謝芳杰，軒正英，張 娟，王新建,2,3，吳翠云,2,3，杜紅斌*

(1 塔里木大學 園藝與林學學院，新疆阿拉爾 843300；2 塔里木大學 南疆特色果樹高效優(yōu)質(zhì)栽培與深加工技術國家地方聯(lián)合工程實驗室，新疆阿拉爾 843300；3 塔里木大學 新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木盆地生物資源保護利用兵團重點實驗室，新疆阿拉爾 843300)

蛋白質(zhì)的生物合成是需要啟動因子、延伸因子、終止因子、核糖體等許多大分子共同作用的復雜生理過程[1-2]。在真核生物中，延伸因子分為EF-1和EF-2。其中EF-1(elongation factor 1)包括α、β和γ等3個亞基[3]。EF-1作為重要的翻譯因子，攜帶GTP蛋白催化氨酰基-RNA與核糖體上A位點的結合促進肽鏈的延伸，從而調(diào)控蛋白質(zhì)的合成[4-5]。EF-1α是真核生物中較多的一類蛋白，僅次于肌動蛋白，目前在擬南芥、大豆、牽?；ê头训榷喾N植物中已被分離[6-7]，且植物間EF-1α氨基酸序列具有較高的保守性，因此被廣泛用于不同作物研究的內(nèi)參基因。如朱海生等[8]研究發(fā)現(xiàn)CmEF-1α基因在印度南瓜不同組織和不同脅迫處理下均能穩(wěn)定表達。Zi等[9]研究發(fā)現(xiàn)在白樺不同組織中EF-1α是最穩(wěn)定的內(nèi)參基因。武志娟等[10]在大針茅根中發(fā)現(xiàn)最穩(wěn)定的內(nèi)參基因組合為18S rRNA和EF-1α。在水稻根中，OsEF-1α的穩(wěn)定表達量最高[11]，與甘蔗在鹽度和干旱脅迫下的表達結果一樣[12]。

隨著越來越多物種的EF-1α基因的挖掘和鑒定，發(fā)現(xiàn)EF-1α是一種多功能蛋白，與其他蛋白互作調(diào)控植物生長發(fā)育。如ZmEF-1α可以在特定pH條件下(6.0-8.0)與肌動蛋白相互作用，調(diào)節(jié)植物細胞生長過程[13]。范心誠[14]研究發(fā)現(xiàn)，EF-1α在矮牽牛根莖葉中都有表達，且沉默EF-1α導致植株部分葉片出現(xiàn)畸形壞死的現(xiàn)象。EF-1α不僅參與植物病毒的復制和繁殖、介導細胞凋亡和早葉衰老等，還調(diào)控非生物應激反應。如Wang等[15]發(fā)現(xiàn)OsEF-1α通過增強先天免疫相關受體基因的表達和不可控地激活某些信號分子，提高對稻瘟病菌和黃單胞菌的抗性。擬南芥AtEF-1α敲除對NaCl脅迫表現(xiàn)出更高的敏感性，而過表達AtEF-1α植物對鹽的耐受性更高[16]。干旱和鹽脅迫下可大量誘導大豆GmEF-1α的積累[7]。以上研究表明，EF-1α基因可能在非生物脅迫期間對翻譯的調(diào)節(jié)起重要作用。

香菜(CoriandrumsativumL．)別名芫荽，為傘形科芫荽屬一、二年生草本植物，嫩莖和鮮葉有特殊濃厚的芳香氣味，具有較高的食用和藥用價值。香菜發(fā)育過程中，涉及到形態(tài)、生理生化和遺傳等多方面的變化。目前，國內(nèi)外有關香菜研究的報道多集中在栽培技術、有效物質(zhì)的提取、功能及作用機制等方面[17]。而EF-1α基因?qū)ο悴松L發(fā)育的調(diào)控機理還未揭示。本研究利用RT-PCR技術克隆香菜中延伸因子EF-1α基因，結合生物信息分析方法對EF-1α基因進行分析，并利用qRT-PCR技術研究該基因在不同發(fā)育時期和非生物脅迫下的表達變化，旨在為進一步研究香菜的分子機制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 植物材料與RNA提取

