莊文涵 廖雨晗 徐鵬飛 蔡亦斐 葉月芳

炎癥性腸病（IBD）是由環(huán)境因素導(dǎo)致遺傳易感人群免疫系統(tǒng)紊亂和腸道微生態(tài)失調(diào)的慢性非特異性炎性疾病，包括克羅恩?。–D）和潰瘍性結(jié)腸炎（UC）。目前已發(fā)現(xiàn)超過(guò)150個(gè)基因位點(diǎn)與CD發(fā)病相關(guān)，富亮氨酸重復(fù)序列激酶2（LRRK2）是相關(guān)基因之一?；蛐头治霰砻?，LRRK2基因是CD和帕金森?。≒D）的共同易感基因。目前關(guān)于LRRK2與CD發(fā)病關(guān)系的研究較少，本文綜述了近年來(lái)關(guān)于LRRK2在CD發(fā)病中作用的研究進(jìn)展，以期為進(jìn)一步探究CD的發(fā)病機(jī)制及選擇診療方案提供新思路。

1 LRRK2的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

人類(lèi)LRRK2基因由51個(gè)外顯子組成，其定位于染色體12q12上，可編碼由2 527個(gè)氨基酸組成的多結(jié)構(gòu)域蛋白——LRRK2蛋白[1-2]。LRRK2多定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)中的高爾基體、突觸小泡、溶酶體和線粒體外膜等膜相結(jié)構(gòu)上[3]；其表達(dá)廣泛，存在于多種人體組織中，如腦、脾臟、胸腺和腸道等[4]；在細(xì)胞水平，LRRK2主要在小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和B細(xì)胞中表達(dá)[5]。LRRK2在細(xì)胞質(zhì)中的主要存在形式是單體，而在膜相結(jié)構(gòu)中則主要為二聚體；由于LRRK2二聚體的激酶活性比單體更強(qiáng)，故與細(xì)胞質(zhì)LRRK2相比，膜LRRK2的激酶活性更強(qiáng)[1-2]。

LRRK2蛋白包含ARM重復(fù)序列、錨蛋白重復(fù)序列（ANK）、富含亮氨酸重復(fù)序列區(qū)（LRR）、Ras蛋白復(fù)合體（ROC）、Ras蛋白C-末端重復(fù)序列（COR）、激酶結(jié)構(gòu)域（MAPKKK）和色氨酸天冬氨酸重復(fù)序列區(qū)（WD40）這7個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中ANK、LRR和WD40這3個(gè)支架結(jié)構(gòu)域參與了與其他蛋白的相互作用，可維持蛋白質(zhì)的構(gòu)象和穩(wěn)定性[6]，ROC結(jié)構(gòu)域和MAPKKK結(jié)構(gòu)域則分別與LRRK2的GTP酶活性和激酶活性相關(guān)，而ARM重復(fù)序列和COR結(jié)構(gòu)域的功能尚未明確，ROC結(jié)構(gòu)域中Y1699C和R1628P位點(diǎn)的突變分別與PD及麻風(fēng)病相關(guān)[1-2]。LRRK2的病理、生理學(xué)研究表明，LRRK2的結(jié)構(gòu)域與其多種細(xì)胞功能顯著相關(guān)[7-8]，這提示LRRK2是一種作用廣泛的樞紐蛋白[9]。

2 LRRK2參與CD發(fā)病的機(jī)制

2.1 LRRK2缺陷導(dǎo)致溶菌酶異常

潘氏細(xì)胞（PC）中的Toll樣受體在直接感知腸道細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物后，可激活并促進(jìn)PC內(nèi)抗菌顆粒如溶菌酶的形成和分泌。PC分泌的核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域蛋白2（NOD2）可通過(guò)檢測(cè)共生菌的細(xì)胞壁酰二肽來(lái)感知共生菌群的存在，而共生菌群來(lái)源的信號(hào)可觸發(fā)NOD2與受體相互作用蛋白2（RIP2）結(jié)合，并將LRRK2和Rab2a募集到包含溶菌酶的致密核心囊泡（DCV）上，以調(diào)控溶菌酶在DCV中的分揀[3,10]。在這一過(guò)程中，一方面LRRK2可通過(guò)調(diào)控溶菌酶影響腸道微生物的組成[11]；另一方面，共生菌群通過(guò)NOD2-LRRK2-Rab2a軸，既可在PC中引導(dǎo)溶菌酶分揀，也可促進(jìn)共生菌群與機(jī)體的共生[10]。

