焦顯芹，金 鉞，劉紅英

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046）

針對(duì)目前本科實(shí)驗(yàn)教學(xué)中實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)不足、實(shí)驗(yàn)課時(shí)偏少的情況下，提高實(shí)驗(yàn)教學(xué)質(zhì)量，需要不斷更新實(shí)驗(yàn)內(nèi)容，創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)方法，培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新思維和創(chuàng)新能力。近幾年新型冠狀病毒的持續(xù)傳播，新冠病毒核酸檢測(cè)已成日常。PCR對(duì)新冠病毒的檢測(cè)發(fā)揮著重大作用，緊跟時(shí)代發(fā)展需求，為學(xué)生快速熟悉和掌握先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)創(chuàng)造條件。對(duì)本科生龐大的群體而言，采用市售試劑盒提取細(xì)菌基因組DNA 做模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增是一筆不小的實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)開支。在有限實(shí)驗(yàn)課時(shí)、有限實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)的情況下，創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)方法不僅可以解決目前實(shí)驗(yàn)教學(xué)中存在的不足，也能啟發(fā)學(xué)生創(chuàng)新性解決問題，鍛煉學(xué)生的創(chuàng)新思維和創(chuàng)新能力。

目前細(xì)菌性感染仍是養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的重要因素，隨著集約化畜牧業(yè)的發(fā)展，細(xì)菌性感染引起的疾病也越來越復(fù)雜，臨床上對(duì)細(xì)菌性疾病的不恰當(dāng)治療及抗生素的濫用是耐藥菌產(chǎn)生與耐藥基因快速傳播的主要原因［1］，動(dòng)物源耐藥細(xì)菌的日趨嚴(yán)重，細(xì)菌感染甚至成為養(yǎng)殖業(yè)中的一個(gè)頑癥，每年給養(yǎng)殖行業(yè)造成巨大損失［2］。目前抗生素對(duì)癥治療仍是控制細(xì)菌性感染的重要途徑。篩選感染性細(xì)菌的敏感藥物對(duì)控制和治療疾病起至關(guān)重要的作用，細(xì)菌的鑒別診斷是對(duì)癥治療的基礎(chǔ)，細(xì)菌培養(yǎng)純化、形態(tài)學(xué)、組織學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的檢測(cè)是確定病原菌種類的常用方法，但都有一定的缺陷和不足。隨著生物技術(shù)的迅猛發(fā)展，從分子水平對(duì)病原菌進(jìn)行基因診斷，已發(fā)展為感染性疾病診斷的主要方式［3］，其中PCR技術(shù)為獸醫(yī)臨床快速、準(zhǔn)確、高效的診斷提供了技術(shù)手段［4］。

生產(chǎn)實(shí)踐所需和培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新能力目標(biāo)的高度契合，探索用菌液經(jīng)過簡(jiǎn)單處理直接作為PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目是切實(shí)可行的方法。

核糖體上的16S rRNA的保守區(qū)基因片段在各種細(xì)菌中具有種屬的高度保守性,可變區(qū)在遺傳上具有靈活的變異性，保守區(qū)和可變區(qū)交叉排列，16S rRNA序列分析是細(xì)菌分類、基因鑒定的主要靶序列［5-7］用過夜培養(yǎng)的菌液為模板，采用16S rRNA 通用引物PCR 16S rRNA 基因，瓊脂糖凝膠檢測(cè)顯示革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌PCR擴(kuò)增結(jié)果均不理想。革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的成分、厚薄及堅(jiān)固程度是影響試驗(yàn)結(jié)果的主要因素［8］。經(jīng)過試驗(yàn)探索，將細(xì)菌經(jīng)過不同處理，采用處理過的菌液做模板，PCR 16S rRNA基因，瓊脂糖凝膠電泳均能獲得大小約1500 bp的清晰條帶。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)用細(xì)菌

動(dòng)物源大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌由微生物教研室保存的菌種提供。

1.2 菌種的復(fù)蘇培養(yǎng)（見圖1）

圖1 編號(hào)1-4 分別為沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌

將4 種菌分別接種到普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)16～18 h；再分別將沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌接種到SS 瓊脂平板、麥康凱瓊脂平板、Baird-Parker 瓊脂平板和甘露醇卵黃多粘菌素瓊脂平板培養(yǎng)基上，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)16～18 h；挑取單個(gè)菌落革蘭氏染色進(jìn)行鏡檢；確保菌種的純化無污染。

