劉紫微，王振亮，王 兵

(1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，鄭州 450046；2.鄭州西亞斯學(xué)院，鄭州 451100；3.湖北省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，武漢 430000)

氧化應(yīng)激-炎癥-衰老又稱氧化性炎癥衰老，由De La Fuente提出[1]。免疫-氧化應(yīng)激-炎癥于衰老至關(guān)重要，與年齡關(guān)聯(lián)的免疫功能變化以氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)為基礎(chǔ)，兩者在維系機(jī)體穩(wěn)態(tài)的免疫反應(yīng)過(guò)程中聯(lián)系緊密[1，2]。經(jīng)研究，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)參與許多衰老相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展的病理過(guò)程，心血管疾病、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病以及癌癥等病因皆與氧化應(yīng)激引起的免疫應(yīng)答效應(yīng)有關(guān)[3]，因其導(dǎo)致的免疫細(xì)胞衰老最為明顯，免疫功能下降是其重要表現(xiàn)之一，攝入抗氧化劑可以改善氧化性炎癥衰老的免疫系統(tǒng)功能[1，2,4]。

本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合自由基防御系統(tǒng)(anti-oxidative defense systems，ADS)與免疫系統(tǒng)(immune system)，通過(guò)研究當(dāng)歸四逆湯對(duì)亞急性衰老大鼠學(xué)習(xí)與記憶能力、臟器指數(shù)以及血清中谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)、總抗氧化能力(total anti-oxidation capability，T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-2、IL-6以及IL-10的影響，探討當(dāng)歸四逆湯調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激-炎癥-衰老的免疫系統(tǒng)功能的作用機(jī)理，旨在為中醫(yī)藥提高氧化性炎癥衰老的免疫系統(tǒng)功能提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究通過(guò)河南中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批號(hào)DWLL201805302)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)6 周齡SD雌性大鼠24只，體質(zhì)量150～160 g，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)許可證號(hào)SCXK(魯)20140007，由濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司提供。動(dòng)物飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)室，喂養(yǎng)環(huán)境為晝夜循環(huán)比(12 h∶12 h)，溫度(20±2 ℃)，濕度(50±5)%。

1.2 藥物及制備

當(dāng)歸四逆湯方組成：當(dāng)歸12 g，桂枝9 g，白芍9 g，炙甘草6 g，細(xì)辛3 g，通草6 g，大棗24 g，質(zhì)量為69 g/劑，對(duì)應(yīng)的中藥免煎顆粒劑量為7.5 g/劑，由華潤(rùn)三九公司生產(chǎn)；維生素E(VE)由大連美侖生物技術(shù)有限公司提供。以大鼠與70 kg成人體表面積折算系數(shù)為0.018換算，當(dāng)歸四逆湯給藥劑量為0.675 g·kg-1·d-1，VE給藥劑量為200 mg·kg-1·d-1。

1.3 主要試劑及儀器

D-半乳糖(D-dlactose，D-gal，默克Sigma-Aldrich中國(guó)公司，貨號(hào)G5388)；VE(大連美侖生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)MB1951)；IL-2檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)PI580)、IL-6檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)PI330)、IL-10檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)PI528)，上海碧云天生物技術(shù)有限公司提供；SOD測(cè)定試劑盒(貨號(hào)A001-1-2)、GSH-Px測(cè)定試劑盒(貨號(hào)A005-1-1)、T-AOC檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)A015-3-1)、MDA測(cè)定試劑盒(貨號(hào)A003-1-2)，南京建成生物工程研究所提供。

SMA4000型微量分光光度計(jì)，北京美林恒通儀器有限公司；Multiskan MK3型全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)，賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司；BX6200HP型超聲波清洗器，上海新苗儀器有限公司；DHG-9076型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

