張澤鑫，余佳蓓，林思其，劉紫鳳，陳林靜，陳栩靜，陳祎琦

1 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣州5100062；2 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院

肺腺癌(LUAD)是非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)中最常見的病理類型，五年生存率僅為4%～17%，預(yù)后不佳[1]。LUAD的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因共同參與、多因素共同作用、多階段進(jìn)展的復(fù)雜生物學(xué)過程，深入研究LUAD的分子機(jī)制是提高NSCLC診療效果的基礎(chǔ)。中藥抗腫瘤藥復(fù)方紅豆杉膠囊可用于治療LUAD，研究顯示，其有抗炎、增強(qiáng)免疫力的作用，對(duì)LUAD細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，但具體作用機(jī)制尚不明確[2]。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(WGCNA)分析是一種系統(tǒng)生物學(xué)方法，用來描述基因間的相關(guān)模式，其可利用系統(tǒng)生物學(xué)的思想尋找基因之間表達(dá)的相似性，并將表達(dá)高度相關(guān)的基因確定為一個(gè)基因模塊。2021年3月—4月，本研究將WGCNA用于LUAD表達(dá)譜數(shù)據(jù)的分析，篩選出復(fù)方紅豆杉膠囊治療LUAD的有效成分及核心靶點(diǎn)，并通過GO功能富集和KEGG通路富集分析其作用機(jī)制，以期為L(zhǎng)UAD的診斷和治療提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 復(fù)方紅豆杉膠囊活性成分及作用靶點(diǎn)篩選 通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php)檢索復(fù)方紅豆杉膠囊關(guān)鍵成分紅豆杉、紅參、甘草的活性成分及相關(guān)作用靶點(diǎn)，根據(jù)口服利用度(OB)≥30%、化合物類藥性(DL)≥0.18進(jìn)行篩選。由于TCMSP中沒有收錄紅豆杉的相關(guān)活性成分，因此使用中藥分子機(jī)制的生物信息學(xué)分析數(shù)據(jù)庫(kù)(BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/)對(duì)紅豆杉的藥物活性成分進(jìn)行補(bǔ)充。使用R語(yǔ)言(3.6.1)對(duì)活性成分和作用靶點(diǎn)進(jìn)行配對(duì)。

1.2 LUAD差異表達(dá)基因共表達(dá)模塊篩選 從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載TCGA-LUAD的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)，從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gds)下載LUAD表達(dá)譜(GSE83227)的基因芯片數(shù)據(jù)。從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得59個(gè)正常樣本和535個(gè)LUAD樣本；GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得33個(gè)正常樣本和32個(gè)LUAD樣本。通過R語(yǔ)言的RPKM函數(shù)和WGCNA包，篩選出具有RPKM值的基因，對(duì)基因表達(dá)量進(jìn)行規(guī)范。使用函數(shù)pickSoftThreshold選擇軟閾值β=5和18以建立無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)，通過公式AIJ=|SIJ|β(AIJ：基因I與基因J之間的鄰接矩陣，SIJ：通過所有基因?qū)Φ钠栠d相關(guān)性獲得的相似性矩陣)并轉(zhuǎn)換為拓?fù)渲丿B矩陣(TOM)及其相關(guān)的相似度(1-tom)。為了將相似的表達(dá)基因分為不同的共表達(dá)模塊，構(gòu)建了1-tom矩陣的層次聚類樹，聚類樹中表達(dá)具有高度相關(guān)性的基因確定為一個(gè)基因模塊，分別用不同的顏色表示。為了篩選正常樣本和腫瘤樣本之間差異最大的基因模塊，我們將其與數(shù)據(jù)的臨床特征進(jìn)行了整合分析，通過繪制基因模塊和臨床特征之間的相關(guān)熱圖來評(píng)估每個(gè)模塊與正常樣本和腫瘤樣本的臨床特征之間的相關(guān)性，選擇相關(guān)性差異最大的基因模塊進(jìn)行后續(xù)研究。

