徐廣賢

（廣東醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院/廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點實驗室，廣東東莞 523808）

CAR-T 細胞治療概念最初于1989 年提出，是一種過繼性細胞治療方法。CAR-T 細胞療法是在體外利用基因工程的方法修飾患者外周血T細胞，賦予T 細胞靶向識別腫瘤細胞表面抗原的特性，經(jīng)體外擴增培養(yǎng)后回輸?shù)交颊唧w內(nèi)進行治療腫瘤的方法。CAR-T 細胞療法已廣泛應(yīng)用于臨床惡性血液腫瘤領(lǐng)域，但是仍舊存在諸多不足且面臨極大挑戰(zhàn)。本文總結(jié)了CAR-T 細胞治療在腫瘤免疫治療中的最新研究進展，同時歸納了可能的解決方案，以期為CAR-T 細胞治療適用性提供理論基礎(chǔ)。

1 CAR結(jié)構(gòu)演變

CAR 結(jié)構(gòu)自提出至今，經(jīng)歷了四代CAR 結(jié)構(gòu)的演變與優(yōu)化，具有不同的優(yōu)缺點。第一代CAR 是以TCR結(jié)構(gòu)和抗體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)進行模擬改造，僅包含負(fù)責(zé)識別腫瘤細胞的胞外抗原識別區(qū)、跨膜區(qū)和CD3ζ信號傳遞區(qū)。第一代CAR 設(shè)計是將三硝基苯基（Trinitrophenyl，TNP）抗體的可變區(qū)同TCR 恒定區(qū)相融合表達，轉(zhuǎn)導(dǎo)T 細胞后此種結(jié)構(gòu)可穩(wěn)定表達于T 細胞表面，以MHC 非限制性識別殺傷靶細胞并分泌IL-2[1-2]。盡管第一代CAR-T 細胞在體外具有腫瘤殺傷優(yōu)勢，但在臨床實驗中CAR-T 細胞擴增能力及體內(nèi)持續(xù)時間有限，無法完全清除腫瘤細胞，導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)[3]。第二代CAR 借鑒了T 細胞活化經(jīng)典信號，在第一代CAR 結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上增加1 個共刺激分子，如4-1BB（又稱CD137）或CD28，可使CAR-T 細胞活化水平，增殖能力得到顯著提升，臨床數(shù)據(jù)表明接受第二代CAR-T 細胞治療的患者腫瘤負(fù)荷得到長期有效控制[4-5]。目前，新發(fā)現(xiàn)的共刺激分子包括可誘導(dǎo)共刺激分子（Inducible Costimulatory Molecule,ICOS）、OX40（又稱CD134）和CD40 等，第二代CAR 結(jié)構(gòu)也是臨床上應(yīng)用最為成熟的結(jié)構(gòu)[6-9]。第三代CAR 是在第二代CAR結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上增加1個共刺激分子，即同一CAR結(jié)構(gòu)中共表達2個共刺激分子。第三代CART細胞與第二代CAR-T細胞相比，其細胞毒性進一步提升，Cappell等[10]的研究結(jié)果表明4-1BB 與CD28 共表達的CAR-T 細胞增殖及細胞因子釋放水平，均優(yōu)于僅含單個共刺激分子的CAR-T 細胞；同時，Guedan等[6,11]構(gòu)建的ICOS-BBz CAR-T 細胞表現(xiàn)出更長效的體內(nèi)持續(xù)時間。第四代CAR 又稱通用細胞因子介導(dǎo)殺傷的T 細胞（T cells redirected for universal cytokine killing,TRUCK T），是在第二代或第三代CAR基礎(chǔ)上共表達一些其他分子，這些分子包括促進T 細胞增殖的IL-7、IL-15 和IL-21[12-15]，或提升T 細胞效應(yīng)能力的IL-12 和IL-18 等[16-18]，或趨化其他免疫細胞或CAR-T 細胞至腫瘤細胞周圍的C-C 基序趨化因子19（C-C motif chemokine 19,CCL-19）和CCL-21等[19]。

