胡 廣，李 瑛，楊會珍，張國瑗，盛 雪，苗 蘭，孫明謙△，林 力△

(1.中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院，北京 100091；2.通遼市市場檢驗(yàn)檢測中心，內(nèi)蒙古 通遼 028000)

血瘀證是中醫(yī)臨床常見證候，多見于慢性疾病發(fā)展過程中。氣滯血瘀是血瘀證的主要類型之一，其形成多是一個“久病成瘀”的過程，具有慢性血瘀證的特點(diǎn)[1]。中醫(yī)理論認(rèn)為，氣滯血瘀發(fā)病機(jī)理在于氣機(jī)郁滯而血行瘀阻[2]，肝主藏血而又主疏泄，肝氣失于暢達(dá)會導(dǎo)致氣機(jī)郁滯進(jìn)而引起血行不暢。臨床研究表明，慢性血瘀證特別是氣滯血瘀證患者常伴有肝功能異常，慢性血瘀證的發(fā)病機(jī)制可能與肝的生理功能密切相關(guān)[3-6]，但目前對于肝臟在慢性血瘀證中的作用機(jī)制研究較少，其科學(xué)內(nèi)涵還有待于進(jìn)一步的闡釋。

蛋白質(zhì)組學(xué)是鑒定和量化細(xì)胞、組織或生物體中總蛋白質(zhì)含量的研究技術(shù)，能夠闡明生物體蛋白質(zhì)的特性，并認(rèn)識特定蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能[7]。同時蛋白質(zhì)組學(xué)具有特異性、整體性、動態(tài)性、階段性等特點(diǎn)[8]，這與中醫(yī)認(rèn)識疾病的整體觀、辨證觀有一定的趨同性，利用其理論與方法探索中醫(yī)學(xué)證候本質(zhì)[9，10]，揭示中醫(yī)證候的科學(xué)內(nèi)涵，能為中醫(yī)辨證的客觀化提供依據(jù)和方法[11]。本研究采用小劑量連續(xù)皮下注射腎上腺素的方法，模擬臨床上氣滯血瘀的發(fā)病機(jī)理，從而構(gòu)建慢性血瘀證模型[12，13]，進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)定量肝臟組織中蛋白質(zhì)，篩選得到差異蛋白，并通過蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)找出慢性血瘀證的關(guān)鍵蛋白及相關(guān)生物途徑，以期明確慢性血瘀證的發(fā)生機(jī)制。本研究通過中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院動物倫理委員會批準(zhǔn)(批號2021XLC011-2)。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠18只，體質(zhì)量150～180 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號SCXK(京)2016-0006。實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院動物實(shí)驗(yàn)中心屏障環(huán)境設(shè)施中，標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料及潔凈飲用水喂養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為晝夜各半交替，溫度 18～22 ℃，通風(fēng)良好，濕度恒定。

1.2 主要試劑及儀器

尿素(美國Affymetrix公司，貨號 57-13-6)；測序級胰蛋白酶(美國Promega公司，貨號 V511A)；甲酸、二硫蘇糖醇(dithiothreitol, DTT)、乙腈(acetonitrile, ACN)(美國Thermo Fisher公司，貨號分別為 212454、3483-12-3、214241)；碘乙酰胺(iodoacetamide，IAA)(美國Sigma公司，貨號 I1149)；碳酸氫銨(美國Amresco公司，貨號 1066-33-7)；鹽酸腎上腺素注射液(1 mL，1 mg/支)(天津金耀藥業(yè)有限公司，貨號2002031)。

Easy nLC1000納升級液相色譜儀，美國Thermo Fisher公司；Q Exactive Plus四級桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜儀, 美國Thermo Fisher公司；LBY-N6C全自動清洗血流變儀，北京普利生儀器有限公司；Synergy UV型超純水機(jī)，美國Millipore公司。

2 方法

2.1 分組與造模

18只大鼠隨機(jī)分為正常組和模型組每組各9只。正常組不予任何操作，模型組大鼠背部皮下注射鹽酸腎上腺素溶液0.6 mg/kg，每日注射1次，連續(xù)注射1周。

2.2 樣本采集

取材前1天所有大鼠均禁食12 h。造模第7天記錄大鼠體質(zhì)量及體征變化，模型組大鼠末次注射腎上腺素1 h后，3.5%水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，抗凝后分別用于全血黏度(低切5 s-1，中切60 s-1，高切150 s-1)和血生化肝功能指標(biāo)的測定，剩余肝素化抗凝血漿置于-80 ℃凍存，取大鼠同一位置肝臟組織50 g，于液氮中速干后置于-80 ℃凍存。