細(xì)胞生命活動(dòng)依賴(lài)于細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸系統(tǒng)的精確傳遞和定向運(yùn)輸分泌，若囊泡運(yùn)輸系統(tǒng)的調(diào)控異常，則細(xì)胞的正常生命活動(dòng)將受到影響。有研究發(fā)現(xiàn)，CD患者體內(nèi)存在以含有溶菌酶的DCV數(shù)量減少為特征的PC囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)異常現(xiàn)象[12]。另有研究在LRRK2－/－小鼠體內(nèi)也觀察到了類(lèi)似現(xiàn)象，雖然LRRK2－/－小鼠PC中的溶菌酶mRNA表達(dá)水平正常，但由于溶菌酶都被細(xì)胞內(nèi)的溶酶體降解，故其腸腔中也存在溶菌酶缺乏的情況；然而，PC內(nèi)其他抗菌物質(zhì)如防御素及胰島再生源蛋白Ⅲγ（RegⅢγ）均不受LRRK2敲除的影響，這表明LRRK2在PC中可特異性調(diào)控溶菌酶的運(yùn)輸和分泌[3]。

由此可見(jiàn)，LRRK2缺陷會(huì)顯著影響NOD2-LRRK2-Rab2a軸的功能，這不僅會(huì)使處于成熟過(guò)程中的DCV出現(xiàn)缺陷，影響溶菌酶的分揀，嚴(yán)重時(shí)還可導(dǎo)致溶菌酶異常甚至消失，以致于無(wú)法抵御病原體入侵，使機(jī)體更易受腸內(nèi)外細(xì)菌感染，從而誘發(fā) CD[3]。

2.2 LRRK2突變導(dǎo)致LRRK2蛋白的激酶活性異常

LRRK2蛋白的激酶活性和空間分布是由其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域之間的相互作用（包括自磷酸化、蛋白單體/二聚體循環(huán)、上游激酶和GTP酶的調(diào)節(jié)等）所調(diào)控的[13-14]。雖然在上述過(guò)程中，幾乎所有的LRRK2結(jié)構(gòu)域均能夠調(diào)節(jié)激酶活性，但是只有MAPKKK結(jié)構(gòu)域才是調(diào)節(jié)LRRK2蛋白的激酶活性的關(guān)鍵[15]。MAPKKK結(jié)構(gòu)域功能獲得性突變，可能導(dǎo)致LRRK2蛋白的激酶活性發(fā)生改變。例如LRRK2 N551K和LRRK2 R1398H突變不會(huì)改變LRRK2蛋白的激酶活性，而LRRK2 G2019S和LRRK2 N2081D突變可增強(qiáng)LRRK2蛋白的激酶活性[16-17]。關(guān)于PD的研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)引起PD發(fā)病的LRRK2突變位點(diǎn)位于MAPKKK結(jié)構(gòu)域（LRRK2 G2019S）和ROC結(jié)構(gòu)域（LRRK2 R1441C），這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域的突變可分別使LRRK2蛋白的激酶活性增強(qiáng)和使ROC結(jié)構(gòu)域更易與GTP結(jié)合，從而促進(jìn)神經(jīng)變性，導(dǎo)致PD發(fā)病[17]。

由于LRRK2是CD和PD共同的易感基因，而且CD相關(guān)突變位點(diǎn)LRRK2 N2081D和PD相關(guān)突變位點(diǎn)LRRK2 G2019S均位于MAPKKK結(jié)構(gòu)域，兩者突變均可顯著上調(diào)LRRK2蛋白的激酶活性，由此推測(cè)LRRK2基因突變引起LRRK2蛋白的激酶活性發(fā)生改變后，可能通過(guò)與引發(fā)PD的相似致病通路誘導(dǎo)CD發(fā)病。