2 CAR-T細胞治療臨床研究進展

自2017 年FDA 批準(zhǔn)諾華與吉利德的CAR-T 細胞療法產(chǎn)品上市起，目前全球已有Kymirah、Yescarta、Tecartus、Breyanzi、Abecma、Relma-cel和Carvykti 共7款產(chǎn)品獲批，應(yīng)用于惡性血液腫瘤的治療，如B 細胞急性淋巴細胞白血?。˙ cell acute lymphoblastic leukemia,B-ALL）、復(fù)發(fā)或難治性大B 細胞淋巴瘤（Relapsed or refractory large B-cell lymphoma,LBCL）、復(fù)發(fā)或難治性濾泡性淋巴瘤成人患者（Relapsed or refractory follicular lymphoma in adults，F(xiàn)L）、復(fù)發(fā)或難治性套細胞淋巴瘤成人患者（Relapsed or refractory mantle cell lymphoma in adults,MCL）和復(fù)發(fā)或難治性多發(fā)性骨髓瘤（Recurrent or refractory multiple myeloma,MM）[20-25]。Kymirah 是一種靶 向CD19 的CAR-T細胞免疫療法，該CAR結(jié)構(gòu)包含識別CD19的單鏈抗體（Single chain antibody fragment,ScFv）、4-1BB 和CD3ζ 的細胞內(nèi)信號結(jié)構(gòu)域，其治療濾泡性淋巴瘤完全緩解率為69.1%（95%CI58.8%～78.3%），總緩解率為86.2%（95%CI77.5%～92.4%）[26]。Yescarta 也是一款靶向CD19 的CAR-T 細胞免疫療法產(chǎn)品，在治療大B 細胞淋巴瘤時，83%的患者出現(xiàn)緩解，而標(biāo)準(zhǔn)治療組（接受2～3 輪化學(xué)免疫治療，然后對化學(xué)免疫治療有反應(yīng)的患者進行大劑量化療和自體干細胞移植）僅50%緩解；Yescarta 組和標(biāo)準(zhǔn)治療組的完全緩解率分別為65%和32%；2 年總生存率分別為61%和52%；Yescarta組3級及以上細胞因子釋放綜合征發(fā)生率為6%，3 級及以上神經(jīng)事件發(fā)生率為21%[27]。Carvykti，即西達基奧侖賽注射液，是我國首款獲FDA 批準(zhǔn)上市的CAR-T 細胞產(chǎn)品，是一款靶向B 細胞成熟抗原（B-cell maturation antigen,BCMA）的CAR-T 細胞免疫療法，主要用于多發(fā)性骨髓瘤治療，臨床總緩解率高達98%（95%CI92.7%～99.7%），完全緩解為78%（95%CI68.8%～86.1%）；在18 個月的中位隨訪時間中，中位緩解持續(xù)時間為21.8 個月（95%CI21.8%～無法預(yù)估）[28]。此外，有研究團隊對全球首批接受CAR-T 細胞治療的患者進行追蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，CAR-T 細胞在這些患者體內(nèi)可存留長達10 年之久，其中，CD8+CAR-T 細胞初始在效應(yīng)階段占主導(dǎo)群體，當(dāng)腫瘤負(fù)荷緩解后則由CD4+CAR-T 細胞維持機體持久的腫瘤清除[29]。

目前，CAR-T 細胞治療研發(fā)管線主要分布于美國與中國，約占全球75%以上。臨床治療靶點以CD19、CD22、CD20、BCMA 為主，一些諸如CD38、唾液酸結(jié)合性免疫球蛋白樣凝集素（Sialic acid binding Ig-like lectin 6，Siglec-6）、白細胞免疫球蛋白樣受體B4（Leukocyte immunoglobulin-like receptor B4,LILRB4）、CD133[30]等新靶點也逐漸備受關(guān)注，旨在降低B 細胞發(fā)育不全的不良反應(yīng)并規(guī)避脫靶毒性[31-34]。CAR-T 細胞治療主要集中于血液腫瘤，如急性白血病、多發(fā)性骨髓瘤、淋巴瘤等，但針對實體瘤領(lǐng)域，雖然存在如癌胚抗原（Carcinoembryonic antigen,CEA）、人類表皮生長因子受體2（Human epithelial factor receptor 2,HER2）、神經(jīng)節(jié)苷脂2（Gangliosides 2,GD2）、前列腺特異性膜抗原（Prostate specific membrane antigen,PSMA）、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican3,GPC3）、粘蛋白1（Mucoprotein1,MUC1）等在研靶點，目前尚無CAR-T 產(chǎn)品獲批，其原因較為復(fù)雜[35]。

3 CAR-T細胞治療面臨的挑戰(zhàn)

CAR-T 細胞治療雖然取得很矚目的成就，但是依然存在一定程度的不足，主要包括CAR-T 細胞生產(chǎn)批次差異大、慢病毒載體遞送CAR 基因的安全性、CAR-T 細胞脫靶效應(yīng)、CAR-T 細胞輸注后的免疫排斥及毒副作用、CAR-T 細胞體內(nèi)持續(xù)時間不足而導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)[36]。這些因素都會導(dǎo)致CAR-T 細胞治療效果不佳，對CAR-T 細胞治療存在極大挑戰(zhàn)，亟待解決。此外，實體瘤治療中由于腫瘤微環(huán)境存在，特異性腫瘤相關(guān)抗原缺失等諸多因素導(dǎo)致CAR-T 細胞無法有效浸潤至腫瘤周圍或內(nèi)部，從而無法殺傷腫瘤細胞[19,37]，CAR-T 細胞在治療實體瘤領(lǐng)域面臨著諸多的挑戰(zhàn)。

3.1 CAR-T細胞體外生產(chǎn)工藝復(fù)雜

CAR-T 細胞體外生產(chǎn)流程包括外周血獲取、單個核細胞分離、T 細胞激活、病毒轉(zhuǎn)染、CAR-T 細胞擴增和質(zhì)檢等，生產(chǎn)全過程需無菌控制，同時防止不同產(chǎn)品之間的交叉污染，整個流程需2～4 周，其制備過程復(fù)雜，耗時且成本較高，這在一定程度上延遲了患者接受治療的最佳時間。首先，對T 細胞來源而言，有研究者直接采用患者外周血單個核細胞制備CART 細胞，也有研究者采用純化的T 細胞進行CAR-T 生產(chǎn)，二者之間的差異尚需深入研究。其次，CAR-T 細胞擴增過程中需借助細胞因子刺激，補充血清或其他營養(yǎng)物質(zhì)等，對CAR-T 細胞生產(chǎn)所需原材料有嚴(yán)格要求，且補加時必須保證無菌環(huán)境。最后，CAR-T 細胞在輸注前，需對內(nèi)毒素、支原體、化學(xué)試劑殘余等一系列潛在風(fēng)險因素進行質(zhì)檢。