1.3 復(fù)方紅豆杉膠囊治療LUAD的加權(quán)共表達(dá)基因篩選 通過R語(yǔ)言的VennDiagram包對(duì)復(fù)方紅豆杉膠囊活性成分治療靶點(diǎn)、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)及GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)性差異最大的基因模塊進(jìn)行相互映射，取交集獲得復(fù)方紅豆杉膠囊治療LUAD的加權(quán)共表達(dá)基因，并使用Cytoscape3.7.2繪制加權(quán)共表達(dá)基因的藥物—化合物—靶點(diǎn)圖。

1.4 加權(quán)共表達(dá)基因的功能與作用通路分析 使用R語(yǔ)言中的ClusterProfiler軟件包對(duì)復(fù)方紅豆杉膠囊治療LUAD的加權(quán)共表達(dá)基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，以篩選出復(fù)方紅豆杉膠囊治療LUAD相關(guān)的生物信息學(xué)過程。以上篩選過程設(shè)定過濾條件為pvalue Filter=0.05，qvalue Filter=1。

1.5 復(fù)方紅豆杉膠囊治療LUAD核心靶基因的篩選與驗(yàn)證 使用R語(yǔ)言的survival包對(duì)TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行生存分析并通過Kaplan-Meier單變量生存分析圖進(jìn)行展示，其中，藍(lán)色曲線代表基因低表達(dá)患者，紅色曲線代表基因高表達(dá)患者，以P值代表該基因在高、低表達(dá)患者中是否存在顯著性差異，秩數(shù)檢驗(yàn)P<0.05的加權(quán)共表達(dá)基因被認(rèn)為是與生存時(shí)間顯著相關(guān)的加權(quán)共表達(dá)基因，即復(fù)方紅豆杉膠囊治療LUAD的核心靶基因。將篩選出的復(fù)方紅豆杉膠囊治療LUAD的核心靶基因直接導(dǎo)入到HPA數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.proteinatlas.org/)中，驗(yàn)證其在正常肺組織和LUAD組織中的表達(dá)是否具有差異。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方紅豆杉膠囊活性成分及作用靶點(diǎn)篩選結(jié)果 共得到復(fù)方紅豆杉膠囊活性成分141個(gè)(甘草92個(gè)、紅參4個(gè)、紅豆杉45個(gè))，去重后作用靶點(diǎn)356個(gè)(甘草335個(gè)、紅參20個(gè)、紅豆杉271個(gè))。

2.2 LUAD差異表達(dá)基因共表達(dá)模塊篩選結(jié)果 排除未分配給任何功能組的灰色模塊后，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中共得到15個(gè)基因共表達(dá)模塊，GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中共得到5個(gè)基因共表達(dá)模塊(OSID碼圖1、2)。繪制基因模塊和臨床特征之間的相關(guān)熱圖可見，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中的綠松石色模塊(正常樣本r=0.77，LUAD樣本r=-0.77，P=9E-119)及GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中的綠松石色模塊(正常樣本r=0.88，LUAD樣本r=-0.88，P=5E-22)相關(guān)性差異最明顯，分別包含了6 587、649個(gè)基因(OSID碼圖3、4)。

2.3 復(fù)方紅豆杉膠囊治療LUAD的加權(quán)共表達(dá)基因篩選結(jié)果 將復(fù)方紅豆杉膠囊活性成分治療靶點(diǎn)、GEO數(shù)據(jù)庫(kù)綠松石色基因、TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)綠松石色基因取交集，共得到復(fù)方紅豆杉膠囊治療LUAD的加權(quán)共表達(dá)基因14個(gè)，分別為L(zhǎng)DLR、FOS、IL6、CAV1、TUBB3、TUBB6、MCL1、CA2、JUN、SLC6A4、CD36、ALDH1A1、MAOB、TFAP2C。通過繪制加權(quán)共表達(dá)基因的藥物—化合物—靶點(diǎn)圖可見，紅豆素A(Taxumain A)和紫杉?jí)A(Taxinine)為復(fù)方紅豆杉膠囊治療LUAD的主要活性成分。見OSID碼圖5。