2.3 LRRK2突變導(dǎo)致活性氧過(guò)量生成

在真核生物體內(nèi)，線粒體主要通過(guò)氧化磷酸化使電子在氧化呼吸鏈上傳遞并產(chǎn)生H+梯度，最終生成ATP，在此過(guò)程中一旦發(fā)生電子泄漏或電子傳遞鏈?zhǔn)軗p，便可能導(dǎo)致活性氧（ROS）形成[18-19]，其中H2O2是引起IBD腸道損傷的主要ROS[18,20-21]。

研究發(fā)現(xiàn)，酵母中的LRRK2可以通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體功能和酵母的內(nèi)吞作用在氧化應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用[22]。由于多數(shù)LRRK2突變位點(diǎn)位于GTP酶和MAPKKK結(jié)構(gòu)域等蛋白質(zhì)催化核心結(jié)構(gòu)域，所以LRRK2突變可通過(guò)改變酶活性從而導(dǎo)致線粒體融合-分裂失衡、線粒體自噬能力減弱、線粒體DNA損傷，進(jìn)一步抑制過(guò)氧化物酶的活性，促進(jìn)ROS生成并增高機(jī)體對(duì)H2O2的易感性[23-24]。也有研究表明，LRRK2 G2019S突變可通過(guò)打開(kāi)線粒體內(nèi)膜上的通透性孔，上調(diào)孔道形成蛋白的表達(dá)，上調(diào)解偶聯(lián)蛋白2（UCP2）和UCP4的表達(dá)等方式，以增高線粒體內(nèi)膜對(duì)質(zhì)子的通透性，進(jìn)而產(chǎn)生ROS[25]。

隨著ROS水平的升高，組蛋白去乙?；傅幕钚员灰种?，從而增強(qiáng)乙?；せ頝F-κB，導(dǎo)致由葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型出現(xiàn)腸上皮細(xì)胞凋亡[26]。另有研究發(fā)現(xiàn)，ROS水平升高還會(huì)導(dǎo)致機(jī)體腸道干細(xì)胞增殖和異型增生的現(xiàn)象[27]。此外，ROS還在多種細(xì)胞因子受體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)ROS在磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信號(hào)通路中通過(guò)激活PI3K和Akt，使Akt與NF-κB抑制劑激酶α（IKKα）、一氧化氮合成酶（iNOS）、結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合物1/2（TSC1/2）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）、糖原合酶激酶 3β（GSK3β）等信號(hào)分子結(jié)合，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞異常增殖、遷移和炎性反應(yīng)，從而誘導(dǎo)CD的發(fā)生和發(fā)展[28]。綜上所述，由LRRK2基因突變所導(dǎo)致的ROS過(guò)量生成也在CD發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。

2.4 LRRK2異常導(dǎo)致自噬缺陷

自噬是一種細(xì)胞質(zhì)成分在溶酶體中降解的細(xì)胞內(nèi)過(guò)程，可消除機(jī)體中不需要或受損的物質(zhì)，參與調(diào)節(jié)組織的發(fā)育、分化，以維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，還可在固有免疫和適應(yīng)性免疫中發(fā)揮抵御病原體入侵的作用[29]。LRRK2參與了由NOD2介導(dǎo)的包含自噬過(guò)程在內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在其與一種名為微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）的自噬蛋白共定位后，可磷酸化銜接蛋白p62，從而發(fā)揮維持自噬平衡的作用[11]。因此無(wú)論是LRRK2基因過(guò)表達(dá)、敲除還是抑制LRRK2蛋白活性，均可誘導(dǎo)自噬-溶酶體途徑發(fā)生改變，影響自噬平衡[30-31]。