2.3 蛋白質(zhì)組學(xué)樣品制備

2.3.1 蛋白提取 取肝臟組織加入Ripa勻漿(1∶100)，凍融超聲3次，離心后取上清液，BCA定量。每3個樣本混在一起，每組混成3個樣本，加1 mL預(yù)冷丙酮，-20 ℃放置沉淀4 h，離心吸出上層丙酮；再加少量丙酮，-20 ℃放置沉淀，離心揮干上層丙酮，底層沉淀為蛋白。

2.3.2 樣本制備 將上述蛋白用尿素溶解，轉(zhuǎn)移到10K超濾管內(nèi)超濾離心，濃縮完成后將溶劑置換成8 mol·L-1尿素，先加DTT至終濃度20 mmol·L-1，37 ℃還原30 min，然后用8 mol·L-1尿素洗滌3次，濃縮到50 μL，加入終濃度40 mmol·L-1的IAA，于黑暗處37 ℃放置30 min。然后8 mol·L-1尿素洗滌3次，隨后采用50 mmol·L-1的碳酸氫銨溶液洗滌3次，濃縮到50 μL。以1∶25的質(zhì)量比例(胰蛋白酶：蛋白)加入胰蛋白酶，37 ℃恒溫水浴16 h，加入0.1%(v/v)甲酸水溶液終止酶切，更換接收管離心，離心液用于質(zhì)譜分析。

2.4 樣品檢測

采用Easy nLC 1000 納升級液相色譜儀對處理后的樣品進(jìn)行檢測。流動相A：0.1%甲酸-水，流動相B：0.1%甲酸-乙腈。洗脫梯度0～25 min，5%～9%B; 25～65 mim，9%～23%B; 65～75 min，23%～32%B; 75～76 min，32%～95%B; 76～90 min，95%～95%B。流動相流速為 420 nL·min-1。質(zhì)譜分析在Q Exactive Plus 質(zhì)譜儀上采集完成，模式為數(shù)據(jù)依賴型(data dependent acquisition，DDA)。一級質(zhì)譜的分辨率為70 000 FWHM，掃描范圍m/z 400～1600，自動增益控制值為3×106，注入時間50 ms。二級質(zhì)譜的分辨率設(shè)為17500，自動增益控制值1×105，注入時間45 ms，碰撞能量27 NCE。二級采集的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為前20個最強(qiáng)離子作為母離子，再進(jìn)行Orbitrap 檢測，每個樣品平行測定3次。

2.5 蛋白質(zhì)鑒定及定量分析

蛋白質(zhì)鑒定通過Proteome Discoverer 軟件進(jìn)行，將質(zhì)譜所得到的原始數(shù)據(jù)RAW文件導(dǎo)入軟件，在UniProt(http://www.uniprot.org/)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中搜索。參數(shù)條件設(shè)定為肽段置信度設(shè)置為高，最多蛋白漏切位點(diǎn)數(shù)2個，肽段的長度范圍 6～144 個氨基酸，母離子質(zhì)量偏差為 ± 10，碎片離子質(zhì)量偏差 0.02，固定修飾選擇半胱氨酸碘乙酰胺化，可變修飾選擇甲硫氨酸氧化和N-乙酰化，肽段搜庫假陽性率(false positive rate，F(xiàn)DR)設(shè)置為1%，定量分析通過 Maxquant 軟件進(jìn)行。參數(shù)設(shè)定最多漏切位點(diǎn) 2 個，固定修飾為半胱氨酸碘乙酰胺化，可變修飾為甲硫氨酸氧化和 N-乙?；?，先驅(qū)離子質(zhì)量偏差為 ± 20，碎片離子質(zhì)量偏差為0.02 ppm，可檢測到的肽段最小值為 7 個氨基酸，肽段搜庫假陽性率FDA為1%。

2.6 生物信息學(xué)分析

將Fold change(差異倍數(shù))>1.50和P<0.05的蛋白作為差異蛋白，基于GO(http://www.geneontology.org/)進(jìn)行蛋白本體分析，基于KEGG(http://www.genome.jp/kegg/pathway.html)進(jìn)行蛋白生物功能富集。運(yùn)用STRING(https ://string-db.org/)分析蛋白質(zhì)之間的相互作用。

