）廣義的定義是將樣品進行電泳后，在其直角方向再進行一次電泳。但是目前雙向電泳大多是指第一向為等電聚焦（載體兩性電解質pH梯度或固相pH梯度），平衡后第二向為SDS電泳。樣品中的蛋白根據(jù)電荷和質量兩次分離后，可利用得到分子的等電點、分子質量等信息。分離的結果不是帶而是點，從左到右是pI的增加，從下到上是分子質量的增加。雙向電泳技術特別是以固定向pH梯度等電聚焦為第一向的雙向電泳技術，是當前分辨率最高，信息量最大的電泳技術。為了可更全面的分析乳蛋白組分，該方法多與其它方法同時使用。Galvani等[53]采用2-DE和MALDI-TOF-MS對市售牛奶粉進行了研究，采用了pH 3～7和pH 4～72種規(guī)格的IPG膠條，分析了9種酪蛋白和一些單磷酸化/多磷酸化修飾的蛋白和糖結合蛋白。Hogarth等[54]采用蛋白質組學技術研究了臨床乳房炎牛乳中蛋白成分的變化，以達到識別乳房炎的診斷標記，采用2-DE分析了乳房炎牛乳的乳清蛋白和健康牛乳的乳清蛋白。

2.5 高效液相色譜法

高效液相色譜法是分析乳蛋白成分的有效方法之一，與其他檢測方法相比具有分辨率和回收率高、操作簡便、重復性好等優(yōu)勢。高效液相色譜法可以高效實現(xiàn)大分子以及復雜物質快速分離，對乳品中蛋白質進行定性定量檢測[55]。目前該方法在乳蛋白分離中的應用最為廣泛，Gerd Bobe等[56]采用C18反相柱研究實現(xiàn)了牛乳中6種主要蛋白的快速分離和定量分析，同時也研究了κ-CN、β-CN和β-lg的遺傳變異體。Bonfatti等[57]用C8反相色譜柱探討了分離和定量分析牛乳主要蛋白的遺傳變異體，除αs1-CNB和αs1-CNC外，其他酪蛋白和乳清蛋白的變異體在40 min內都能很好地分離?？娛绶f等[58]采用高效液相色譜法檢測牛乳中6種主要乳蛋白的多態(tài)性。研究發(fā)現(xiàn)，酪蛋白中αs2-酪蛋白存在A型和B型兩種類型，β-酪蛋白存在A1，A2，B，C和F，5種類型，κ-酪蛋白存在A/E型和B型兩種類型，而αs1-酪蛋白僅有1種，未發(fā)現(xiàn)其多態(tài)性；乳清蛋白中，β-乳球蛋白存在多態(tài)性，有A、B和C 3種類型，但未發(fā)現(xiàn)α-乳白蛋白的多態(tài)性。Bonfatti等[59]采用反相高效液相色譜方法成功地應用于水牛乳的分離和定量分析。所有最常見的水牛酪蛋白和乳清蛋白組分，以及它們的遺傳變異，在40 min內被同時檢測和分離，純化的水牛乳蛋白被用作校準標準。盡管該方法的應用較為成熟，但使用該方法測乳蛋白時也存在一些不足，如流動相的變化，蛋白的擴散或滯留等會導致色譜峰的加寬，柱效降低，使得測定結果不準確，因此液相色譜柱需要及時清洗。

2.6 高效液相色譜串聯(lián)質譜法

該方法利用質譜定量思路的靶向蛋白質組學技術，利用蛋白專屬的肽段序列完成定量分析，通過采用堿性胰蛋白酶為酶切工具，利用其高度專一性，水解精氨酸與賴氨酸羧基端的肽鍵，烷基化與酶解乳蛋白類原料。通過Uniprots數(shù)據(jù)庫的PeptideMass工具分析，乳蛋白通過酶解獲得的多肽產(chǎn)物，從質譜系統(tǒng)的檢測性和穩(wěn)定性上考慮，應選擇特定氨基酸上修飾少，色譜分離過程中無干擾、響應值高，長度6～12個氨基酸的多肽作為目標肽段[60]。在應用高效液相色譜串聯(lián)質譜法檢測多肽時，多肽的響應值受到基質以及參與反應的化學試劑的影響，導致響應信號增加或抑制?；谏鲜鰡栴}，可以選擇同位素特異肽作為內標，在預處理之前加至被測樣品中。同位素特異肽的理化性質與目標多肽完全一致，色譜-質譜行為也一致，能校正由基質效應所帶來的檢測響應值波動。選用同位素標記內標肽段不但能降低基質效應還能校正樣品前處理過程的誤差。