有研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖（LPS）刺激巨噬細(xì)胞RAW264.7后，LRRK2可轉(zhuǎn)位至自噬體膜上[32]。而當(dāng)小鼠LRRK2基因被敲除后，LRRK2便無(wú)法轉(zhuǎn)位至自噬體膜上，并且小鼠體內(nèi)的次級(jí)溶酶體和自噬溶酶體樣結(jié)構(gòu)增大、數(shù)量增加[33]。這些物質(zhì)的異常累積表明小鼠體內(nèi)自噬-溶酶體清除系統(tǒng)受損，而且這會(huì)使得即使在正常時(shí)LRRK2表達(dá)水平較高的外周組織中也出現(xiàn)自噬缺陷，進(jìn)而影響LRRK2維持自噬平衡的功能[34]。另有研究發(fā)現(xiàn)，LRRK2蛋白的激酶活性受到關(guān)鍵殘基（主要是Ser1292和Ser935）磷酸化調(diào)控后，可影響其下游底物Rab10的磷酸化，進(jìn)而發(fā)揮LRRK2調(diào)節(jié)Rab蛋白穩(wěn)態(tài)的作用[15]。一旦致病性LRRK2基因（如LRRK2G2019S和LRRK2N2081D）發(fā)生突變，便可上調(diào)Rab10的磷酸化水平，使得細(xì)胞膜Rab蛋白分布異常，從而抑制自噬過(guò)程[17,35]。但有研究表明，膜相關(guān)LRRK2本身也可導(dǎo)致自噬級(jí)聯(lián)反應(yīng)的關(guān)鍵啟動(dòng)因子Beclin-1磷酸化或K48泛素化進(jìn)而失活，從而導(dǎo)致自噬抑制[36]。由此可見(jiàn)，LRRK2基因的敲除、突變及膜相關(guān)LRRK2本身均可導(dǎo)致自噬功能受損，故調(diào)節(jié)LRRK2在維持自噬穩(wěn)態(tài)方面具有重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，自噬可通過(guò)控制宿主與細(xì)菌之間的關(guān)系在維持腸上皮穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[37]。自噬受損的腸上皮細(xì)胞會(huì)在富含TNF-α的環(huán)境中失去黏附能力，并導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞損傷[38]。此外，自噬缺陷還可導(dǎo)致功能失調(diào)的線粒體生成，從而致使ROS生成增多，這不僅可以抑制腸道干細(xì)胞分化和上皮細(xì)胞再生，還可促進(jìn)炎性小體NOD樣受體蛋白3（NLRP3）的激活，促進(jìn)IL-18和IL-1B的生成，加速ROS所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡[39]。另一項(xiàng)關(guān)于腸道纖維化的小鼠模型研究也發(fā)現(xiàn)，自噬刺激可預(yù)防腸道纖維化，而自噬抑制則可以加重腸道纖維化；由于腸上皮細(xì)胞損傷是CD的典型特征，腸道纖維化是CD的常見(jiàn)并發(fā)癥，故可以認(rèn)為由LRRK2異常所導(dǎo)致的自噬功能受損對(duì)于CD發(fā)病起著重要作用[40]。

2.5 LRRK2異常導(dǎo)致炎性細(xì)胞因子釋放異常

CD患者的腸道多存在固有免疫顯著失調(diào)。在 CD 的發(fā)病過(guò)程中，干擾素-γ（IFN-γ）、IFN-β、TNF-α和IL-6等細(xì)胞因子可誘導(dǎo)并上調(diào)LRRK2表達(dá)[5,41-42]。另有研究發(fā)現(xiàn)，LRRK2參與固有免疫中炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和巨噬細(xì)胞趨化等過(guò)程[43-44]；LRRK2突變可在CD14+單核細(xì)胞中發(fā)揮調(diào)節(jié)固有免疫應(yīng)答的作用[45-46]。因此，LRRK2表達(dá)異常可能可以加劇固有免疫失調(diào)，進(jìn)而損傷組織[6]。

