王業(yè)豐，姚 遙，楊欣河，鄒 彬，李 佳，李 娟，4

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生與管理學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，銀川 750004；4.寧夏少數(shù)民族醫(yī)藥現(xiàn)代化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是由老化、遺傳和環(huán)境多因素共同導(dǎo)致的一種神經(jīng)退行性疾病，是癡呆最常見的病因[1]，其核心病理特征是腦內(nèi)β 淀粉樣蛋白（amyloid-β protein，Aβ）沉積、神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）以及大腦中持續(xù)的神經(jīng)炎性反應(yīng)[2]。小膠質(zhì)細(xì)胞是駐留在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中的一種天然免疫細(xì)胞[3]。全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn)，與AD 中的炎癥過程相關(guān)的基因（TREM2、CD33、CR1、PLCG2和INPP5D）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要由小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，這表明小膠質(zhì)細(xì)胞是AD 的神經(jīng)炎癥發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵參與者[4]。動(dòng)物研究和臨床前研究[5]顯示，使用抗炎藥物可以有效抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，降低腦內(nèi)炎癥因子水平，減輕神經(jīng)元損傷，改善認(rèn)知功能；苦參堿是中藥苦參中的代表性生物堿和主要有效成分，其抗炎作用尤為顯著[6]。有研究[7-8]顯示，苦參堿可以降低AD 大鼠和小鼠腦內(nèi)的炎癥因子水平，減弱對(duì)海馬神經(jīng)元線粒體超微結(jié)構(gòu)的損傷，從而抑制神經(jīng)炎癥，改善AD 大鼠的認(rèn)知功能，但機(jī)制并不明確。CX3CR1（CX3C chemokine receptor 1）是一種趨化因子受體，可以與多種功能性配體結(jié)合，參與調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的活化和炎癥因子的釋放[9]。本研究擬通過檢測(cè)苦參堿對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活化、炎癥因子的釋放以及CX3CR1 蛋白的表達(dá)情況，為苦參堿治療神經(jīng)炎癥的機(jī)制研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞株（N9）購于通派（上海）生物科技有限公司；苦參堿購于寧夏紫荊花藥業(yè)股份有限公司鹽池藥廠（純度＞98%，批號(hào)180905）；MTT、米諾環(huán)素（minocycline，MINO）、脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）及含DAPI 的抗熒光衰減封片劑購于北京索萊寶科技有限公司；高糖DMEM、胎牛血清（FBS）、PBS 緩沖液、胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素混合液（100×）購于美國(guó)Gibco 公司；RAPA 裂解液（強(qiáng)）、PMSF、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、TBST 購于武漢塞維爾生物科技有限公司；BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒購于江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；山羊血清購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；山羊抗兔HRP 偶聯(lián)二抗、山羊抗兔紅色Alexa Fluor 偶聯(lián)二抗（594）、山羊抗鼠綠色Alexa Fluor 偶聯(lián)二抗（488）購于亞科因（武漢）生物技術(shù)有限公司；CX3CR1、β-actin 抗體購于江蘇親科生物研究中心有限公司；分化抗原簇-32（cluster of differentiation-32，CD32）與分化抗原簇-206（cluster of differentiation-206，CD206）抗體購于美國(guó)Santa Cruz 公司；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）、活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

細(xì)胞培養(yǎng)箱、冷凍離心機(jī)、全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀及iBright 成像系統(tǒng)購于美國(guó)賽默飛世爾科技公司，熒光顯微鏡購于美國(guó)ECHO 公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) N9 細(xì)胞置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中用含10% FBS、100 U 青霉素和100 U鏈霉素及50 μmol·L-12-巰基乙醇的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到70%～80%時(shí)，以胰酶消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至4×105個(gè)/mL 傳代。取3～7 代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)分組及處理 所有藥物均以無血清的DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋配制。將細(xì)胞分為Control 組（DMEM 基礎(chǔ)培養(yǎng)基）、苦參堿（10 μmol·L-1）組、LPS（300 ng·mL-1）組、LPS+苦參堿（0.1、0.3、1.0、3.0 和10.0 μmol·L-1）組以及LPS+MINO（30 μmol·L-1）組。