3 結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)比較

表1示，正常組大鼠皮毛白凈有光澤，飲食排便正常，好動且反應(yīng)靈敏。模型組大鼠懶言少動，皮毛疏松發(fā)黃，進(jìn)食量減少，大便溏爛，反應(yīng)遲緩，與正常組比較體質(zhì)量明顯下降(P<0.01)。

表1 大鼠造模前后體質(zhì)量比較

3.2 血液流變學(xué)結(jié)果

表2示，與正常組比較，模型組大鼠的全血黏度在不同切變率下均顯著升高(P<0.01)，表明造模后大鼠血液黏滯，凝血功能活躍，慢性血瘀證大鼠造模成功。

表2 大鼠不同切變率下全血黏度比較

3.3 肝功能指標(biāo)結(jié)果

表3示，與正常組比較，模型組大鼠的谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶水平顯著升高(P<0.01)，白蛋白水平顯著降低(P<0.01)，表明造模后大鼠肝功能出現(xiàn)異常。

表3 大鼠肝功能指標(biāo)比較

3.4 蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果

3.4.1 定量蛋白質(zhì)組學(xué)分析 圖1示，蛋白質(zhì)組學(xué)分析示，2組肝臟樣本中有2532個非冗余蛋白，在這些蛋白質(zhì)中，2組共有1857個蛋白質(zhì)，占鑒定的總蛋白質(zhì)的73.3%。樣本之間的皮爾遜相關(guān)性結(jié)果表明，同組樣本相關(guān)性較大，而2組之間的相關(guān)系數(shù)較低。各組內(nèi)皮爾遜相關(guān)系數(shù)的顯著差異表明，2組間的樣本相對獨(dú)立。

圖1 慢性血瘀證大鼠肝臟樣本蛋白質(zhì)組學(xué)質(zhì)控分析(Ⅰ：Venn圖；Ⅱ：皮爾遜相關(guān)性分析；A：正常組；B：模型組)

3.4.2 差異蛋白的篩選和分析 為進(jìn)一步探索腎上腺素構(gòu)建慢性血瘀證模型的作用機(jī)制，使用P<0.05和Fold Change > 1.5 作為分析標(biāo)準(zhǔn)。與正常組比較，在模型組中共鑒定出56個差異表達(dá)蛋白，其中22個上調(diào)蛋白，34個下調(diào)蛋白。根據(jù)顯著性水平和倍數(shù)變化值進(jìn)一步繪制火山圖。在圖2中，紅點(diǎn)代表上調(diào)的蛋白質(zhì)，藍(lán)點(diǎn)代表下調(diào)的蛋白質(zhì)，灰點(diǎn)代表非差異表達(dá)的基因。聚類分析熱圖顯示，腎上腺素構(gòu)建慢性血瘀證模型后，這些差異蛋白在2組中的含量存在明顯差異，呈現(xiàn)明顯聚類現(xiàn)象。

圖2 慢性血瘀證大鼠肝臟樣本差異蛋白分析(Ⅰ：差異蛋白火山圖；Ⅱ：差異蛋白熱圖分析；A：正常組；B：模型組)

3.4.3 生物功能分析 GO分析使用OmicShare工具(https://www.omic share.com/tools)進(jìn)行。GO涵蓋生物過程、分子功能和細(xì)胞成分3個領(lǐng)域。細(xì)胞成分富集項(xiàng)表明，大部分差異表達(dá)蛋白位于細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞外空間、細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)合細(xì)胞器、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和線粒體。圖3示，GO分析發(fā)現(xiàn)，差異表達(dá)蛋白的分子功能主要包括相同蛋白結(jié)合、花生四烯酸14,15-環(huán)氧合酶活性、血紅素結(jié)合、細(xì)胞黏附分子結(jié)合、氧化還原酶活性。生物學(xué)過程主要涉及有機(jī)酸代謝過程、凝血和纖維蛋白凝塊過程、花生四烯酸代謝過程、血小板聚集、凝血的負(fù)調(diào)節(jié)等。