1.3 菌液處理方式

1.3.1 菌液未做任何處理

將1.2肉湯培養(yǎng)過夜復(fù)蘇后的菌液做PCR模板，采用16S rRNA的通用引物：

27F：5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3＇;

1492R：5＇-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3＇

PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系和參數(shù)見表1、表2。

表1 PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系（30ul）

表2 PCR擴(kuò)增參數(shù)

取10 μl 擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，150V 恒壓，電泳25 min，凝膠成像系統(tǒng)下觀察PCR 擴(kuò)增結(jié)果。

1.3.2 菌液煮沸處理

吸取上述1.2 中4 種隔夜培養(yǎng)的菌液各300 μl 于4 個(gè)EP 管中，EP 管蓋用針頭扎幾個(gè)小孔，外用保鮮膜包裹后放沸水中煮10 min，然后再快速冰浴2 min，待室溫后做PCR擴(kuò)增模板，按1.3.1反應(yīng)體系和參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.3.3 菌液用丙酮處理

取上述1.2過夜培養(yǎng)的4種菌液分別加入4個(gè)離心管中，10 000 r/min，離心2 min，棄上清，沉淀中加入300 μl ddH2O，再分別加入300 μl丙酮溶液，混勻，EP管蓋扎孔，保鮮膜封口，再沸水浴10 min，后放冰浴2 min，10 000 r/min，離心2 min，留上清做PCR 模板，最后按1.3.1 反應(yīng)體系和參數(shù)PCR擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳、凝膠成像觀察結(jié)果。

1.3.4 菌液超聲破碎處理

取上述1.2 過夜培養(yǎng)的4 種菌液分別加入離心管離心，后用PBS洗滌3次，再按原菌液體積的1/6加入裂解液重懸菌體，最后按1.3.1的體系和參數(shù)PCR擴(kuò)增、電泳。

2 結(jié)果與分析

2.1 結(jié)果

菌液未做處理、菌液煮沸、丙酮處理、菌液超聲破碎處理后分別做PCR 模板，凝膠檢測(cè)結(jié)果分別如圖2、圖3、圖4、圖5。

圖2 原菌液16S rRNA 基因PCR 電泳結(jié)果

圖3 沸水浴處理后16S rRNA 基因PCR 電泳結(jié)果

圖4 丙酮處理后16S rRNA 基因PCR 結(jié)果

圖5 超聲破碎后16S rRNA 基因PCR 結(jié)果

2.2 分析

由圖2 可知，將未經(jīng)處理的菌液做模板PCR 擴(kuò)增，沙門氏菌、大腸桿菌有較淺不清晰的條帶，金黃色葡萄球菌和芽孢桿菌沒有任何條帶出現(xiàn)。分析認(rèn)為，沙門氏菌和大腸桿菌屬于革蘭氏陰性菌，細(xì)胞壁相對(duì)較薄，PCR擴(kuò)增預(yù)變性10 min，細(xì)菌的細(xì)胞壁可能部分被破壞，結(jié)果出現(xiàn)了微弱不清晰的條帶，而金黃色葡萄球菌和芽孢桿菌屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，細(xì)胞壁相對(duì)較厚，即使PCR預(yù)變性10 min，也不足以破壞細(xì)胞壁使DNA釋放出來，PCR擴(kuò)增無結(jié)果。

由圖3可以看出，菌液煮沸10 min，冰浴2 min后，沙門氏菌和大腸桿菌均出現(xiàn)了較清晰的條帶，說明PCR 擴(kuò)增16S rRNA 成功，金黃色葡萄球菌和芽孢桿菌PCR 沒有結(jié)果，分析認(rèn)為，金黃色葡萄球菌和芽孢桿菌即使煮沸細(xì)胞壁也很難被破壞，核糖體內(nèi)的DNA釋放不出來，故擴(kuò)增不成功。