24只雌性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、當(dāng)歸四逆湯組、VE組4組各6只。模型制備[5-8]通過(guò)皮下與腹腔等量聯(lián)合注射的方式為模型組、當(dāng)歸四逆湯組、VE組大鼠注射D-gal溶液(1000 mg·kg-1·d-1)，正常組大鼠注射等量0.9%氯化鈉溶液，每日1次，持續(xù)8周。自模型制備起始第2周，當(dāng)歸四逆湯組、VE組大鼠灌胃給藥，其余組大鼠給予等量0.9%氯化鈉溶液，共給藥7周。

2.2 一般狀態(tài)觀察

每日觀察并記錄大鼠毛發(fā)、飲食、排便、精神與行動(dòng)狀態(tài)等。

2.3 Morris水迷宮檢測(cè)

模型制備與治療結(jié)束后進(jìn)行為期6 d的行為學(xué)檢測(cè)，設(shè)置Morris水迷宮進(jìn)行定位航行試驗(yàn)與空間搜索試驗(yàn)。水迷宮高50 cm、直徑130 cm，水池上方設(shè)置SuperMaze攝像機(jī)，使用SuperMaz軟件將水池分成4個(gè)象限，擇1象限中心處設(shè)圓形透明平臺(tái)，高29 cm、直徑10 cm，水平面高約30 cm，水中放入黑色食用色素，水溫保持在22 ℃～26 ℃。定位航行試驗(yàn)第1天每只大鼠置于水中適應(yīng)120 s；第2～5天為訓(xùn)練期，隨機(jī)選擇象限將大鼠放入水中，觀察并記錄逃避潛伏期；若120 s未尋至平臺(tái)便引至平臺(tái)放置10 s，記錄潛伏期為120 s。每天早晚訓(xùn)練各2次，訓(xùn)練間期60 s，檢測(cè)大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力?？臻g搜索試驗(yàn)第6天移走平臺(tái)，隨機(jī)選取1象限將大鼠置于水中，記錄其于120 s內(nèi)經(jīng)過(guò)原平臺(tái)處的次數(shù)，檢測(cè)大鼠空間位置記憶能力。

2.4 處死與取材

行為學(xué)檢測(cè)后，4%水合氯醛腹腔麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血并分離血清；取血后將大鼠轉(zhuǎn)移至超凈工作臺(tái)暴露臟器，剝離脾臟、肝臟、胸腺，將取出的臟器稱重。

2.5 臟器指數(shù)測(cè)定

臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量(g)/體質(zhì)量(g)×100%，運(yùn)用以上公式計(jì)算脾臟、肝臟、胸腺指數(shù)。

2.6 比色法、鐵離子還原法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

比色法檢測(cè)大鼠血清中SOD、GSH-Px、MDA含量，鐵離子還原法檢測(cè)血清中T-AOC含量，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清中IL-2、IL-6和IL-10含量，所有步驟均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠一般狀態(tài)變化

實(shí)驗(yàn)期間，正常組大鼠一般狀況良好；模型組、VE組、當(dāng)歸四逆湯組大鼠均出現(xiàn)不同程度的飲食降低、毛色無(wú)光、褪毛增多、喜靜蜷縮且行動(dòng)遲緩、大便色質(zhì)改變等，其中模型組大鼠變化最明顯，VE組和當(dāng)歸四逆湯組大鼠精神與活動(dòng)狀態(tài)較模型組明顯改善。

3.2 各組大鼠學(xué)習(xí)、記憶能力比較

表1示，與正常組比較，模型組大鼠進(jìn)入逃生平臺(tái)范圍次數(shù)明顯減少(P<0.01)，逃避潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.01)；與模型組比較，VE組和當(dāng)歸四逆湯組大鼠進(jìn)入逃生平臺(tái)范圍次數(shù)明顯增多(P<0.05)，逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)。