1.2.3 MTT 法檢測(cè)苦參堿與LPS 對(duì)N9 小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響 將細(xì)胞濃度調(diào)整至4×104個(gè)/mL，接種于96 孔板中，每孔200 μL，培養(yǎng)過夜。第2 天，更換含有LPS（0、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0 μg·mL-1）、苦參堿（0、0.1、0.3、1.0、3.0、10.0、30.0、100.0 μmol·L-1），以及LPS+苦參堿（0.1、0.3、1.0、3.0、10.0 μmol·L-1）的新鮮培養(yǎng)基，孵育24 h。第3 天，每孔中加入20 μL 的MTT 溶液（5 mg·mL-1），孵育4 h 后棄去培養(yǎng)液，每孔中加入150 μL 的DMSO，振蕩10 min使黃色結(jié)晶完全溶解后，置于酶標(biāo)儀中，選擇490 nm 波長(zhǎng)檢測(cè)各孔的吸光度（A）值。細(xì)胞存活率=［（As-Ab）/（Ac-Ab）］×100%。As：實(shí)驗(yàn)孔A值（含DMSO、MTT、細(xì)胞以及藥物）；Ac：對(duì)照孔A 值（含DMSO、MTT、細(xì)胞，不含藥物）；Ab：空白孔A值（僅含DMSO、MTT）。

1.2.4 ELISA 法檢測(cè)上清液中IL-6、PGE2 及ROS的含量 藥物處理24 h 后收集培養(yǎng)液，4 ℃下1 000 ×g 離心20 min，取上清液保存；按照說明書，提前從檢測(cè)盒中取出鋁箔，室溫平衡60 min，取出所需的包被好抗體的板條，分別在空白孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔加入對(duì)應(yīng)的試劑或樣品，37 ℃孵育60 min；洗板5 次后依次加入底物A、B，37 ℃避光孵育15 min，最后加入終止液混勻；用酶標(biāo)儀在450 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔的光密度（OD）值，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IL-6、PGE2 和ROS 濃度。

1.2.5 免疫熒光法檢測(cè)CD32、CD206 以及CX3CR1蛋白水平 將細(xì)胞濃度調(diào)整至2×104個(gè)/mL，接種于置有爬片的24 孔板中，每孔500 μL，給藥處理24 h 后開始實(shí)驗(yàn)。以常溫PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞2次，加4%多聚甲醛固定15 min 后，PBS 漂洗3 次，每次5 min。每孔加300 μL 山羊血清覆蓋爬片，封閉1 h 后加入CD32（1∶200）、CD206（1∶200）、CX3CR1（1∶200），4 ℃孵育過夜。PBS 漂洗3次后，用相應(yīng)的熒光二抗（1∶100）室溫下孵育1 h。PBS 漂洗3 次，取出爬片，吸干殘留液體后用含DAPI 的封片劑封片，并在熒光顯微鏡下采集圖像，后續(xù)使用Image J 對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。

1.2.6 Western blot 檢測(cè)CX3CR1 蛋白表達(dá)量 以BCA 法測(cè)定總蛋白含量后，將樣品與4×上樣緩沖液按4∶1 混合后煮沸10 min。將變性的樣品加到10%的SDS-PAGE 凝膠中，80 V 電泳30 min后轉(zhuǎn)120 V 電泳1 h，300 mA 轉(zhuǎn)膜30 min，將蛋白從凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。將PVDF 膜置于5%脫脂奶粉封閉1 h，然后在特異性一抗（1∶1 000）中4 ℃孵育過夜。TBST 漂洗3 次后，用HRP 偶聯(lián)二抗（1∶20 000）室溫下孵育1 h，隨后使用ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒對(duì)蛋白條帶進(jìn)行顯色。采用iBright 成像系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行成像，并使用Image J 對(duì)條帶的灰度值進(jìn)行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，采用Shapiro-Wilk 檢驗(yàn)和Levene檢驗(yàn)判斷數(shù)據(jù)的正態(tài)性和方差齊性，當(dāng)數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布且方差齊時(shí)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t 檢驗(yàn)；當(dāng)數(shù)據(jù)不服從正態(tài)分布或方差不齊時(shí)，數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四分位數(shù)）表示，組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)，兩兩比較采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)。采用雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α 取0.05。繪圖使用GraphPad Prism 8 完成。