3.2 病毒遞送安全性

目前，已上市的幾款CAR-T 細胞產(chǎn)品均采用病毒載體向T 細胞遞送CAR 基因，例如Kymriah，Yescarta 均采用慢病毒作為其載體[38]。以來源于HIV的慢病毒載體為例，其主要包含Gag、Pol、Env、Tat、Rev、Vif、Vpr、Vpu 和Nef 等關(guān)鍵基因，每個基因各司其職，在包裝質(zhì)粒的幫助下將外源基因整合至靶細胞基因組，實現(xiàn)外源基因的持續(xù)穩(wěn)定表達。然而，病毒載體依舊存在潛在致癌性，且病毒載體攜帶基因片段有一定局限性，無法容納較大基因，同時病毒載體在整合時可能會導(dǎo)致插入突變。FDA推薦殘余DNA片段應(yīng)低于200 bp，且受CAR-T 細胞治療的患者需進行長期隨訪，以監(jiān)測病毒載體的副作用[38]，同時，對病毒載體的獲取，濃縮純化等工藝均需優(yōu)化。

基于此，目前非病毒載體如轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，包括piggyBac 轉(zhuǎn)座子（PB）系統(tǒng)（P-BCMA-101）和睡美人（Sleeping Beauty,SB）轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)備受研究者青睞。其中在以SB 作為載體的CD19 CAR-T 治療復(fù)發(fā)難治性B 細胞淋巴瘤的長期隨訪中證實該方法高效安全，毒副作用低[39]。同樣的，在抗白血病治療中也取得相似效果[40-41]。此外，采用該系統(tǒng)可精準(zhǔn)將外源基因遞送至目標(biāo)區(qū)域并且擴增的CAR-T 細胞以TCM 表型為主[42-43]。

3.3 毒副作用

CD19 是目前研究最為成熟的腫瘤抗原靶點，主要是其僅在B 系細胞表面表達，其他細胞幾乎不表達，且即使CAR-T 細胞殺傷正常B 細胞后也可通過補充免疫球蛋白彌補B 細胞暫時性的發(fā)育不全。但并不是所有腫瘤同B 細胞惡性血液腫瘤一般，它們表達異質(zhì)性的腫瘤相關(guān)抗原，且這些抗原在正常組織表面也大量表達，因此，CAR-T 細胞將正常細胞視為殺傷對象，從而導(dǎo)致脫靶毒性[44-45]。

此外，臨床上常見的CAR-T 細胞回輸后出現(xiàn)細胞因子釋放綜合征（Cytokine release syndrome,CRS）與神經(jīng)毒性綜合征等不良反應(yīng)，主要原因是CAR-T細胞及機體的其他免疫細胞一同釋放IL-1、IL-6、IL-10 等細胞因子導(dǎo)致CRS。根據(jù)患者臨床表征，CRS分為不同等級，如輕度患者表現(xiàn)為全身發(fā)熱、惡心、頭痛等；中度患者表現(xiàn)為呼吸困難、低血壓、2 級器官毒性；重度患者則出現(xiàn)3 級器官毒性并伴有轉(zhuǎn)氨酶升高乏力出現(xiàn)；極重度則表現(xiàn)為4 級器官毒性需機械通氣，已嚴(yán)重危及生命[46]。而IFN-γ、IL-1、IL-6、IL-8、IL-10、粒細胞集落刺激因子（Granulocyte Colony-Stimulating Factor,G-CSF）、粒細胞巨噬細胞刺激因子（Granulocyte-Macrophage Colony-stimulating factor,GM-CSF）、單核細胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein,MCP-1）、干擾素誘導(dǎo)蛋白10（Interferon induced protein 10,IP-10）等細胞炎性因子導(dǎo)致以嗜睡、疲勞、震顫、視聽幻覺、語言表達困難、書寫障礙、輕度嗜睡、注意力不集中等為主要表現(xiàn)的神經(jīng)毒性綜合征，更甚之，嚴(yán)重時可進展為全面失語、大小便失禁、嚴(yán)重意識及運動障礙、癲癇發(fā)作和昏迷性腦水腫。根據(jù)患者臨床表現(xiàn)不同可分為不同等級[47]。

CAR-T 細胞回輸治療后的另一不良反應(yīng)作用為宿主抗移植物反應(yīng)，一方面可能由于CAR 結(jié)構(gòu)中負(fù)責(zé)識別腫瘤抗原的胞外識別區(qū)單鏈抗體（ScFv）為鼠源；另一方面由于目前CAR-T 細胞治療“自體性”屬性，制備流程復(fù)雜，耗時長，若使用異源CAR-T 細胞則不可避免的導(dǎo)致移植物抗宿主病（Graft versus host disease，GVDH）發(fā)生[48-51]。