香菜種植于塔里木大學園藝試驗站教學實踐基地，常規(guī)管理。待香菜生長至30，60和90 d時取地上部分作為實驗材料，分別命名為S1、S2和S3時期，用于檢測不同發(fā)育時期基因表達量。香菜生長至5～7片葉時，分別進行低溫(4 ℃)、高溫(38 ℃)、干旱(10% PEG-8000)、高鹽(200 mmol·L-1NaCl)脅迫處理，各處理0、2和10 h，每個樣品設3次生物學重復，取香菜地上部分，經(jīng)液氮速凍后按照RNA提取試劑盒(Tsingke，北京)說明書的步驟從香菜中提取總RNA，用1%瓊脂膠檢測所有樣品RNA的完整性。隨后，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Tsingke，北京)將提取的總RNA取1 μg進行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，保存在-20 ℃冰箱中備用。

1.2 方 法

1.2.1 基因克隆從香菜轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，篩選到一個在不同發(fā)育時期差異表達的EF-1α基因(Cs08G01350)。從香菜基因組數(shù)據(jù)中找到該基因序列，利用Primer Premier 6.0軟件設計，CsEF-1α基因引物(F：5′-ATGGGTAAGGAAAAGATTCATATC-3′；R：5′-TCACTTCTTCTTGATGGCAGC-3′)，以反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，用EasyTaqDNA聚合酶(TransGene，北京)進行PCR擴增。反應過程：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；最后延伸72 ℃延伸10 min。經(jīng)1%瓊脂糖電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物后確定條帶大小正確，PCR產(chǎn)物切膠回收后連接到pEASY-T1克隆載體(Tsingke，北京)上送至擎科生物有限公司測序。

1.2.2 香菜CsEF-1α基因生物信息學分析利用在線工具ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)對CsEF-1α基因進行翻譯獲得其蛋白序列。ProtParam(http://web.expasy.org/protparam/)對CsEF-1α蛋白的氨基酸序列、蛋白質(zhì)分子量、原子總數(shù)、分子式、理論等電點、穩(wěn)定性指數(shù)和疏水性進行預測和分析。利用NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查找與CsEF-1α基因同源的其他物種的相關序列，并用DNAMAN蛋白序列同源性分析，利用MEGA 5.0軟件中Neighbor-Joining(NJ)法構建進化樹。用SOPMA進行分析基因的二級結構。通過在線軟件phyre(http: //www.sbg.bio.ic.ac.uk/)對EF-1α基因的三級結構進行預測。利用PlantCARE數(shù)據(jù)庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，分析啟動子序列上的順式作用元件。利用WoLF PSORT對EF-1α進行亞細胞定位分析進行[18]。

1.2.3 基因表達分析利用Primer Premier 6.0設計基因特異引物(F：5′-CCACCCTGGTCAGATTGGAAACG-3′；R：5′-GCCTCATGTCTCGCACAGCAA-3′)。以DNAJ為內(nèi)參基因，引物序列為(F：5′-CACGAGTGTGCCAAGCAGTTCTT-3′；R：5′-CCTTCACGGCGGAGACTGTTCT-3′)。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋10倍作為qRT-PCR反應模板。qRT-PCR采用Bio-Rad-CFX96TM實時PCR系統(tǒng)(Bio-Rad，CA，USA)和2×T5 Fast qPCR Mix(SYBR Green I)(TransGene，北京)。每個反應3個技術重復。每個反應體系為20 μL，包括10 μL SYBR Green I mix，上下游引物各0.4 μL，稀釋后的cDNA 2.0 μL，dd H2O 7.2 μL。PCR程序：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃退火和延伸30 s，共40個循環(huán)。溶解曲線分析從65 ℃到95 ℃。以Ct值為縱標，對基因表達水平使用2-ΔΔCt法進行數(shù)據(jù)分析[19]。