圖4 顯示，4 種菌經(jīng)處理后的電泳結(jié)果均出現(xiàn)大小約1 500 bp 明亮清晰的條帶，表明經(jīng)丙酮和沸水處理后，革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁均能被破碎，4種細(xì)菌PCR擴(kuò)增成功。

圖5表明，4種菌液經(jīng)超聲破碎后也均出現(xiàn)了約1500 bp清晰的條帶，說明菌液經(jīng)過超聲破碎后16S rRNA PCR也得到了理想的結(jié)果。

3 討論

細(xì)菌的檢驗(yàn)和鑒定主要依據(jù)細(xì)菌的形態(tài)特征、生化反應(yīng)和免疫學(xué)檢測(cè),這些方法都需要對(duì)細(xì)菌進(jìn)行復(fù)雜的培養(yǎng)，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，某些細(xì)菌也常常得不到理想結(jié)果。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的廣泛應(yīng)用,PCR 技術(shù)因其快速、敏感和特異性等優(yōu)點(diǎn)迅速在微生物檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［9］。

細(xì)菌根據(jù)革蘭氏染色分為革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽(yáng)性菌，革蘭氏陽(yáng)性菌（G+）細(xì)胞壁含大量的肽聚糖，獨(dú)含磷壁酸，不含脂多糖，細(xì)胞壁較厚；革蘭氏陰性菌（G-）含極少肽聚糖，獨(dú)含脂多糖，不含磷壁酸，細(xì)胞壁較薄。由于兩種菌的成分和結(jié)構(gòu)不同，使得革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的堅(jiān)固程度不同，革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁更難以被破壞［10］。

丙酮是一種極性很強(qiáng)的有機(jī)溶劑，能以任意比例與水混溶，被廣泛用于多種化合物的分離、沉淀，特別是對(duì)于膜上與脂質(zhì)結(jié)合的脂蛋白或膜內(nèi)脂蛋白的分離有著重要的作用。由于丙酮在破菌過程中溶解了菌體細(xì)胞壁磷脂內(nèi)大量的脂類化合物，特別是含脂較多的菌種，所以丙酮脫脂及破菌效果比較徹底［11］。

通過煮沸、加入丙酮試劑、超聲破碎等手段破壞細(xì)菌堅(jiān)固的細(xì)胞壁，使細(xì)胞內(nèi)的核酸釋放，16S rRNA PCR擴(kuò)增結(jié)果達(dá)到預(yù)期目的。從經(jīng)濟(jì)、耗費(fèi)時(shí)間和需要的儀器設(shè)備等方面對(duì)上述處理方法進(jìn)行比較，丙酮和煮沸相結(jié)合的處理方式對(duì)本科實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目開展提供了較好方案。

4 結(jié)語

高校作為培養(yǎng)創(chuàng)新人才的重要陣地，培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新精神，就是要營(yíng)造尊重創(chuàng)新、注重創(chuàng)新的良好氛圍，激發(fā)學(xué)生創(chuàng)新欲望，培養(yǎng)學(xué)生創(chuàng)新意識(shí)。在實(shí)踐教學(xué)過程中，應(yīng)立足于學(xué)生的創(chuàng)新能力、綜合素質(zhì)和實(shí)踐能力的培養(yǎng)，拓寬學(xué)習(xí)渠道，在實(shí)驗(yàn)課之余為學(xué)生提供更多的實(shí)踐學(xué)習(xí)平臺(tái)，以增加學(xué)生發(fā)揮主觀能動(dòng)性的機(jī)會(huì)，開放一些實(shí)驗(yàn)室或研究室開展一些探索性試驗(yàn)［12］，有利于調(diào)動(dòng)學(xué)生的積極性、主動(dòng)性和創(chuàng)造性。在進(jìn)行課堂內(nèi)實(shí)驗(yàn)教學(xué)改革的同時(shí),應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)課堂外學(xué)生實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新能力的培養(yǎng)。

由于本科實(shí)驗(yàn)受實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)、實(shí)驗(yàn)課時(shí)、實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備的限制，開展一些高質(zhì)量實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目存在一定的困難，所以需要采用創(chuàng)新性的實(shí)驗(yàn)技術(shù)手段，為學(xué)生提供更多的鍛煉機(jī)會(huì)。