3.4 CAR-T細胞耗竭

相關(guān)研究表明，在腫瘤抗原的持續(xù)刺激下，機體的T 細胞正常效應(yīng)水平被削減，且自身增殖及存活時間均下調(diào)，即T 細胞處于耗竭狀態(tài)（PD-1+TCF-1-TIM-3+）[52-53]。當(dāng)然，CAR-T 細胞也存在相似表征，傳統(tǒng)體外擴增的CAR-T 細胞群體中以效應(yīng)表型(CCR7-CD45RA?)為主，與Na?ve CAR-T細胞（CD45RA+CCR7L+）相比，雖然細胞因子分泌能力較強但該群體細胞增殖、自我更新能力極度下降（依賴于IL-7、IL-15）。同時，抑制性受體程序性死亡因子1（Programmed death1，PD-1）、細胞毒性T 細胞淋巴細胞抗原4（Cytotoxic T cell lymphocyte antigen 4，CTLA-4）、T 細胞免疫球蛋白粘蛋白-3（T cell immunoglobulin mucin-3，TIM-3）、淋巴細胞活化基因3（Lymphocyte-activation gene 3,LAG-3）、T 細胞免疫球蛋白和ITIM 結(jié)構(gòu)域（T cell Ig and ITIM domain，TIGIT）、CD244（2B4）和CD160 等在該表型群體細胞中的表達持續(xù)增加或同時共同表達多個抑制性受體；效應(yīng)功能漸進性降低，即IFN-γ、IL-2、顆粒酶B 和穿孔素分泌減少；代謝水平發(fā)生改變，CAR-T 細胞線粒體活性降低，由氧化磷酸化、脂肪酸氧化轉(zhuǎn)換為糖酵解、谷氨酰胺、支鏈氨基酸代謝，PI3K-AKT-mTOR 通路活化，儲備能力降低[54-58]。

也有文獻報道，患者臨床反應(yīng)與CAR-T 細胞體內(nèi)擴增高度相關(guān)，持續(xù)的CAR-T 細胞存在可控制腫瘤進展[59]。然而回輸處于耗竭狀態(tài)的CAR-T 細胞后，由于線粒體活性削弱，其在患者體內(nèi)持續(xù)存活時間有限，無法有效維持一定數(shù)量效應(yīng)細胞；臨床分離的腫瘤患者T 細胞活化狀態(tài)受到影響，進而體內(nèi)抗腫瘤反應(yīng)受到抑制。當(dāng)接受CAR-T 細胞治療的患者腫瘤負(fù)荷較低時，其臨床反應(yīng)較佳，例如在治療中，初發(fā)性腫瘤患者臨床治療效果由于復(fù)發(fā)難治性，可能原因在于初發(fā)患者T細胞線粒體活性好，制備的CAR-T細胞質(zhì)量良好[60]。此外，CAR基因融合位點從表觀遺傳學(xué)角度調(diào)節(jié)T 細胞耗竭狀態(tài)而產(chǎn)生不同臨床反應(yīng)結(jié)果[61]。

3.5 實體瘤適用性不佳

CAR-T 細胞治療目前主要應(yīng)用于惡性血液腫瘤，實體瘤治療適用性并不理想，臨床尚無獲批產(chǎn)品。限制CAR-T 細胞對實體瘤領(lǐng)域應(yīng)用的原因可能因素如下：首先，缺乏腫瘤特異性抗原，不同于CD19，實體瘤腫瘤細胞一般異常表達多個靶點，且這些異常表達的抗原在正常組織中也有表達，例如目前針對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的研究靶標(biāo)包括PSMA、CEA、Her2、GD2、上皮細胞黏附分子（Epithelial cell adhesion molecule,EpCAM）和間皮素（Mesothelin）等[62-63]；其次，最主要的因素當(dāng)屬腫瘤微環(huán)境，腫瘤相關(guān)成纖維細胞（Cancer-associated fibroblasts,CAFs）是腫瘤微環(huán)境中最主要的成分之一，構(gòu)成腫瘤基質(zhì)層并釋放一些抑制性細胞因子；Treg 細胞、骨髓來源抑制性細胞、M2型巨噬細胞等免疫抑制性細胞通過分泌TGF-β、IL-10 或其他細胞因子來負(fù)向調(diào)節(jié)CAR-T 細胞免疫反應(yīng)；此外，實體瘤細胞丟失細胞因子受體，逃避免疫細胞監(jiān)視，CAR-T 細胞無法有效趨化至腫瘤細胞附近，歸巢能力受到抑制，而同樣的實體瘤治療中的免疫抑制性受體高表達抑制了CAR-T 細胞的有效活化，降低其效應(yīng)能力[35,64-65]。

4 CAR-T細胞耐藥應(yīng)對策略

4.1 CAR-T細胞通用性及安全性

首先，利用基因編輯技術(shù)優(yōu)勢，敲除引起GVDH的相關(guān)基因，實現(xiàn)“現(xiàn)貨通用”的CAR-T 細胞療法[66-67]。例如，基于TALEN 基因編輯技術(shù)將CAR 基因?qū)隩CRα 位點(TRACCART),將IL-12P70 導(dǎo) 入IL2Rα 或PDCD1 制備的通用細胞有效清除NSG 小鼠體內(nèi)腫瘤細胞，且臨床首批接受基于此技術(shù)制備的CAR-T 細胞白血病患者已得到緩解，僅出現(xiàn)低程度GVDH 表 現(xiàn)[68-69]；基 于CRISPR-Cas9 編輯技術(shù)將CD19 CAR 定向遞送到T 細胞受體α 恒定區(qū)（T-cell receptor α constant，TRAC）基因座，該設(shè)計不僅獲得了通用CAR-T 細胞，而且增強了CAR-T 在急性淋巴細胞白血病小鼠模型中的擴增能力以及改善因抗原刺激導(dǎo)致的CAR-T 細胞耗竭[70]。但也有研究報道，相比于TCR 敲除組CAR-T 細胞，內(nèi)源性TCR 促進CAR-T 細胞持續(xù)[71]。因此，對于TCR 基因敲除后對CAR-T 細胞的影響尚需深入探究。同時，研究者利用CRISPR-Cas9 技術(shù)篩選出Fas-FasL、p38 等多個新型腫瘤治療靶點，這一發(fā)現(xiàn)將進一步提升過繼性細胞治療適用性[72-73]。