2.4 加權(quán)共表達(dá)基因的功能與作用通路分析結(jié)果 對(duì)14個(gè)加權(quán)共表達(dá)基因進(jìn)行GO功能和KEGG通路富集分析，GO功能分析顯示，復(fù)方紅豆杉膠囊治療LUAD的主要生物過程為有機(jī)羥基化合物轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對(duì)脂多糖的反應(yīng)等，主要細(xì)胞成分為內(nèi)吞囊泡膜、內(nèi)吞囊泡、膜筏等，主要分子功能為低密度脂蛋白顆粒受體活性、一氧化氮合酶結(jié)合、脂蛋白顆粒受體活性等；KEGG通路分析顯示，復(fù)方紅豆杉膠囊治療LUAD可能通過致病性大腸桿菌感染、朊病毒病、苯丙胺成癮等通路發(fā)揮作用。見OSID碼圖6、7。

2.5 復(fù)方紅豆杉膠囊治療LUAD核心靶基因的篩選與驗(yàn)證 Kaplan-Meier單變量生存分析圖顯示，

CAV1基因?yàn)閺?fù)方紅豆杉膠囊治療LUAD的核心靶基因(P<0.009)。見OSID碼圖8。HPA數(shù)據(jù)庫(kù)中免疫組織化學(xué)染色顯示，CAV1在肺正常組織中染色中等(quantity:75%～25%)，在LUAD組織中無染色(quantity：None)。見OSID碼圖8。

3 討論

LUAD是最致命的惡性腫瘤之一，可分為原位癌、微浸潤(rùn)性腺癌和浸潤(rùn)性腺癌，其起源細(xì)胞和進(jìn)展階段尚不明確。LUAD的全球發(fā)病率為31.5%，病死率為27.1%，且發(fā)病率逐年增加[3]。目前LUAD的治療方法主要包括手術(shù)、放化療、微波消融等，盡管治療方法很多，但其治療效果仍然有限，預(yù)后不佳。因此，深入研究治療LUAD的關(guān)鍵基因、關(guān)鍵信號(hào)通路，了解基因之間的調(diào)控機(jī)制對(duì)于LUAD的治療具有重要意義。

本研究結(jié)果顯示，復(fù)方紅豆杉膠囊中共有141個(gè)候選化合物，其中治療LUAD最主要的活性成分是Taxumain A和Taxinine。Taxumain A是一種有毒的蛋白質(zhì)，也是一種Ⅱ型核糖體失活蛋白[4]。其可以通過修飾真核延伸因子2(eEF-2)或破壞28 S rRNA來不可逆地直接失活核糖體，并可間接通過修飾參與蛋白質(zhì)合成翻譯的因子來抑制蛋白質(zhì)合成，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞壞死或細(xì)胞調(diào)亡，導(dǎo)致LUAD細(xì)胞死亡[5]。Taxinine是紫杉醇的中間體，對(duì)LUAD細(xì)胞具有細(xì)胞毒性[6]。此外，Taxinine也是紅豆杉的抗血小板成分，具有抗血小板聚集的作用。其一方面可以抑制血小板調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞和腫瘤的微環(huán)境，促進(jìn)自然殺傷細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞[7]；另一方面也可以抑制血小板促進(jìn)腫瘤血管生成，減少腫瘤細(xì)胞增殖，增加腫瘤壞死，從而影響腫瘤的生長(zhǎng)[8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，復(fù)方紅豆杉膠囊在治療LUAD中具有14個(gè)加權(quán)共表達(dá)基因，其中最主要的核心基因?yàn)镃AV1。CAV1是一種多功能膜蛋白，在癌癥中起著雙重作用。其在癌癥的早期階段表現(xiàn)為抑癌基因，對(duì)腫瘤的抑制功能是由其最主要的功能結(jié)構(gòu)域腳手架區(qū)域(CSD)介導(dǎo)的[9]。CAV1的CSD可與各種信號(hào)蛋白分子相互作用，抑制其蛋白活性，從而抑制該信號(hào)途徑[10]。CAV1的表達(dá)水平受生長(zhǎng)因子刺激負(fù)調(diào)控，重組過表達(dá)CAV1可以通過介導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期來抑制細(xì)胞增殖[11]。但是，CAV1在晚期癌癥和癌癥轉(zhuǎn)移中起到腫瘤啟動(dòng)子的作用[12]。通過生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)CAV1的絡(luò)氨酸(Tyr14)和絲氨酸(Ser80)磷酸化以及膽固醇結(jié)合到CAV1基因啟動(dòng)子上，引起的CAV1的上調(diào)表達(dá)，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲并參與各種細(xì)胞代謝以維持癌細(xì)胞生存[13]。此外，有研究顯示，CAV1的高表達(dá)可導(dǎo)致治療耐藥性，這也是導(dǎo)致LUAD臨床預(yù)后不良的原因之一[14]。