2 結果與分析

2.1 香菜EF-1α基因的克隆

基于香菜基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，以香菜葉片cDNA為模板，設計引物PCR擴增得到目的基因(圖1)，條帶大小為1 344 bp，與預期長度一致，將其命名為CsEF-1α基因(GenBank登錄號為OL962478)。

M. DNA Marker 2000; 1. CsEF-1α圖1 CsEF-1α基因擴增Fig.1 Amplification of CsEF-1α gene

2.2 CsEF-1α基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)分析

由圖2可知，CsEF-1α基因包含一個1 344 bp的完整開放閱讀框，預測編碼447個氨基酸，原子總數(shù)為7 004，分子式為C2202H3544N594O644S20，蛋白質(zhì)分子量為49.29 kD，等電點為9.12，屬于堿性蛋白。如圖2所示，該基因的氨基酸序列分別由賴氨酸(Lys，49個，占11.0%)、甘氨酸(Gly，38個，占8.5%)、纈氨酸(Val，37個，占8.3%)、色氨酸(Trp，3，占0.7%)等20種氨基酸組成。其中，賴氨酸數(shù)量最多，色氨酸數(shù)量最少。進一步分析發(fā)現(xiàn)，共有76個堿性氨基酸和78個酸性氨基酸。CsEF-1α蛋白質(zhì)的總平均疏水性(GRAVY)為-0.273，預測為親水性蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為30.21，脂溶性指數(shù)為84.16，是穩(wěn)定性蛋白。

圖2 CsEF-1α蛋白的氨基酸序列組成Fig.2 Amino acid sequence composition of CsEF-1α protein

2.3 二級結構和亞細胞定位分析

如圖3所示，二級結構預測分析發(fā)現(xiàn)CsEF-1α蛋白的高級結構以無規(guī)則卷曲和α-螺旋為主，分別占36.91%和30.43%，其中β轉(zhuǎn)角所占比例10.74%。利用WoLF PSORT網(wǎng)站對CsEF-1α亞細胞定位預測，發(fā)現(xiàn)CsEF-1α基因編碼的蛋白定位于細胞質(zhì)。CsEF-1α蛋白主要由無規(guī)則卷曲和α螺旋構成，預測分析結果與二級分析結果一致(圖4)。

A. CsEF-1α蛋白二級結構類型；B.二級結構曲線趨勢圖3 CsEF-1α蛋白的二級結構A. Prediction of secondary structure types of CsEF-1α protein; B. Secondary structure curve trendFig.3 Prediction of secondary structure of CsEF-1α protein

圖4 CsEF-1α蛋白質(zhì)三級結構Fig.4 Tertiary structure of CsEF-1α protein

2.4 CsEF-1α蛋白質(zhì)的同源比對和進化分析

將香菜CsEF-1α基因編碼的蛋白質(zhì)與其他植物EF-1α同源性比對。結果發(fā)現(xiàn)，CsEF-1α與其他植物EF-1α氨基酸具有較高相似性，僅有少數(shù)氨基酸差異(圖5)。其中，與胡蘿卜(Daucuscarota，XP_017247334.1)、蓖麻(Ricinuscommunis，XP_002518073.1)和玉米(Zeamays，NP_001338678.1)等氨基酸序列相似性分別為99.78%、95.96%和95.97%，推測他們可能具有相同的生物學功能。為進一步明確香菜CsEF-1α的功能與進化關系，利用MEGA 5.0軟件對與CsEF-1α相似的蛋白序列對比(圖6)。結果表明，CsEF-1α與胡蘿卜、野生番茄、青蒿素和非洲菊的親緣關系較接近，與博落回、睡蓮、蓖麻和巨桉等其他物種親緣關系較遠。

圖5 香菜CsEF-1α與其他植物EF-1α蛋白同源序列比對Fig.5 Alignment of homologous sequences between CsEF-1α and other plant EF-1α proteins