其次，臍帶血及造血干細胞因其天然優(yōu)勢用于血液腫瘤移植性治療，采用臍帶血來源T 細胞/NK 細胞制備的CAR-T/CAR-NK 均可有效緩解GVDH 及CRS等毒副作用。在一項臨床研究中（NCT03056339），11 位復(fù)發(fā)難治性CD19 陽性腫瘤患者接受臍帶血來源CAR-NK 治療后，8 例患者對CAR-NK 反應(yīng)(73%)，其中4 例淋巴瘤和3 例CLL 患者完全緩解，1 例患者部分緩解[74]。

控制CAR-T 回輸后的CRS、神經(jīng)毒性等不良反應(yīng)可通過調(diào)節(jié)CAR-T 細胞體內(nèi)活性達到緩解[75-76]，例如Amatya 等[77]設(shè)計了一種攜帶自殺基因IC9 的SLAMF7 CAR-T 細胞，主要考慮到SLAMF7 除在MM細胞中表達外，在諸如NK細胞、淋巴細胞中也保持表達。添加自殺基因相當(dāng)于給CAR-T 細胞配置“剎車”系統(tǒng)，使CAR-T 細胞清除MM 細胞后，通過添加AP1903 誘導(dǎo)其死亡。此外，有研究者設(shè)計了一對人正交IL-2（orthogonal IL-2,ortho-hIL-2）/IL-2Rβ（ortho-hIL-2Rβ）系統(tǒng)，ortho-hIL-2 對表達ortho-hIL-2Rβ的細胞具有選擇性，可誘導(dǎo)表達ortho-hIL-2Rβ的CAR-T細胞增殖，而對野生型T細胞沒有明顯的信號傳導(dǎo)作用，通過體外給予或不給予ortho-hIL-2，可控制CAR-T 細胞的增殖水平[15]。FDA 指出采用類固醇可改善接受Yescarta 治療后的CRS（https://investors.gilead.com/news-releases/news-release-details/usfda-approves-new-label-update-car-t-cell-therapyyescartar）；同時，抑制IFNγ似乎可以阻止巨噬細胞和其他有助于驅(qū)動細胞因子釋放綜合征的免疫細胞的激活且對CAR-T 細胞的抗腫瘤作用沒有明顯的負(fù)面影響[78]。

B 細胞發(fā)育不全是CD19 CAR-T 細胞治療后的另一主要不良反應(yīng)，盡管臨床上采用免疫球蛋白補給治療，但仍存在一定的風(fēng)險。研究者發(fā)現(xiàn)給CAR-T細胞裝載一種B 細胞激活因子（B cell activating factor，BAFF）配體，可實現(xiàn)僅殺傷腫瘤細胞而對早期B 細胞無毒性，早期B 細胞則可以補充已被消耗的成熟B 細胞。主要原理為BAFF 可同B 系惡性腫瘤細胞表面表達的B 細胞活化因子受體（B cell-activating factor receptor，BAFF-R）、BCMA 和跨膜激活劑和CAML 相互作用劑（Transmembrane Activator and CAML Interactor,TACI）任一受體特異性結(jié)合，而早期B細胞卻幾乎不表達BAFF受體[45]。Hebbar等[44]構(gòu)建了一種靶向AMLGRP78 新型抗原的CAR-T 細胞，因為GRP78 在AML 癌細胞表面上過表達，但在骨髓造血祖細胞（Hematopoietic progenitor cells,HPCs）中不表達，從而避免對B 細胞的殺傷；同時他們采用BCR-ABL 激酶抑制劑達沙替尼（Dasatinib）處理該CAR-T 細胞，阻滯了GRP78 CAR-T 細胞對自身的識別，提高了其適應(yīng)性，持續(xù)時間延長從而有效清除腫瘤細胞。

4.2 改善CAR-T細胞耗竭狀態(tài)