圖3 慢性血瘀證大鼠肝臟樣本差異蛋白GO分析結(jié)果

3.4.4 差異蛋白的聚類分析 使用DAVID分類系統(tǒng)(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)和KEGG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行途徑富集分析。圖4示，選取前20個相關(guān)通路作圖，坐標(biāo)標(biāo)尺上包含圓圈外的基因數(shù)；第2個圓圈是背景基因的數(shù)量和P值，基因越多說明條形越長，顏色越紅p值越小；第3圈是每個分類的基因總數(shù)；第4個圓圈代表每個類別的豐富因子。差異蛋白與各種生物學(xué)途徑相關(guān)，包括補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)(ko04610)、血小板活化(ko04611)、5-羥色胺能突觸(ko04726)、乙醛酸和二羧酸代謝(ko00630)、色氨酸代謝(ko00380)、花生四烯酸代謝(ko00590)。

圖4 慢性血瘀證大鼠肝臟樣本差異蛋白KEGG分析結(jié)果

3.4.5 PPI蛋白互作分析 在生物體中，蛋白功能通常發(fā)生相互作用，從而共同完成一系列的生物過程。本研究采用STRING 數(shù)據(jù)庫對通路中富集的所有蛋白相互作用進(jìn)行預(yù)測，并繪制蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，結(jié)合KEGG分析以及GO分析數(shù)據(jù)構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。圖5示，細(xì)胞色素P450 2C11(cytochrome p450 2c11，CYP 2C11)、環(huán)氧化物水解酶(epoxide hydrolase，EPHX)1、補(bǔ)體因子(complement factor，Cf)b、激肽原(kininogen，KNG)1、纖維蛋白原γ(fibrinogen gamma chain，F(xiàn)GG)、纖維蛋白原α(fibrinogen alpha chain，F(xiàn)GA)和纖維蛋白原β(fibrinogen beta chain，F(xiàn)GB)位于該網(wǎng)絡(luò)的中心，在與其他蛋白質(zhì)相互作用時起到中樞作用。這些蛋白質(zhì)參與多種生物過程，包括花生四烯酸代謝、補(bǔ)體與凝血級聯(lián)反應(yīng)、血小板活化與聚集等通路。

圖5 慢性血瘀證大鼠肝臟樣本差異蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)圖

4 討論

實(shí)驗(yàn)采用皮下長時間小劑量注射腎上腺素的方法構(gòu)建慢性血瘀證大鼠模型，并通過觀察其一般體征、血流變、血生化等指標(biāo)進(jìn)行模型判斷。結(jié)果顯示，模型組大鼠體質(zhì)量明顯下降，懶言少動，毛發(fā)枯燥，食欲下降，相關(guān)檢測指標(biāo)中，血流變數(shù)據(jù)在低、中、高切中均有顯著性變化，說明模型組大鼠血液流動性下降。血生化中肝功能指標(biāo)檢測結(jié)果顯示，模型組大鼠肝功能出現(xiàn)異常。通過蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)，慢性血瘀證的發(fā)病機(jī)制主要集中在以下通路和蛋白。

花生四烯酸是血小板的常見誘導(dǎo)劑，能夠誘導(dǎo)血小板表面各種受體的激活，引起血小板的活化與聚集。當(dāng)花生四烯酸作用于血小板時，先由細(xì)胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase，COX)作用轉(zhuǎn)化為前列腺素(prostaglandin，PG)G2和PGH2，在環(huán)氧化酶(cytochrome c oxidase subunit，COX)-1作用下合成血栓素(thromboxane，TX)A2[14]，而TXA2會進(jìn)一步激活血小板上的受體，引起血小板活化從而導(dǎo)致血小板聚集。Cyp2C11是一種參與類固醇激素和脂肪酸代謝的細(xì)胞色素P450單加氧酶，能夠催化碳?xì)滏I的羥基化[15]，在體內(nèi)能一定程度上催化花生四烯酸的羥基化[16]，從而影響花生四烯酸的代謝，使得血小板的活化與聚集受到影響。EPHX1是一種高度豐富的α/β水解酶，已知其具有環(huán)氧化物水解酶活性，能夠?qū)Ⅲw內(nèi)的內(nèi)源性大麻素2-花生四烯酸甘油(2-arachidonoylglycerol，2-AG)代謝為游離的花生四烯酸(arachidonicacid，AA)和甘油[17]，同時它還能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)內(nèi)源性類固醇代謝、膽汁酸轉(zhuǎn)運(yùn)[18]，在慢性血瘀證模型的構(gòu)建中起到重要調(diào)節(jié)作用。本研究中EPHX1蛋白在模型組中含量顯著性上升，可能會導(dǎo)致更多的2-AG被代謝為花生四烯酸，從而引發(fā)血小板的聚集，說明其可以作為慢性血瘀證的潛在標(biāo)志蛋白。