表1 各組大鼠進(jìn)入逃生平臺(tái)次數(shù)與逃避潛伏期比較

3.3 各組大鼠臟器指數(shù)比較

表2示，與正常組比較，模型組大鼠脾、肝、胸腺指數(shù)明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，VE組和當(dāng)歸四逆湯組大鼠脾、肝、胸腺指數(shù)明顯上升(P<0.05，P<0.01)。

表2 各組大鼠的脾、肝、胸腺指數(shù)比較

3.4 各組大鼠血清SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA含量比較

表3示，與正常組比較，模型組大鼠血清SOD、GSH-Px、T-AOC含量明顯減少(P<0.01)，MDA含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，VE組和當(dāng)歸四逆湯組血清SOD、GSH-Px、T-AOC含量明顯升高(P<0.01)，MDA含量明顯降低(P<0.01)。

表3 各組大鼠血清SOD、GSH-Px、T-AOC、MDA含量比較

3.5 各組大鼠血清IL-2、IL-6及IL-10含量比較

表4示，與正常組比較，模型組大鼠血清IL-2、IL-10含量明顯下降(P<0.01)，IL-6含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，VE組和當(dāng)歸四逆湯組大鼠血清IL-2、IL-10含量明顯升高(P<0.01)，IL-6含量明顯降低(P<0.01)；與VE組比較，當(dāng)歸四逆湯組大鼠血清中IL-2、IL-10含量明顯升高(P<0.01)，IL-6含量明顯降低(P<0.01)。

表4 各組大鼠血清中IL-2、IL-6和IL-10含量比較

4 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，疾病發(fā)生發(fā)展是營(yíng)養(yǎng)代謝與免疫炎癥的矛盾斗爭(zhēng)，中醫(yī)調(diào)控代謝和免疫平衡的論述多集中于營(yíng)衛(wèi)學(xué)說(shuō)[9]。當(dāng)歸四逆湯為調(diào)和營(yíng)衛(wèi)之祖方桂枝湯化裁而成，方中當(dāng)歸養(yǎng)血活血，白芍更增其滋陰養(yǎng)血之功；與通草相配以通利血脈；與桂枝、細(xì)辛配伍溫煦血脈，除陳寒積冷以助血脈通暢。桂枝、白芍調(diào)和營(yíng)衛(wèi)；大棗、炙甘草健脾養(yǎng)血，與酸甘之白芍更益滋陰和營(yíng)之功；全方養(yǎng)血和營(yíng)、溫陽(yáng)通脈，擅治氣血不和、營(yíng)衛(wèi)陰陽(yáng)失調(diào)諸證[10]。

學(xué)習(xí)記憶能力減弱是衰老的標(biāo)志性行為學(xué)表現(xiàn)之一[11]，臟器因衰老導(dǎo)致形態(tài)結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)變化是其生理功能衰退的基礎(chǔ)，因此臟器指數(shù)是探討衰老的途徑之一[12]。加快衰老的誘因與其致使的表現(xiàn)?；橐蚬?。氧化應(yīng)激是自由基在體內(nèi)堆積而引起的氧化損傷，自由基代謝異常是造成衰老的主要原因之一[13]。衰老可致清除自由基功能減弱，外源性物質(zhì)攻擊可致自由基代謝異常，誘發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化致使氧化應(yīng)激損傷；在免疫激活和效應(yīng)階段，消滅外來(lái)或改變自身抗原的同時(shí)機(jī)體出現(xiàn)炎癥反應(yīng)，免疫細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激更為敏感[14]，氧化應(yīng)激使免疫細(xì)胞、免疫器官受損，致使免疫功能下降又加速衰老[13,15]；衰老導(dǎo)致代謝產(chǎn)物堆積是引起炎癥的重要原因之一[16，17]，氧自由基亦是炎癥反應(yīng)的效應(yīng)器[18，19]。因此，免疫、氧化應(yīng)激、衰老三者以自由基為中介，炎癥反應(yīng)為表象，形成互相影響、互為因果的疾病發(fā)生發(fā)展閉環(huán)。