CAR-T 細胞耗竭調(diào)節(jié)主要包括但不局限于如下策略：首先，基因編輯技術(shù)敲除或過表達耗竭相關(guān)基因，例如敲除細胞因子信號抑制因子1（Suppressor of Cytokine Signaling 1，SOCS1）可促進CD4+T細胞增殖與存活潛能，且體內(nèi)結(jié)果表明抑制SOCS1表達可明顯改善CD4+CAR-T 細胞的持久性和CD8+CAR-T 細胞的功效[79]。在一代或二代CAR-T細胞中敲除DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3A（DNA Methyltransferase 3A,DNMT3A）后，其增殖能力顯著提升，在接受長期腫瘤抗原刺激也依舊表現(xiàn)出較強毒性，其可能通過抑制TCF7,CD62L,CD45RA 等記憶干性基因參與T 細胞耗竭調(diào)控[80]。同樣的，敲除或抑制胸腺細胞選擇相關(guān)的高遷移率族盒（Thymocyte selection associated high mobility group box，TOX）、核受體亞家族4 A（Nuclear receptor subfamily 4 group A，NR4A）、正性調(diào)控域鋅指蛋白1（Positive regulatory domain zinc finger protein 1,PRDM1）和CLB 等表達也可有效改善CAR-T 細胞耗竭狀態(tài)[80-87]。其次，優(yōu)化改善CAR-T 細胞培養(yǎng)基，包括細胞因子優(yōu)化與T 細胞分化的抑制劑兩種措施。例如CAR-T細胞在IL-15、IL-21培養(yǎng)下以記憶性表型為主體，而IL-2培養(yǎng)下則以末端效應(yīng)為主[15,88-89]；補加DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑地西他濱（Decitabine），2-脫氧-D-葡萄糖（2-Deoxy-D-glucose,2-DG）等均促進低分化CAR-T 細胞群體形成，有利于CAR-T 細胞在體內(nèi)維持自我更新及長期存活特征，從而增加其對腫瘤細胞的清除能力。添加此類物質(zhì)可能通過對CAR-T細胞表觀遺傳學(xué)及代謝水平產(chǎn)生潛在影響[90-91]。同樣的，研究者也發(fā)現(xiàn)以4-1BB 為共刺激分子的CAR-T細胞表現(xiàn)為更強增殖能力與記憶樣表型，但CD28 CAR-T 卻以丟失增殖潛能為代價表現(xiàn)出更強的細胞毒性[10]。最后，聯(lián)合新技術(shù)篩選與驅(qū)動T 細胞耗竭相關(guān)的基因，有研究者發(fā)現(xiàn)CD19-CAR-T細胞經(jīng)歷了與T 細胞耗竭相關(guān)的DNA 甲基化編程，因此阻止這一過程可能是提高CAR-T 細胞療效的一種有效的措施[92]。此外，有研究者利用CRISPR 全基因組激活篩選平臺dgRNA-CRISPR，基于小鼠原代CD8 T細胞篩選出能夠增強細胞功能的特定基因脯氨酸脫氫酶2（Proline dehydrogenase 2,PRODH2），并構(gòu)建了PRODH2過表達的CD22-CAR、BCMA-CAR 和HER2-CAR 等T 細胞，體內(nèi)、外實驗表明PRODH2 基因能夠增強CAR-T 細胞的持久性，提高抗多種腫瘤的治療效果；進一步對PRODH2 工程化的CAR-T 進行轉(zhuǎn)錄、代謝等研究發(fā)現(xiàn)，PRODH2 可重編程脯氨酸代謝途徑，促進線粒體的增生，提高T 細胞的氧化磷酸化水平，降低其糖酵解水平，為CAR-T 細胞提供了更多的能量，增強CAR-T 細胞的抗腫瘤能力；同時，針對實體瘤構(gòu)建共表達趨化因子受體或靶向腫瘤微環(huán)境中基質(zhì)細胞標(biāo)志物的CAR-T 細胞，如共表達CCR7 增加了CAR-T 細胞向腫瘤細胞周圍的遷移與浸潤。靶向纖維細胞活化蛋白（Fibroblast activation protein,FAP）的CAR-T 細胞降低了腫瘤血管密度和結(jié)締組織增生，并以免疫非依賴性方式抑制了人肺癌異種移植物和同基因鼠胰腺癌的生長，為開發(fā)用于治療實體瘤的FAP（+）基質(zhì)細胞靶向療法提供支持[93]。共表達4-1BBL和CD40等一些新的受體，增加CAR-T 細胞增殖，活化能力，抑制細胞凋亡水平[94-95]。研究發(fā)現(xiàn)源自神經(jīng)母細胞瘤配對同源異型盒蛋白2B(Paired-like homeobox 2B,PHOX2B)的未突變肽（QYNPIRTTF）在神經(jīng)母細胞瘤中大量表達，構(gòu)建靶向PHOX2B 未突變肽的PC CAR-T 細胞可特異識別殺傷不同HLA類型的神經(jīng)母細胞瘤細胞，治療1周后小鼠體內(nèi)神經(jīng)母細胞瘤細胞完全消退[96]。

4.3 提升CAR-T細胞敏感性

在CAR-T 細胞研究過程中發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)的另一重要原因是腫瘤細胞下調(diào)靶抗原的表達，CAR 分子表達水平降低或CAR-T 細胞與腫瘤細胞間免疫突觸親和力不佳?；诖耍芯空咄ㄟ^TCR 工作原理設(shè)計出一種新型高抗原敏感性CAR，他們發(fā)現(xiàn)通過在4-1BB/CD3ζ 序列中嵌入CD3ε 或生長因子受體結(jié)合 蛋白2（Growth factor receptor binding protein 2,GRB2）結(jié)構(gòu)域可以使CAR-T 細胞在較低抗原閾值下激活，且與傳統(tǒng)4-1BB/CD3ζ 相比，該新型CAR-T 細胞在構(gòu)建的白血病、淋巴瘤及乳腺癌小鼠腫瘤模型中均展現(xiàn)出優(yōu)勢[97]。有文獻發(fā)現(xiàn)CAR-T 細胞中的溴結(jié)構(gòu)域和超末端結(jié)構(gòu)域（bromodomain and extra terminal domain,BET）蛋白會降低CAR 的表達，采用BET 溴結(jié)構(gòu)域JQ1 抑制劑抑制BET 蛋白的表達，可以減少T細胞耗竭，提高CAR 的表達量并延長CAR-T 細胞在體內(nèi)的擴增能力[98]。Halim 等[99]通過優(yōu)化親和力方式，篩選出可與CAR-T 細胞高效結(jié)合的靶抗原ScFv，從而增加CAR-T 細胞對腫瘤細胞的親和性并對其殺傷。