2.5 啟動子分析

啟動子區(qū)的順式作用元件可調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性，通過分析順式作用元件組成，可了解基因的功能及其表達潛力。利用在線軟件PLANTCARE分析了香菜EF-1α基因的啟動子序列。結果發(fā)現(xiàn)10種順式元件，包括4種植物生長發(fā)育元件、3種激素響應元件、3種脅迫響應元件(表1)。其中生長發(fā)育元件在3種元件占了最大的比例，共有6個順式作用元件，其中光敏元件GATA-motif和G-Box分別含有2個，I-box和TCT-motif分別含有1個。在激素相關元件中，發(fā)現(xiàn)ABA響應元件(ABRE)2個，赤霉素響應元件(GARE-motif)2個，水楊酸響應元件(TCA-element)1個。CsEF-1α基因啟動子中檢測到2個厭氧誘導元件(ARE)、1個應激反應元件(STRE)、1個干旱誘導元件(W-box)，總的來說，這些結果推測CsEF-1α可能參與了香菜對生長發(fā)育和非生物脅迫的響應。

圖6 基于26個不同科屬EF-1α蛋白氨基酸序列構建的進化樹Fig.6 The phylogenetic tree constructed based on the amino acid sequences of EF-1α proteins from 26 different families and genera

表1 CsEF-1α基因啟動子區(qū)順式調(diào)控元件分析

2.6 香菜CsEF-1α基因不同發(fā)育時期表達模式分析

本研究結合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，并且利用qPCR驗證香菜CsEF-1α基因不同發(fā)育時期表達模式分析。如圖7所示，從S1到S3階段，CsEF-1α基因轉(zhuǎn)錄豐度增加。隨著香菜生長時期的增加，CsEF-1α基因表達量表現(xiàn)出升高趨勢，其中S1到S2時期基因表達量上升幅度最大，S2到S3上升幅度較小，該實驗結果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)保持良好的一致性。

不同小寫字母表示基因在不同發(fā)育時期下的相對表達差異顯著(P<0.05)圖7 香菜CsEF-1α基因不同發(fā)育時期的轉(zhuǎn)錄本豐度和qPCR分析The different normal letters indicate the relative expression of gene at different development stages is significantly different (P<0.05)Fig.7 Transcript abundance and qPCR analysis of coriander CsEF-1α gene at different developmental stages

2.7 香菜CsEF-1α基因非生物逆境誘導表達模式分析

為明確香菜CsEF-1α基因香菜抵御非生物逆境脅迫中應答機制，本研究利用qRT-PCR技術檢測CsEF-1α在不同脅迫下的表達模式。結果表明(圖8)，在不同誘導模式下，CsEF-1α基因均有不同程度的表達。與CK相比，隨著鹽脅迫(NaCl)時間增加，CsEF-1α基因表達量表現(xiàn)先升高再降低的趨勢，處理2 h時，CsEF-1α基因的相對表達量升高，是CK的1.2倍，而處理10 h后，基因表達量反而呈現(xiàn)下降趨勢，較CK下降了50%。而在其他3種脅迫處理下，隨著脅迫時間的增加，CsEF-1α基因表達量表現(xiàn)出先下降再升高的趨勢。其中低溫處理2 h時，基因表達量顯著下調(diào)，較CK下降了70%，當處理10 h后，CsEF-1α基因表達量升高，與CK幾乎一致。干旱脅迫2 h后，CsEF-1α基因表達量較CK下降了40%。處理10 h，該基因表達量與CK一致。高溫脅迫2 h后，CsEF-1α基因表達量較CK下降了30%。表明CsEF-1α基因參與了香菜對非生物脅迫的應答，在香菜生長發(fā)育和非生物脅迫中具有重要調(diào)控作用。

不同小寫字母表示基因在同一脅迫處理不同時間的基因表達差異顯著(P<0.05)圖8 CsEF-1α基因在不同非生物脅迫條件下的表達分析Different normal letters indicate significant difference of gene expression levels at different time points under same stress (P<0.05)Fig.8 Expression analysis of CsEF-1α gene under different abiotic stress conditions