超氧化物自由基、過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)、羥基自由基(hydroxyl radical，-OH)、過(guò)氧化脂質(zhì)(lipid peroxide，LPO)與氧化應(yīng)激緊密相關(guān)，超氧化物是含有超氧離子(superoxide，O2-)的化合物，氧分子通過(guò)呼吸作用轉(zhuǎn)為O2-，O2-可以衍生H2O2、-OH；-OH經(jīng)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)生氫過(guò)氧化物(hydroperoxide，ROOH)；LPO是不飽和脂肪酸與氧自由基作用所形成的過(guò)氧化物[20]。SOD是酶促防御系統(tǒng)的第一道防線，SOD可以加速O2-歧化反應(yīng)，在消除活性氧的毒性過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并參與免疫反應(yīng)[21，22]，衰老程度與T淋巴細(xì)胞的壽命皆與SOD的含量有關(guān)[23]；GSH-Px主要清除ROOH，并能廣泛迅速地清除H2O2，降低自由基產(chǎn)生的氧化損傷[24]。SOD、GSH-Px是酶促防御系統(tǒng)的重要標(biāo)志物[25]，SOD與O2-反應(yīng)生成H2O2, 再由GSH-Px催化H2O2生成水, 清除自由基對(duì)細(xì)胞的毒害作用, 保護(hù)細(xì)胞免受損傷。T-AOC可以分解和清除活性氧自由基，是反映綜合抗氧化功能的指標(biāo)[26]，SOD、GSH-Px和VE的抗氧化能力皆可用T-AOC體現(xiàn)[27]。MDA是LPO最終分解產(chǎn)物之一，LPO過(guò)量直接損傷大腦發(fā)育致大腦早衰甚或癡呆，并且增強(qiáng)血小板凝集性，是導(dǎo)致粥樣動(dòng)脈硬化和血管老化的重要因素，同時(shí)抑制免疫功能，其含量與臟器衰竭數(shù)目呈正相關(guān)。同時(shí)MDA破壞線粒體結(jié)構(gòu)與功能造成肝臟損傷[28]，因此MDA含量可以反映氧自由基水平、過(guò)氧化反應(yīng)的程度以及臟器功能[13,29，30]。IL-6是較為常見(jiàn)的促炎因子，具備調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)與生化、調(diào)節(jié)免疫的功能，參加炎癥反應(yīng)[31]。IL-2為增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能的良性細(xì)胞因子[32]，可提高抗體含量[33]，促進(jìn)T、B細(xì)胞特異性分化[34]，是獲得性免疫的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[35]，在維持調(diào)節(jié)T細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)層面具有至關(guān)重要的意義[36]。IL-10可以加強(qiáng)適應(yīng)性免疫，抵制炎癥與T細(xì)胞凋亡[37]，可以抑制所有促炎細(xì)胞因子生成[38]，IL-10還能通過(guò)抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB活性起到抑制肝纖維化的作用[39]。

本研究表明，中醫(yī)學(xué)“營(yíng)衛(wèi)”與氧化性炎癥衰老的免疫系統(tǒng)功能密切相關(guān)。當(dāng)歸四逆湯通過(guò)增加衰老機(jī)體血清中SOD、GSH-Px、T-AOC的含量，提升自由基防御系統(tǒng)功能，清除O2-、H2O2等自由基，減少體內(nèi)ROOH和LPO等過(guò)氧化物的含量，減少M(fèi)DA緩解氧化應(yīng)激損傷，增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力，減輕臟器萎縮的退行性改變，降低免疫細(xì)胞的損傷，增加血清中IL-2、IL-10含量，降低IL-6含量，提高免疫系統(tǒng)功能，避免炎癥反應(yīng)。當(dāng)歸四逆湯抗氧化能力與VE處于同一水平，提升衰老機(jī)體免疫力的效果優(yōu)于VE，其機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。