4.4 CAR-T細胞代謝水平

CAR-T 細胞代謝途徑與其增殖和分化狀態(tài)息息相關(guān)，通過調(diào)節(jié)CAR-T 細胞新陳代謝可以提高其腫瘤免疫活性。T 細胞在未接觸抗原前，代謝主要依靠氧化磷酸化（Oxidative phosphorylation,OXPHOS）和脂肪酸氧化（Fatty acid oxidation,FAO）代謝途徑提供能量，此時T 細胞處于幼稚低分化階段，自我更新能力較強，抗腫瘤能力不佳。當(dāng)遇到抗原刺激時，TCR和CD28 協(xié)同激活T 細胞PI3K-AKT-mTOR 通路，代謝方式轉(zhuǎn)換為糖酵解、谷氨酰胺和支鏈氨基酸的分解代謝，導(dǎo)致葡萄糖和氨基酸的攝取增加，滿足快速增殖和細胞因子產(chǎn)生的新陳代謝需求，此時T 細胞具備一定裂解靶細胞能力[100]。相關(guān)研究表明低分化CAR-T 細胞回輸后效果優(yōu)于末端分化狀態(tài)CAR-T 細胞，基于此，有文獻報道CAR-T 細胞與mTOR 上游調(diào)節(jié)因子PI3K 抑制劑孵育，可增加幼稚和中樞記憶T細胞亞群，且體內(nèi)持續(xù)時間和抗腫瘤活性均得到提升[58,101]。也有文獻報道采用人工合成的2DG 抑制糖酵解過程，可促進記憶性T 細胞的形成[102]。此外，在CLL 中，T 細胞線粒體受損，降低葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（Glucose Transporters 1,GLUT1）的儲備也可提高CAR-T 治療效果[60]。也有研究者發(fā)現(xiàn)在CAR-T 細胞培養(yǎng)基中提升鉀離子濃度可以誘導(dǎo)T 細胞自噬，減少效應(yīng)和耗竭相關(guān)基因的組蛋白乙?；@得的CAR-T 細胞具有更好持久性與多能性[103]。提升培養(yǎng)基中精氨酸水平也可誘導(dǎo)CAR-T 細胞代謝水平變化，促進OXPHOS 代謝并抑制糖酵解，維持效應(yīng)記憶型T細胞（Effective Memory T Cell，Tem）的生存[104]。

腫瘤細胞的糖酵解活性可能會限制CAR-T 細胞對葡萄糖的攝取，對腫瘤微環(huán)境的代謝調(diào)節(jié)可改善CAR-T 細胞功能。阻斷PD-L1/PD1 軸可直接抑制腫瘤細胞的糖酵解，恢復(fù)TME 中的葡萄糖，從而促進CAR-T 細胞的糖酵解和IFN-γ 的產(chǎn)生[105]。GLUT1 抑制劑或生酮飲食在不損傷CAR-T 細胞功能的前提下抑制腫瘤細胞葡萄糖代謝[106]。缺氧和營養(yǎng)不足是腫瘤微環(huán)境的主要特征。營養(yǎng)缺乏，尤其是氨基酸，如色氨酸，能夠激活調(diào)節(jié)T 細胞活性的綜合應(yīng)激反應(yīng)。吲哚胺2，3 雙加氧酶（Indoleamine2,3-dioxygenase1,IDO）是一種細胞內(nèi)酶，可以催化色氨酸降解為犬尿氨酸。腫瘤微環(huán)境內(nèi)的腫瘤細胞和骨髓細胞過表達IDO，會導(dǎo)致T細胞增殖和存活受阻，使用miR-153抑制結(jié)腸癌細胞中IDO1 的表達后，CAR-T 細胞毒性增加[107]。TGF-β 參與T 細胞糖酵解和OXPHOS，采用CRISPR/CAS9技術(shù)敲除CAR-T細胞內(nèi)源性轉(zhuǎn)化生長因子-β 受體II（Transforming growth factor-β receptor II,TGF-βR2）后,Treg 轉(zhuǎn)化降低，CAR-T 細胞的耗竭緩解[108]。

