梁殿迅 王秋宇 姜 平 李和麗 朱軍義 許 靜 郭 哲 孫慧霞

（南陽市中心醫(yī)院，南陽 473000）

宮頸癌是婦女常見惡性腫瘤，晚期患者生存率仍然很低，因此，尋找新的治療靶點(diǎn)對(duì)宮頸癌的治療具有重要意義[1-2]。RAD51相關(guān)蛋白1（RAD51-associated protein 1，RAD51AP1）是一種能激活同源重組蛋白R(shí)AD51的DNA結(jié)合蛋白，可調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖與DNA修復(fù)[3]。研究顯示[4]，RAD51AP1在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）中上調(diào)表達(dá)，沉默RAD51AP1可抑制NSCLC的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）和轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）/SMAD通路在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起著重要調(diào)控作用，TGF-β/Smad 通路的激活可促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖與遷移[5]。本研究探討RAD51AP1對(duì)SiHa細(xì)胞增殖及TGF-β/Smad 通路的影響，初步探索RAD51AP1對(duì)SiHa細(xì)胞的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞與試劑

人正常宮頸上皮細(xì)胞（HUCEC）及宮頸癌Caski、Hela、C-33A、SiHa細(xì)胞系購自美國ATCC公司；人重組TGF-β1（規(guī)格1 mg）購自 HUICH公司；LY2109761（純度≥99%）購自Aladdin公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒、DMEM培養(yǎng)液和胰酶購自美國Invitorgen公司；噻唑藍(lán)（MTT）試劑盒購自美國Sigma公司；RAD51AP1、TGF-β1及內(nèi)參GAPDH引物由上海生工生物工程科技有限公司設(shè)計(jì)與合成；抑制RAD51AP1表達(dá)（si-RAD51AP1）及其陰性對(duì)照（si-NC）質(zhì)粒由廣州銳博生物有限公司構(gòu)建；Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒、RIPA裂解液購自碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗人RAD51AP1、TGF-β1、p-SMAD2、p-SMAD3、cyclin D1、Bax、caspase-3、cleaved caspase 3抗體購自英國Abcam公司。

1.2 標(biāo)本來源

選 取2018年7月至2021年3月間河南省南陽市中心醫(yī)院手術(shù)治療的51例宮頸癌患者為研究對(duì)象，年齡37~75歲，平均年齡（49.50±9.20）歲。手術(shù)過程中取宮頸癌組織及相應(yīng)癌旁組織。51例患者中32例為鱗狀細(xì)胞癌，19例為腺癌。

1.3 免疫組織化學(xué)檢測宮頸癌組織與癌旁組織RAD51AP1蛋白表達(dá)

宮頸癌組織與癌旁組織標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋后切片，經(jīng)過二甲苯脫蠟，0.01 mol/L枸緣酸緩沖液抗原修復(fù)和封閉后，加入兔抗人RAD51AP1多克隆抗體（1∶500），室溫孵育4 h，再加入相應(yīng)二抗（1∶1 000），室溫孵育1 h，DAB染色，顯微鏡觀察。染色結(jié)果判斷：RAD51AP1主要定位于細(xì)胞核，根據(jù)陽性細(xì)胞數(shù)和染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分。陽性細(xì)胞率＜5%、5%~25%、26%~50%、51%~75%、＞75%，分別記為0、1、2、3、4分；根據(jù)細(xì)胞染色強(qiáng)度，棕褐色為3分，棕黃色為2分，淡黃色為1分，無染色為0分。將兩項(xiàng)評(píng)分相乘：得分為0或1分為陰性（-），2~3分為弱陽性（+），4~6分為中陽性（++），6分以上為強(qiáng)陽性（+++）。

1.4 免疫印跡檢測宮頸癌細(xì)胞RAD51AP1蛋白表達(dá)及細(xì)胞分組

宮頸癌Caski、Hela、C-33A、SiHa細(xì)胞與人正常宮頸上皮細(xì)胞（HUCEC）接種于6孔板，培養(yǎng)48 h后，提取細(xì)胞總蛋白，免疫印跡檢測細(xì)胞中RAD51AP1蛋白表達(dá)，篩選RAD51AP1高表達(dá)宮頸癌細(xì)胞系。