陳柔含等[61]建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜技術定量檢測乳制品中牛乳鐵蛋白含量的方法，實現(xiàn)了乳鐵蛋白及其肽段的鑒定，考察了空白基質匹配的外標法和內標法對乳鐵蛋白檢測結果的差異。采用外標法定量時，平均回收率為93.8%～103.9%。Le等[62]利用液相色譜串聯(lián)質譜法（LC-MS/MS），采用多反應監(jiān)測模式（MRM）從662種丹麥荷斯坦奶牛生牛奶樣品中，同時檢測和測量兩大牛奶目標蛋白質α-La和β-CN。檢測結果顯示，每頭奶牛的α-La和β-CN的質量濃度分別為0.5～1.9 g/L（平均1.1 g/L），7.5～23.4 g/L（平均15 g/L），檢測限（LOD）分別為0.14 g/L和0.16 g/L，重現(xiàn)性＜15%?？偟恼f來，該方法簡便易行、定量準確、精密度好，能滿足乳蛋白類樣品中不同蛋白質含量的檢測要求。

3 結果與展望

本文對乳蛋白的蛋白組成包括乳清蛋白中的α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白、乳過氧化物酶等和酪蛋白中的αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白等的含量、分子量、氨基酸組成特點以及相關肽段位置和具有的功能活性進行了概述。進一步說明乳蛋白中含有不同功能活性的肽段，且功能活性與肽段的氨基酸組成密切相關。此外，對不同乳蛋白的檢測方法包括高效毛細管電泳法、聚丙烯酰胺凝膠電泳法、層析法、雙向電泳法、高效液相色譜法和高效液相色譜串聯(lián)質譜法的分離原理與分離效果進行了總結。表明不同乳蛋白組分的分離可根據(jù)分離條件和要求選擇不同分離方法，其中高效液相色譜串聯(lián)質譜的方法分離乳蛋白，因其簡便、快速、準確性高等的優(yōu)勢，日漸成為常用的分離乳蛋白的方法?？傊榈鞍资桥Ｈ橹械闹匾煞?，在人體的營養(yǎng)健康方面起著至關重要的作用。

隨著人們對乳蛋白需求在不斷增長，保持健康、增強機體免疫力以及促進身體恢復的動力需求等，推動人們對于乳蛋白產(chǎn)品的購買，因此也推動了乳蛋白檢測技術的創(chuàng)新及功能性乳蛋白的開發(fā)。尤其在新冠疫情的影響下，人們對于營養(yǎng)的研究更為重視，其中就包括對于乳蛋白的研究，由于乳蛋白具有的抗癌、抗炎癥、提高免疫力等的功能，因此很有可能在抵抗新冠病毒感染方面起到一定的作用。雖然很多研究已經(jīng)證實乳蛋白及其水解物可以用于保健食品的開發(fā)，但實際產(chǎn)品仍有限，因此進一步開發(fā)乳蛋白為基礎的功能性食品仍具有很大的發(fā)展前景。分離提取技術的單一和乳蛋白及其水解肽高昂的生產(chǎn)成本可能是限制乳蛋白發(fā)展應用的主要原因。隨著研究的深入及乳蛋白分離提取工藝的成熟，乳蛋白及其水解物的生物活性必會被充分開發(fā)與利用，其產(chǎn)品在國內市場也必有廣闊空間。因此，在乳清蛋白和酪蛋白已有的分離分析技術上，繼續(xù)擴大檢測技術的應用，縮短檢測時間，拓展開發(fā)新型功能蛋白、重視其多肽產(chǎn)品開發(fā)以及繼續(xù)深入開展其促進人類健康的機理、機制研究，均是我們未來研究和產(chǎn)業(yè)發(fā)展的方向。