3 討 論

EF-1α參與植物體內(nèi)蛋白質(zhì)的生物合成，同時是構成細胞骨架的一種高度保守蛋白，在細胞中發(fā)揮著重要作用[20-21]。EF-1α參與植物生長發(fā)育，且植物間EF-1α在非生物脅迫下表達模式有所差異。本研究中獲得的香菜CsEF-1α基因，編碼的蛋白序列中賴氨酸數(shù)量最多。有研究表明，EF-1α與玉米胚乳賴氨酸含量高度相關，在高粱和大麥中同樣如此[22]。本研究推測CsEF-1α可能與賴氨酸關系密切。CsEF-1α與其他EF-1α保守型較高，表明植物間在進化過程中具有較高的保守性，暗示EF-1α基因可能具有相似性。

為了解CsEF-1α的功能，對該基因啟動子序列進行了系統(tǒng)的分析。結果發(fā)現(xiàn)CsEF-1α含4種植物生長發(fā)育元件、3種激素響應元件和3種脅迫響應元件，推斷該基因可能參與生長發(fā)育的調(diào)控網(wǎng)絡，并能夠?qū)δ婢趁{迫作出應答。因此，結合qPCR分別檢測了香菜中CsEF-1α基因在不同發(fā)育時期和非生物脅迫下的表達情況。CsEF-1α基因隨著發(fā)育時期呈現(xiàn)不斷升高趨勢。其中在30～60 d時，CsEF-1α基因表達量快速升高，與棉花纖維早期發(fā)育中的GhEF-1α基因表達結果研究一致[23]。推測香菜在此生長階段，體內(nèi)細胞數(shù)量分裂和體積膨大速度加快，需要誘導大量的延伸因子來翻譯合成蛋白質(zhì)，滿足香菜形態(tài)建成和能量代謝。在生長期60～90 d時，CsEF-1α表達量緩慢上升，可能由于香菜此階段生長緩慢并趨于成熟，蛋白質(zhì)合成速度變慢，延伸因子需求量降低。由此可見，EF-1α可與蛋白質(zhì)互作，參與植物細胞骨架的形成及生長發(fā)育蛋白質(zhì)的合成。

香菜CsEF-1α基因響應4種非生物脅迫且表達模式有所差異，尤其能夠響應低溫和鹽脅迫，這與Li等[24]在鹽脅迫中能夠明顯誘導水稻EF-1α基因和張妮[25]對香蕉苗脅迫處理研究結果相似。早期有報道稱EF-1α在大麥和玉米中表達與冷脅迫相關[26-27]。Chung等[28]利用減法抑制雜交技術分離出低溫、高鹽或干旱脅迫誘導的大豆EF-1α基因，認為EF-1α可能在非生物脅迫下的翻譯調(diào)控中發(fā)揮重要作用。孫偉等[29]發(fā)現(xiàn)鹽地堿蓬SsEF-1α基因可以被高鹽、高滲和低溫脅迫等條件誘導。綜上，在其他植物中EF-1α基因在非生物脅迫下均會被誘導表達，這和本研究結果有一定的相似。有研究表明，當植物受到逆境脅迫時，可能通過誘導或降低基因的表達量來控制蛋白的活性，以緩解或提高對逆境脅迫的抵抗能力[30-32]。以上結果推測CsEF-1α基因參與了香菜的非生物脅迫，這可能是由于香菜受到逆境脅迫后，細胞為了抵御脅迫帶來的傷害會及時調(diào)整細胞內(nèi)基因組的表達結構，啟動子響應非生物脅迫元件來調(diào)控CsEF-1α基因的表達，影響轉(zhuǎn)錄水平或mRNA的穩(wěn)定性，在細胞內(nèi)短期大量合成多種抗逆蛋白，從而參與植物的各種防衛(wèi)反應，并調(diào)節(jié)植物的各個生長發(fā)育階段和代謝功能。但該基因在香菜中生長發(fā)育以及逆境脅迫中的作用機制仍需進一步探究。綜上所述，EF-1α基因?qū)ο悴税l(fā)育和抗逆性具有重要意義，為提高香菜品質(zhì)和抗逆性提供理論依據(jù)。