GO功能分析可以提供涉及相關(guān)基因的生物學(xué)過程、細(xì)胞組成和分子功能，并幫助研究人員了解疾病的發(fā)病機(jī)制或藥物機(jī)理。通過GO分析，我們發(fā)現(xiàn)復(fù)方紅豆杉膠囊可調(diào)節(jié)有機(jī)羥基化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)，有利于抗癌增殖。研究顯示，有機(jī)羥基化合物可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來實(shí)現(xiàn)抗增殖活性，對(duì)LUAD上皮細(xì)胞具有抗增殖作用，這與我們的研究結(jié)果一致[15]。我們還發(fā)現(xiàn)，復(fù)方紅豆杉膠囊在治療LUAD時(shí)主要在內(nèi)吞囊泡膜發(fā)揮作用并可調(diào)節(jié)低密度脂蛋白顆粒受體的活性。研究顯示，載脂蛋白顆粒可以通過低密度脂蛋白顆粒受體進(jìn)入細(xì)胞，從而抑制炎癥，增強(qiáng)人體的免疫防御能力[16]。KEGG通路分析顯示，共有30條KEGG富集通路，其中致病性大腸桿菌感染信號(hào)傳導(dǎo)途徑富集的基因最多。相關(guān)報(bào)道顯示，致病性大腸桿菌感染可引起炎癥和產(chǎn)生活性氧[17]。炎癥能夠增強(qiáng)大腸桿菌在腸道微生物群中的彈性，從而增強(qiáng)大腸桿菌的促癌活性[18]。大腸桿菌誘導(dǎo)了氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激參與了癌變過程。細(xì)胞正常氧化還原狀態(tài)的紊亂會(huì)產(chǎn)生過氧化物和自由基，破壞包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和DNA在內(nèi)的細(xì)胞成分，從而引起毒性作用。此外，致病性大腸桿菌產(chǎn)生的毒素可干擾真核細(xì)胞的細(xì)胞周期或誘導(dǎo)DNA損傷，并影響正常細(xì)胞的分化、凋亡和增殖，進(jìn)而導(dǎo)致LUAD的發(fā)生發(fā)展[19]。

綜上所述，本研究通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)和BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)篩選出復(fù)方紅豆杉膠囊的活性成分及作用靶點(diǎn),并將WGCNA用于LUAD表達(dá)譜數(shù)據(jù)的分析，篩選出14個(gè)復(fù)方紅豆杉膠囊治療LUAD的加權(quán)共表達(dá)基因，這些加權(quán)共表達(dá)基因的主要功能為有機(jī)羥基化合物的轉(zhuǎn)運(yùn)、調(diào)節(jié)低密度脂蛋白顆粒受體的活性等，主要作用通路為致病性大腸桿菌感染信號(hào)傳導(dǎo)途徑。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，復(fù)方紅豆杉膠囊治療LUAD的主要的活性成分為Taxumain A、Taxinine，核心靶基因?yàn)镃AV1，其可以作為治療LUAD的關(guān)鍵活性成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)，為L(zhǎng)UAD的診療提供新的策略。