NOD（1/2）/RIP2信號(hào)通路是當(dāng)機(jī)體應(yīng)對(duì)細(xì)菌感染和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等情況時(shí)發(fā)生固有免疫應(yīng)答的重要信號(hào)通路；LRRK2可通過(guò)促進(jìn)Ser176位點(diǎn)上的RIP2磷酸化來(lái)增強(qiáng)RIP2活性，進(jìn)而增強(qiáng)NOD（1/2）/RIP2信號(hào)，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的誘導(dǎo)作用[47]。由于LRRK2過(guò)表達(dá)可激活小鼠固有層樹(shù)突狀細(xì)胞中NF-κB并促進(jìn)炎性細(xì)胞因子分泌[12]，因此在DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中，LRRK2過(guò)表達(dá)組表現(xiàn)出比對(duì)照組（野生型小鼠）更嚴(yán)重的結(jié)腸炎癥狀[36]。而使用LRRK2抑制劑后，則可通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)的LRRK2蛋白的激酶活性，減少LPS誘導(dǎo)的TNF受體相關(guān)因子6（TRAF6）與LRRK2相互作用，以及抑制MAPK和NF-κB抑制蛋白α（IkBα）磷酸化，從而減少CD患者樹(shù)突狀細(xì)胞中炎性細(xì)胞因子TNF-α的產(chǎn)生，起到抗炎作用，進(jìn)而改善DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥狀[48]。此外，在對(duì)巨噬細(xì)胞的研究中也發(fā)現(xiàn)了類(lèi)似現(xiàn)象，即當(dāng)胞壁酰二肽激活NOD2、γ-D-谷氨酸-內(nèi)消旋-二氨基庚二酸（iE-DAP）激活NOD1或內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，LRRK2缺陷可以顯著抑制巨噬細(xì)胞分泌炎性細(xì)胞因子[47]。由此可見(jiàn)，LRRK2可正向調(diào)節(jié)炎性細(xì)胞因子的分泌[39]。

然而，也有研究發(fā)現(xiàn)LRRK2具有相反的調(diào)節(jié)效應(yīng)，活化T細(xì)胞核因子（NFAT）是免疫應(yīng)答中的重要介質(zhì)[49]，而LRRK2是NFAT抑制因子NRON復(fù)合體的主要組成部分。正常情況下，LRRK2可在細(xì)胞質(zhì)中形成NRON復(fù)合物捕獲NFAT，從而將NFAT隔離在細(xì)胞質(zhì)中[50]。但在 LRRK2－/－小鼠的細(xì)胞質(zhì)中，LRRK2缺乏會(huì)使NFAT在細(xì)胞質(zhì)中隔離失敗，進(jìn)而使其向細(xì)胞核移位并誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄[51-52]，增加炎性細(xì)胞因子數(shù)量，提高對(duì)DSS誘發(fā)結(jié)腸炎的易感性并加重結(jié)腸炎癥狀[50,53]。這表明LRRK2也可通過(guò)將NFAT隔離在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮負(fù)向調(diào)控炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子分泌的作用[2]。

綜上所述，由于LRRK2基因無(wú)論是過(guò)表達(dá)還是敲除均可通過(guò)不同的通路調(diào)控炎性細(xì)胞因子的分泌，進(jìn)而提高機(jī)體對(duì)CD的易感性，故調(diào)節(jié)LRRK2的表達(dá)對(duì)于防治結(jié)腸炎具有重要的意義[54]。

3 總結(jié)與展望

LRRK2的異常改變（如LRRK2基因過(guò)表達(dá)、敲除、突變或LRRK2蛋白活性受到抑制）可通過(guò)影響PC內(nèi)溶菌酶的分泌、LRRK2蛋白的激酶活性、ROS的釋放、自噬過(guò)程及炎性細(xì)胞因子的釋放等導(dǎo)致CD發(fā)病。LRRK2在CD病程中所起的作用是復(fù)雜且廣泛的，雖然其在一定程度上可以為CD的診斷和治療提供依據(jù)，但是由于在LRRK2異常的CD患者中，LRRK2的致病機(jī)制可能存在個(gè)體間差異，而且各機(jī)制之間存在高度相關(guān)性，因此對(duì)CD患者開(kāi)展靶向LRRK2單一致病機(jī)制的治療的效果并不顯著。考慮到CD發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，LRRK2調(diào)節(jié)劑與常規(guī)藥物的聯(lián)合治療方案可能可以更好地控制CD病情。為了進(jìn)一步優(yōu)化治療方案，開(kāi)發(fā)特異度和安全性較高、療效較顯著的調(diào)節(jié)劑，可在目前已取得的LRRK2相關(guān)研究成果的基礎(chǔ)上，繼續(xù)深入探索LRRK2的發(fā)病機(jī)制。