收集對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，將SiHa細(xì)胞分為對(duì)照組、si-RAD51AP1組、si-NC組、抑制劑組、si-RAD51AP1+激活劑組，si-RAD51AP1組。si-NC組使用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒分別轉(zhuǎn)染si-RAD51AP1、si-NC質(zhì)粒，抑制劑組使用10 μmol/L的LY2109761處 理24 h，si-RAD51AP1+激 活 劑組轉(zhuǎn)染si-RAD51AP1質(zhì)粒同時(shí)使用10 ng/mL的人重組TGFβ1處理24 h。TGF-β/Smad通路抑制劑LY2109761與激活劑人重組TGFβ1濃度參照文獻(xiàn)[6]中所用濃度。

1.5 MTT法檢測細(xì)胞增殖活性

各組處理的SiHa細(xì)胞以每孔5×104個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中，分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 μL濃度為5 mg/mL的MTT溶液，反應(yīng)4 h后，DMSO溶液終止反應(yīng)，于酶標(biāo)儀波長490 nm處測定各孔光密度（OD）值，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

各組處理的SiHa細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×105/mL，加 入200 μL的binding buffer重懸細(xì)胞，分別加入5 μL的Annexin V-FITC與10 μL的PI混勻，避光孵育20 min，上流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7 平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖

取對(duì)數(shù)生長期的各組SiHa細(xì)胞，制備細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)皿中，置于37℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2~3 d觀察細(xì)胞形態(tài)，待培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。多聚甲醛溶液固定20 min，結(jié)晶紫染色10 min，顯微鏡觀察并拍照，計(jì)算克隆形成率。

1.8 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測細(xì)胞RAD51AP1及TGF-β1 mRNA水平

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測各組細(xì)胞中RAD51AP1、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。TRIzol試劑提取各組細(xì)胞總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。RAD51AP1上游引物序列為5'-ATGACAAGCTCTACCAGAGAGAC-3'，下游引物序列為5'-CACATTAGTGGTGACTGTTGGAA- 3'；TGF-β1上游引物序列為5'-CTGCAAGACTATC GACATGG-3'，下游引物序列為5'-AATGGTGGAA ACCCACAACG-3'；GAPDH上游引物序列為5'-AA TGGGCAGCCGTTAGGAAA-3'，下游引物序列為5'-GCGCCCAATACGACCAAATC-3'。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct法 計(jì) 算RAD51AP1、TGF-β1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.9 免疫印跡檢測細(xì)胞中RAD51AP1蛋白、TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白及增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

提取各組SiHa細(xì)胞總蛋白，取適量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，使用含5% BSA的TBST緩沖液封閉1 h，分別加入稀釋后的兔抗人RAD51AP1、TGF-β1、p-SMAD2、p-SMAD3、cyclin D1、Bax、caspase-3、cleaved caspase 3和β-actin抗體，4℃孵育過夜加入二抗，4℃孵育6 h，ECL液顯色，以β-actin為內(nèi)參，采用Image J軟件分析各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.1 0 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RAD51AP1蛋白在宮頸癌組織與癌旁組織的表達(dá)

免疫組織化學(xué)顯色結(jié)果顯示，RAD51AP1主要定位于宮頸癌組織中的細(xì)胞核，癌旁組織陽性率為25.49%，宮頸癌組織中陽性率為72.55%，宮頸癌組織的陽性率顯著高于癌旁組織（P＜0.05）（圖1，表1）。

圖1 RAD51AP1蛋白在癌旁組織（A）與宮頸癌組織（B）的表達(dá)，×200。 標(biāo)尺=50 μm

表1 RAD51AP1蛋白在宮頸癌組織與癌旁組織的表達(dá)（n=51）

2.2 RAD51AP1蛋白在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)

與HUCEC細(xì)胞（0.21±0.03）比較，Caski（0.72±0.05）、Hela（0.93±0.08）、C-33A（0.88±0.06）、SiHa（1.09±0.12）4種宮頸癌細(xì)胞系中RAD51AP1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），其中SiHa細(xì)胞中RAD51AP1蛋白表達(dá)水平最高，故選擇SiHa細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖2）。

圖2 RAD51AP1在宮頸癌細(xì)胞系中的表達(dá)