2 結(jié)果

2.1 苦參堿對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活力的影響

為評(píng)估苦參堿對(duì)N9 細(xì)胞活力的影響，采用MTT 法測(cè)定了不同濃度苦參堿（0、0.1、0.3、1、3、10、30、100 μmol·L-1）處理后N9 細(xì)胞的存活率?？鄥A的毒性較低，在0～100 μmol·L-1的劑量范圍內(nèi)，苦參堿對(duì)N9 細(xì)胞活力無影響（P=0.9828）。LPS 對(duì)細(xì)胞活力的影響，結(jié)果顯示，在0～10 μg·mL-1的劑量范圍內(nèi)，LPS 對(duì)N9 細(xì)胞無明顯的細(xì)胞毒性（P=0.7107）。LPS 與苦參堿共同作用于N9 細(xì)胞，結(jié)果顯示，LPS 刺激也對(duì)經(jīng)苦參堿預(yù)處理的N9 細(xì)胞存活率無影響（P=0.7445），見圖1。

圖1 苦參堿及LPS 對(duì)N9 細(xì)胞存活率的影響

2.2 苦參堿對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放的影響

ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，與Control 組相比，LPS 組的ROS、IL-6、PGE2 的釋放水平均升高；與LPS 組相比，LPS+苦參堿組的ROS、IL-6、PGE2 的釋放水平均下降（P 均＜0.01）。

圖2 苦參堿對(duì)LPS 活化的N9 細(xì)胞的ROS、IL-6、PGE2 表達(dá)的影響

2.3 苦參堿對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2 型極化標(biāo)記物的影響

為探究苦參堿對(duì)LPS 刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞的保護(hù)作用是否與極化有關(guān)，本研究采用免疫熒光法檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞M1/M2 型極化的標(biāo)記物CD32 與CD206。在300 ng·mL-1的LPS 刺激后，小膠質(zhì)細(xì)胞CD32 的相對(duì)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P＜0.01）；苦參堿（10 μmol·L-1）預(yù)處理組的CD32 相對(duì)熒光強(qiáng)度下降（P＜0.01）。CD206 檢測(cè)結(jié)果顯示，在300 ng·mL-1的LPS 刺激后，小膠質(zhì)細(xì)胞CD206 的相對(duì)熒光強(qiáng)度降低（P＜0.01）；苦參堿（10 μmol·L-1）預(yù)處理組的CD206 的相對(duì)熒光強(qiáng)度增強(qiáng)（P ＜0.01），見圖3。

圖3 苦參堿對(duì)LPS 活化的N9 細(xì)胞M1/M2 型極化標(biāo)記物的影響

2.4 苦參堿對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞CX3CR1 蛋白表達(dá)的影響

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果如圖4A所示，與Control 組相比，在300 ng·mL-1的LPS 作用24 h 后，LPS 組CX3CR1 的平均熒光強(qiáng)度降低（P<0.01）；與LPS組相比，3 μmol·L-1與10 μmol·L-1的苦參堿預(yù)處理能夠增加CX3CR1 的平均熒光強(qiáng)度（P<0.01）。

Western blot 檢測(cè)也呈現(xiàn)出與免疫熒光相似的結(jié)果，如圖4B 所示，與Control 組相比，小膠質(zhì)細(xì)胞在300 ng·mL-1的LPS 作用24 h 后，CX3CR1蛋白的相對(duì)表達(dá)水平降低（P<0.05）；與LPS 組相比，1、3、10 μmol·L-1的苦參堿均能使CX3CR1的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)。

圖4 苦參堿對(duì)LPS 活化的小膠質(zhì)細(xì)胞CX3CR1 蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

在神經(jīng)炎癥中，小膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)具有雙重性。在發(fā)生認(rèn)知缺陷之前的早期階段，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞可以促進(jìn)Aβ 的清除和Tau 蛋白的內(nèi)化，被認(rèn)為是有益的影響[10]；但在其后期，持續(xù)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞則通過分泌消化酶、ROS、炎癥因子及減少營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)因子等直接或間接引起神經(jīng)元的凋亡或壞死，加重神經(jīng)毒性[11]。在正常狀態(tài)下，小膠質(zhì)細(xì)胞可以通過CX3CR1、TREM2 等免疫檢查點(diǎn)或顆粒蛋白前體途徑來防止它們對(duì)外界刺激的過度反應(yīng)[12]。但當(dāng)這些通路失調(diào)時(shí)則會(huì)引發(fā)或加劇神經(jīng)退行性變。