在血液循環(huán)中，補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)形成了一個緊密而復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)[19]，其激活通過3條途徑(凝集素、經(jīng)典途徑和替代途徑)進(jìn)行，它們匯聚形成補(bǔ)體(complement，C)3轉(zhuǎn)化酶，將C3分解為有活性的肽段C3b和C3a，再進(jìn)一步在體內(nèi)代謝形成C5、C5a、C5b。C3a和C5a與各自的同源受體相互作用，能促進(jìn)血小板活化和聚集[20]，而血小板聚集是血瘀證的主要特征之一。Cfb是補(bǔ)體系統(tǒng)替代途徑的一部分，它能夠切割補(bǔ)體成分C3結(jié)構(gòu)中的Arg-Ser鍵產(chǎn)生C3a和C3b，切割補(bǔ)體成分C5結(jié)構(gòu)中的Arg-Xaa鍵產(chǎn)生C5a和C5b。C3a和C5a是補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)中重要的調(diào)節(jié)蛋白，已有實(shí)驗(yàn)表明這些微粒具有促炎和促凝血的特性[21]。KNG1參與補(bǔ)體和凝血級聯(lián)反應(yīng)，可以通過選擇性剪接產(chǎn)生2種不同的蛋白質(zhì)，分別為高分子量激肽原(high molecular weight kininogen，HMWK)和低分子量激肽原(low molecular weight kininogen，LMWK)，HMWK具有一定的抗凝和促纖溶特性，可以抑制血小板的聚集。其結(jié)構(gòu)域3通過干擾凝血酶與血小板上糖蛋白Ib-Ⅸ-V復(fù)合物的結(jié)合阻斷凝血酶依賴性血小板聚集，HMWK裂解后衍生的緩激肽能夠阻斷凝血酶誘導(dǎo)的血小板聚集，HMWK結(jié)構(gòu)域2可抑制血小板鈣蛋白酶的功能。有研究表明，缺乏激肽基因的大鼠可能存在血栓前表型[22]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，KNG1蛋白在模型組中含量降低，這會導(dǎo)致HMWK含量減少，從而使得機(jī)體無法有效抑制血小板的聚集，證明KNG1蛋白在慢性血瘀證中起著關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。

研究發(fā)現(xiàn)，血瘀證往往伴隨著血小板活化現(xiàn)象[23]，而血小板聚集和活化又與FGG、FGA和FGB密切相關(guān)[24]，三者一起聚合可形成不溶性纖維蛋白基質(zhì)。纖維蛋白作為血凝塊的主要成分之一，在止血功能上發(fā)揮著重要作用，能夠通過整合素β-3(integrin beta-3)依賴性途徑增強(qiáng)活化血小板中P選擇素(p-selectin)的表達(dá)[25，26]，從而促進(jìn)血小板的聚集。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)GG、FGA和FGB蛋白在模型組均呈下降趨勢，這可能是因?yàn)槟Ｐ徒M中大量的FGG、FGA和FGB聚合形成纖維蛋白基質(zhì)，進(jìn)一步導(dǎo)致模型組體內(nèi)血小板呈聚集狀態(tài)，說明FGG、FGA和FGB是慢性血瘀證中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白。

綜上，長期小劑量注射腎上腺素會使得大鼠肝功能異常，影響相關(guān)蛋白功能，進(jìn)而引起機(jī)體血小板活化和聚集，從而導(dǎo)致凝血功能異常，大鼠表現(xiàn)出相關(guān)血瘀證特征。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明，腎上腺素可能通過多個靶點(diǎn)(Cyp2c11、EPHX1、Cfb、KNG1、FGG、FGA和FGB)和途徑(花生四烯酸代謝、補(bǔ)體與凝血級聯(lián)反應(yīng)、血小板活化與聚集)激活血小板的活化與聚集及調(diào)節(jié)凝血功能，從而導(dǎo)致慢性血瘀證的發(fā)生。本研究從蛋白組角度探討慢性血瘀證的發(fā)病機(jī)制，找出其關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，為慢性血瘀證的治療與診斷提供科學(xué)支持，但相關(guān)靶點(diǎn)蛋白還需進(jìn)一步驗(yàn)證與探討。