2.3 RAD51AP1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖與凋亡的影響

與對(duì)照組比較，si-RAD51AP1組與抑制劑組細(xì)胞增殖活性與cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率、Bax、caspase-3、cleaved caspase 3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與si-RAD51AP1組比較，si-RAD51AP1+激活劑組細(xì)胞增殖活性與cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞凋亡率、Bax、caspase-3、cleaved caspase 3蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），表明抑制RAD51AP1的表達(dá)或使用TGF-β/Smad 通路抑制劑LY2109761均可顯著抑制SiHa細(xì)胞增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而使用si-RAD51AP1和TGF-β/Smad 通路激活劑共同處理細(xì)胞可部分逆轉(zhuǎn)以上變化（圖3~5，表2）。

圖3 各組SiHa細(xì)胞增殖活性檢測結(jié)果

圖4 RAD51AP1對(duì)SiHa細(xì)胞cyclin D1、Bax、caspase-3、cleaved caspase 3蛋白表達(dá)的影響

表2 RAD51AP1對(duì)SiHa細(xì)胞增殖及凋亡的影響（n=6，±s）

表2 RAD51AP1對(duì)SiHa細(xì)胞增殖及凋亡的影響（n=6，±s）

*P＜0.05 vs對(duì)照組；△P＜0.05 vs si-NC組；#P＜0.05 vs si-RAD51AP1組

組別 凋亡率（%） Cyclin D1 Bax Caspase-3 Cleaved caspase 3 RAD51AP1對(duì)照組 4.05±0.87 1.03±0.12 0.33±0.03 0.43±0.04 0.21±0.03 1.05±0.12 si-NC組 3.67±0.82 1.01±0.13 0.34±0.04 0.45±0.06 0.23±0.04 1.07±0.11 si-RAD51AP1組 25.31±2.43*△ 0.41±0.05*△ 0.98±0.10*△ 1.04±0.13*△ 0.85±0.10*△ 0.31±0.04*△抑制劑組 28.33±3.06* 0.35±0.04* 1.05±0.11* 1.00±0.12* 0.81±0.08* 1.03±0.11 si-RAD51AP1+激活劑組 11.54±2.04# 0.91±0.09# 0.57±0.06# 0.65±0.08# 0.51±0.05# 0.34±0.03

2.4 RAD51AP1對(duì)SiHa細(xì)胞克隆形成能力的影響

與對(duì)照組[（57.26±4.36）%]比較，si-RAD51AP1組[（32.42±3.79）%]與抑制劑組[（30.50±3.21）%]細(xì) 胞 克 隆 形 成 率 顯 著降低（P＜0.05）；與si-RAD51AP1組比較，si-RAD51AP1+激活劑組[（45.41±4.05）%]細(xì)胞克隆形成率顯著升高（P＜0.05）（圖6）。

圖6 各組SiHa細(xì)胞克隆形成圖

2.5 RAD51AP1對(duì)SiHa細(xì)胞中TGF-β/Smad通路的影響

與對(duì)照組比較，si-RAD51AP1組與抑制劑組細(xì)胞TGF-β1、p-SMAD2、p-SMAD3蛋 白 表 達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與si-RAD51AP1組比較，si-RAD51AP1+激活劑組細(xì)胞TGF-β1、p-SMAD2、p-SMAD3蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），表明RAD51AP1可調(diào)控TGF-β/Smad 通路蛋白（圖7，表3）。

圖7 RAD51AP1對(duì)SiHa細(xì)胞TGF-β1、p-SMAD2、 p-SMAD3蛋白表達(dá)的影響

3 討論

RAD51AP1是DNA同源重組修復(fù)的關(guān)鍵蛋白，已有研究報(bào)道，RAD51AP1在肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中異常表達(dá)[7-8]。Zhao等[9]研究表明，卵巢癌中RAD51AP1上調(diào)表達(dá)，與卵巢癌分期高和患者預(yù)后不良有關(guān)，在體外下調(diào)RAD51AP1表達(dá)可抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力。本研究結(jié)果顯示，RAD51AP1在宮頸癌組織與細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，提示RAD51AP1與宮頸癌的發(fā)生有關(guān)。研究顯示[10]，RAD51AP1基因在管腔雌激素受體陽性乳腺癌和三陰性乳腺癌中表達(dá)上調(diào)，與預(yù)后不良有關(guān)。在乳腺癌基因工程小鼠模型中，敲除RAD51AP1基因可減少腫瘤生長和相關(guān)肺轉(zhuǎn)移，表明抑制RAD51AP1表達(dá)可抑制腫瘤生長與轉(zhuǎn)移。另外，還有研究表明，結(jié)直腸癌中RAD51AP1表達(dá)上調(diào)，可通過調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌干細(xì)胞（CRCSC）自我更新促進(jìn)腫瘤生長與化療耐藥性[11]。本研究結(jié)果顯示，抑制RAD51AP1表達(dá)后，細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞克隆形成率與cyclin D1蛋白表達(dá)水平顯著降低，細(xì)胞凋亡率、Bax、caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明抑制RAD51AP1表達(dá)可抑制SiHa細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，但RAD51AP1對(duì)SiHa細(xì)胞的作用機(jī)制尚不清楚。