CX3CR1 屬于視紫紅質(zhì)樣G 蛋白偶聯(lián)受體，由355 個(gè)氨基酸組成，其細(xì)胞外環(huán)與胞外的n 端結(jié)構(gòu)域構(gòu)成的結(jié)合位點(diǎn)可以和其配體CX3CL1結(jié)合[13]。CX3CL1 又稱Fractalkine，是趨化因子CX3C 家族的唯一成員，由373 個(gè)氨基酸組成，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要表達(dá)于神經(jīng)元，有膜結(jié)合和可溶性兩種形式。膜結(jié)合形式的CX3CL1 是一種跨膜蛋白，其作為黏附物，與其唯一受體CX3CR1結(jié)合后，維持小膠質(zhì)細(xì)胞處于靜默狀態(tài)；而當(dāng)其由膜結(jié)合形式被ADAM0、ADAM17 等蛋白酶水解形成可溶性CX3CL1 時(shí)，則作為一種趨化因子，激活小膠質(zhì)細(xì)胞的替代激活途徑，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 型轉(zhuǎn)化并向感染或炎癥部位遷移[14-16]。研究[12]顯示，CX3CL1/CX3CR1 信號(hào)通路受損會(huì)導(dǎo)致小膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化（M1 型極化），并誘導(dǎo)IL-1β、IL-6、腫瘤壞死因子（TNF-α）、ROS、一氧化氮（NO）等炎癥因子的表達(dá)，引起神經(jīng)元損傷。例如，在hAPP 小鼠中敲除CX3CR1 后，小鼠腦內(nèi)的炎癥因子TNF-α 和IL-6 的水平升高，齒狀回中鈣結(jié)合蛋白的消耗增強(qiáng)，并加劇了與AD相關(guān)的功能障礙和認(rèn)知缺陷[10]。此外，有研究[17]顯示，在hTau 小鼠中敲除CX3CR1 后，Tau 蛋白的過度磷酸化會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)，并且出現(xiàn)與Tau 磷酸化增多相關(guān)的行為障礙，提示CX3CR1 也參與了小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)Tau 蛋白的清除過程[18-19]。因而，通過CX3CL1/CX3CR1 信號(hào)通路調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞的活性，可能成為阿爾茨海默病治療研究的一個(gè)有價(jià)值的靶點(diǎn)。

本研究首先篩選了苦參堿與LPS 的給藥劑量，MTT 檢測(cè)結(jié)果顯示，0～100 μmol·L-1的苦參堿以及0～10 μg·mL-1的LPS 對(duì)N9 細(xì)胞活力均無影響，這與Jiang 等[20]的研究結(jié)果相似。而Cunha 等[21]使用300 ng·mL-1的LPS 誘導(dǎo)N9 細(xì)胞發(fā)生極化，并升高了炎癥因子的水平，降低了CX3CR1 蛋白的表達(dá)；因而本文也選用此濃度作為L(zhǎng)PS 的給藥劑量，采用ELISA 法測(cè)定N9 細(xì)胞ROS 和IL-6、PGE2 的表達(dá)結(jié)果顯示，0.3、1、3及10 μmol·L-1的苦參堿可抑制LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活性氧ROS 的產(chǎn)生以及炎癥因子IL-6、PGE2 的釋放，明確了苦參堿在小膠質(zhì)細(xì)胞中的抗炎作用?？鄥A能夠抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的M1型極化，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 表型轉(zhuǎn)化，而這些功能與上述的CX3CR1 的功能相似。因此，本課題組后續(xù)通過Western blot 與免疫熒光檢測(cè)CX3CR1 蛋白含量的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LPS組的CX3CR1 相對(duì)表達(dá)量下降，與Panek 等[22]的研究一致。另外，本文也觀察到苦參堿能夠有效上調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞中CX3CR1 蛋白的表達(dá)。

綜上，苦參堿能夠抑制LPS 誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的M1 型極化，促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2 表型轉(zhuǎn)化，并上調(diào)CX3CR1的表達(dá)。后續(xù)，本研究將重點(diǎn)關(guān)注苦參堿與CX3CR1 之間的作用模式以及CX3CR1 與小膠質(zhì)細(xì)胞極化之間的聯(lián)系，從而為苦參堿治療神經(jīng)炎癥的機(jī)制研究提供更為有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。