田雪敏，石璐璐，董 輝，楊彩虹

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心腦血管病醫(yī)院婦科，銀川 750004）

子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，EC）是一種由持續(xù)的雌激素暴露、代謝異常、未育、遺傳基因易感性等原因引起的女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤。目前，EC 發(fā)病率逐年增高，在中國女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤中居第二位，在發(fā)達(dá)國家排名第一[1]。研究[2]發(fā)現(xiàn)，有多種miRNAs 可參與EC 的診斷、治療、預(yù)后等過程，為EC 的研究提供了新方向。miR-34 家族已被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中表達(dá)異常，因其可以被腫瘤抑制基因p53 直接調(diào)控，故其被認(rèn)為可以抑制腫瘤的發(fā)生[3]。miR-34b-5p 是miR-34家族成員之一，研究[4]表明，miR-34b-5p 可在多種癌癥中表達(dá)，且抑制腫瘤的增殖、遷移、侵襲等生物學(xué)行為。Grb2 相關(guān)結(jié)合蛋白1（Grb2-associated binder 1，Gab1）是細(xì)胞的骨架蛋白，參與細(xì)胞形態(tài)的維持。Gab1 也可以作為信號通路中的“放大器”，通過激活通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長并抑制其凋亡[5]。miR-34b-5p 在子宮內(nèi)膜樣腺癌（endometrioid adenocarcinoma，EEC）淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者中顯著下調(diào)，而在雌激素影響下，Gab1 在子宮內(nèi)膜中的表達(dá)水平隨月經(jīng)周期發(fā)生改變[6-7]，推測miR-34b-5p、Gab1 可能與EC 的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，但關(guān)于二者與EC 的關(guān)系尚未見報(bào)道。通過Targetscan（http://www.targetscan.org/vert_72/）和miRDB（http://mirdb.org/）生物學(xué)預(yù)測網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)，Gab1 是miR-34b-5p 的調(diào)控靶點(diǎn)。Gab1 基因是哺乳動物雷帕霉素靶點(diǎn)（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路的上游分子，可以傳遞磷酸化基團(tuán)至mTOR 通路，以引起mTOR 通路的激活，促進(jìn)腫瘤的增殖和侵襲。鑒于此，本研究主要探究miR-34b-5p 調(diào)控Gab1 的表達(dá)，介導(dǎo)mTOR通路在EC 細(xì)胞——人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞（human endometrial adenocarcinoma cells）AN3CA 中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞AN3CA（上海名勁生物科技有限公司）；DMEM 培養(yǎng)基（上海源培生物科技股份有限公司）；Certified Fetal Bovine Serum（FBS，Biological Industries 公司）；胰蛋白酶、青鏈霉素混合液（北京索萊寶科技有限公司）；引物miR-34b-5p（上海生工生物技術(shù)有限公司），引物U6（廣州市銳博生物科技有限公司）；PrimeScriptTMRT reagent Kit（Perfect Real Time，日本TaKaRa公司）；miRcute 增強(qiáng)型miRNA 熒光定量檢測試劑盒（SYBR Green，北京天根生化科技有限公司）；人子宮內(nèi)膜腺癌芯片（31 例癌和癌旁，上海芯超生物科技有限公司）；慢病毒：miR-34b-5p 過表達(dá)慢病毒載體（HBLV-has-miR-34b-Null-ZsGreen-PURO）、空載慢病毒（HBLV-ZsGreen-PURO 過表達(dá)對照組）均購自上海漢恒生物技術(shù)有限公司。CCK-8 試劑盒（APExBIO 公司）；全蛋白提取試劑盒、BCA 試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司）；PAGE 凝膠快速制備試劑盒（上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司）；一抗：Gab1、p-s6k（Novus Bio 公司），p-4EBP、p-mTOR 等抗體（Cell Signaling Technology公司），二抗：山羊抗鼠、山羊抗兔（Cell Signaling Technology公司）。熒光定量PCR儀（Bio-Rad）；AzureC300化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（AzureBiosystems 公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和分組 人子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞AN3CA 培養(yǎng)于含10%血清+1%雙抗青霉素/鏈霉素的DMEM（高糖）培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞匯合度達(dá)到80%～90%時(shí)，胰酶消化2 min，離心，重懸，按2×105個(gè)/孔接種至6 孔板，常規(guī)培養(yǎng)。根據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，取空載、miR-34b-5p 慢病毒加入6 孔板，每孔加入1 mL 完全培養(yǎng)基，4 h 后補(bǔ)全，24 h后換液，48～72 h 觀察熒光，96 h 加入嘌呤霉素（6 μg·mL-1），維持4 d。實(shí)驗(yàn)分為空白對照組（無處理，Control 組）、空載體組（轉(zhuǎn)染無意序列空載病毒，Nc 組）、實(shí)驗(yàn)組（轉(zhuǎn)染pre-miR-34b-5p 慢病毒，pre-miR-34b-5p 組）。