5 展望

近年來，腫瘤免疫療法在臨床的應(yīng)用極大程度地提升了腫瘤患者的生活質(zhì)量，CAR-T 細胞療法為血液腫瘤患者的治愈帶來了曙光，借鑒并聯(lián)合新興技術(shù)有望進一步拓展CAR-T細胞療法的適用性。（1）TCRT 與CAR-T 技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用。有研究者將抗原的ScFv偶聯(lián)在TCR 上制備的TRuC-T，該設(shè)計保持了原有的TCR 序列，識別腫瘤時不受HLA 限制。TRuC-T 細胞毒性與CAR-T 細胞相近甚至超越CD28/4-1BB CART 細胞，并且在小鼠淋巴瘤及白血病血液腫瘤模型中均展現(xiàn)潛在的抗腫瘤活性[109]。目前采用該療法的產(chǎn)品（TC-201）已進入I/II 期臨床試驗，用于治療間皮素陽性的非小細胞肺癌（NSCLC）、卵巢癌、惡性胸膜/腹膜間皮瘤和膽管癌患者[110]。（2）新興技術(shù)和制備工藝聯(lián)合應(yīng)用。Novartis 公司采用T-ChargeTM工藝制備的新型抗BCMA CAR-T 細胞（PHE885），與傳統(tǒng)技術(shù)相比，需要不到2 d 的時間就可以生成功能性的CAR-T細胞，并且保留了原始/干細胞記憶T 細胞(Tscm)(CD45RO?/CCR7+)，極大程度改變了CAR-T細胞耗竭水平。Pulsipher 等[111]的研究結(jié)果表明，采用新一代NGS 測序技術(shù)監(jiān)測微小殘留病灶可更好預(yù)測tisagenlecuucl 治療兒童和青年急性淋巴細胞白血病后的復(fù)發(fā)情況，幫助醫(yī)護人員在第一時間采取預(yù)防措施。預(yù)先篩選與腫瘤抗原間可形成高效免疫突觸的ScFv 等技術(shù)[99]。（3）免疫檢查點抑制劑與CAR-T 療法聯(lián)合應(yīng)用。有研究者采用shRNA 技術(shù)同時下調(diào)兩種檢查點分子（包括PD-1/TIM-3、PD-1/LAG-3、PD-1/CTLA-4、PD-1/TIGIT），結(jié)果顯示在PD-1/TIGIT 同時敲除后起到協(xié)同促進CD19 CAR-T 細胞對白血病腫瘤細胞的清除[112]。機制上，下調(diào)PD-1 增強了CAR-T 細胞效應(yīng)分子分泌能力，而TIGIT 的下調(diào)則主要負(fù)責(zé)維持CAR-T 細胞低分化/耗竭狀態(tài)，對其安全性評估后開展一項復(fù)發(fā)或難治性大B 細胞淋巴瘤成人患者的臨床實驗以驗證該設(shè)計的臨床療效（NCT04836507)[112]。最新發(fā)現(xiàn)PTP1B(Protein Tyrosine Phosphatase 1B,蛋白酪氨酸磷酸酶1B)是一種新的免疫檢查點分子，其在T細胞中高表達抑制T細胞擴增與細胞毒性從而促進腫瘤發(fā)展，當(dāng)敲除PTP1B 后STAT5 信號增加，從而增強了CD8+T細胞的抗原依賴性增殖與毒性并抑制腫瘤細胞生存活性。采用PTP1B 抑制劑同樣再現(xiàn)了T細胞介導(dǎo)的腫瘤生長抑制，同時影響PD-1 阻斷治療。CAR-T 細胞敲除該基因后對抗實體瘤（肝癌，乳腺癌）的療效均得到提升[113]。（4）小分子抗癌藥物與CAR-T 療法聯(lián)合應(yīng)用。將CAR-T 細胞作為藥物遞送載體。采用CAR-T 細胞遞送無活性的前體抗癌藥物AMS 于腫瘤細胞周圍，經(jīng)改造后的CAR-T 細胞稱之為合成酶武裝殺傷細胞（Synthetic Enzyme-Armed Kill ER cells,SEAKER），兼?zhèn)銫AR-T 細胞的靶向能力與小分子抗癌藥物雙重效果，SEAKER 中的CART 細胞扮演著“即時藥物生產(chǎn)”角色[114]。采用CAR-T細胞遞送一種RN7SL1 的內(nèi)源性RNA 和外來抗原。RN7SL1 模擬了病毒RNA，當(dāng)CAR-T 細胞到達腫瘤細胞周圍時釋放RN7SL1，可被先天免疫細胞NK 和DC 等細胞識別，活化刺激機體自身T 細胞參與腫瘤免疫反應(yīng)，同時CAR-T 細胞遞送的外來抗原被錨定于腫瘤細胞，進一步增加機體T細胞尋找逃避CAR-T細胞監(jiān)視的腫瘤細胞，CAR-T細胞與機體自身T細胞可協(xié)同清除腫瘤細胞，尤其實體瘤細胞[115]。（5）CART 細胞治療領(lǐng)域的拓展。采用CAR-T 細胞療法治療心肌纖維化相關(guān)疾病，在治療過程中雖然心肌纖維化得到了改善，但由于該CAR-T 細胞可在體內(nèi)存活數(shù)月甚至數(shù)年，持續(xù)攻擊全身范圍的成纖維細胞，從而導(dǎo)致傷口難以愈合，因此導(dǎo)致CAR-T 細胞治療弊大于利。借鑒mRNA 疫苗治療理念，研究者設(shè)計了一款更可控、程序更簡單的CAR-T 細胞治療技術(shù)，即mRNA 遞送。該mRNA 編碼靶向成纖維細胞表面的FAP，同時將mRNA 與附著靶向T 細胞表面CD5 分子的脂質(zhì)納米顆粒融合。注射該mRNA 后，其成功在體內(nèi)編碼CAR-T 細胞，但是不同于慢病毒遞送CAR基因，該“CAR-T 細胞”中mRNA 未整合到T 細胞基因組，因此這些CAR-T 細胞攻擊心肌纖維細胞后僅僅數(shù)天便消失，在改善心衰的同時也規(guī)避了對其他纖維阻滯的攻擊[116-117]。

總之，CAR-T 細胞治療及基于CAR-T 細胞治療的新型技術(shù)均具有非常大的應(yīng)用前景，通過不斷地優(yōu)化調(diào)整設(shè)計方案，最終將適用于廣泛的疾病治療，為更多患者帶來希望，提升人類生活質(zhì)量。