表3 RAD51AP1對(duì)SiHa細(xì)胞TGF-β/Smad 通路蛋白表達(dá)的影響（n=6，±s）

表3 RAD51AP1對(duì)SiHa細(xì)胞TGF-β/Smad 通路蛋白表達(dá)的影響（n=6，±s）

*P＜0.05 vs對(duì)照組；△P＜0.05 vs si-NC組；#P＜0.05 vs si-RAD51AP1組

組別 TGF-β1 p-SMAD2 p-SMAD3對(duì)照組 0.98±0.11 1.01±0.10 0.95±0.09 si-NC組 1.00±0.13 1.05±0.11 0.97±0.10 si-RAD51AP1組 0.31±0.04*△ 0.37±0.05*△ 0.40±0.06*△抑制劑組 0.27±0.03* 0.35±0.04* 0.43±0.05*si-RAD51AP1+激活劑組 0.93±0.10# 0.85±0.08# 0.90±0.09#

TGF-β信號(hào)通路在調(diào)控腫瘤的生長中發(fā)揮重要作用，也與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲有關(guān)。TGF-β有多種亞型，其中人TGF-β1定位于染色體19q3，可誘導(dǎo)腫瘤免疫逃逸、促進(jìn)血管生成和EMT。Smads蛋白是TGF-β的直接作用底物，其中Smad2/3介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)，在轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中被磷酸化，參與TGF-β信號(hào)通路[12]。TGF-β1/Smads通路參與肝癌、NSCLC等多種腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡[13-14]。Chen等[15]研究表明，LncRNA FOXD3-AS1通過上調(diào)miR-296-5p和抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路活化，抑制甲狀腺癌細(xì)胞增殖與侵襲。陳春苗等[16]研究表明，在TGF-β1誘導(dǎo)的人肝癌HepG2細(xì)胞中，小檗堿可能通過抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路，抑制HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲及EMT進(jìn)程。本研究發(fā)現(xiàn)，SiHa細(xì)胞轉(zhuǎn)染si-RAD51AP1或使用TGF-β抑制劑處理后，TGF-β1、p-SMAD2、p-SMAD3蛋白表達(dá)水平顯著減低，提示抑制RAD51AP1表達(dá)與TGF-β/Smad 通路抑制劑的作用效果類似，抑制RAD51AP1表達(dá)可抑制TGF-β/Smad 通路。而使用si-RAD51AP1與TGF-β激活劑共同處理細(xì)胞后，與單獨(dú)使用si-RAD51AP1相 比，細(xì) 胞 中TGF-β1、p-SMAD2、p-SMAD3蛋白表達(dá)水平顯著升高，細(xì)胞增殖活性、細(xì)胞克隆形成率升高，凋亡率降低，證實(shí)抑制RAD51AP1表達(dá)可通過抑制TGF-β/Smad 通路，抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示通過抑制RAD51AP1表達(dá)可能抑制宮頸癌腫瘤的生長，這為宮頸癌的治療提供了一個(gè)方向。研究顯示[17]，BRD4抑制劑可通過抑制RAD51AP1轉(zhuǎn)錄增加宮頸癌對(duì)放療的敏感性，提示RAD51AP1可能在在宮頸癌治療中發(fā)揮一定的作用。本研究接下來將結(jié)合動(dòng)物模型，研究RAD51AP1對(duì)宮頸癌的抑制作用，為宮頸癌的診治提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述，RAD51AP1在宮頸癌中表達(dá)上調(diào)，抑制RAD51AP1表達(dá)可通過抑制TGF-β/Smad通路抑制宮頸癌生長。