1.2.2 RT-qPCR 檢測Gab1、miR-34b-5p 在組織中的表達(dá)及miR-34b-5p 在細(xì)胞中的相對表達(dá)量 購買上海芯超生物科技公司人子宮內(nèi)膜腺癌芯片（31 例癌和癌旁），按試劑盒說明進(jìn)行RTqPCR 實(shí)驗(yàn)，檢測Gab1 和miR-34b-5p 在癌和癌旁組織中的相對表達(dá)量，Gab1 以β-actin 為內(nèi)參，miR-34b-5p 以U6 為內(nèi)參。收集Control 組、Nc組、pre-miR-34b-5p 組的細(xì)胞，用TRIzol 法提取總RNA，U6 下游引物、miR-34b-5p RT 代替試劑盒中引物，余按試劑盒說明將總RNA 逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，將獲得的cDNA 作為模板，進(jìn)行RT-qPCR檢測，操作按試劑盒說明進(jìn)行，以U6 為內(nèi)參。采用2－△△Ct法計(jì)算Gab1、mRNA 和miR-34b-5p 在各組的相對表達(dá)量，見表1。

表1 引物信息

1.2.3 Western blot 檢測AN3CA 細(xì)胞中Gab1 和p-mTOR、p-s6k 和p-4EBP 的表達(dá) 用細(xì)胞刮刮取各組細(xì)胞，加入RIPA 裂解液劇烈振蕩30 s，搖床上放置4 min，重復(fù)5 次（全程冰上操作），然后12 000 ×g，4 ℃離心15 min。BCA 蛋白含量檢測試劑盒測定總蛋白含量。取30 μg 總蛋白，用聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）分離蛋白，用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF 膜上。使用5%脫脂奶粉或5%的牛血清白蛋白（BSA）封閉90 min，加入特異性一抗Gab1（1∶2 000）、p-mTOR（1∶1 000）、p-s6k（1∶2 000）、p-4EBP（1∶2 000），β-actin（1∶5 000）作為內(nèi)參對照，4 ℃過夜。次日，回收一抗，洗膜，加入二抗（1∶3 000），在室溫下孵育1 h。用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像保存，Image J 分析Gab1、p-mTOR、p-s6k 和p-4EBP 灰度值，GraphPad Prism 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.4 雙熒光素報(bào)告基因在293T 細(xì)胞中檢測miR-34b-5p 與Gab1 的相關(guān)關(guān)系 針對miR-34b-5p 與Gab1 結(jié)合的種子序列區(qū)，構(gòu)建Gab1-3’端UTR 的野生序列和突變序列，并購置miR-34b-5p 的合成序列（minics）和陰性對照序列（negative control，NC），取生長狀態(tài)良好的293T細(xì)胞，將105個(gè)/孔的細(xì)胞接種至96 孔板中，使其第2 天匯合度達(dá)到50%～70%，將h-Gab1-3UTR、miR-34b-5p/NC 轉(zhuǎn)染至283T 細(xì)胞中，分為4組：NC mimics+Gab1-3UTR-wt、miR-34b-5p+Gab1-3UTR-wt、NC mimics+Gab1-3UTR-mu、miR-34b-5p+Gab1-3UTR-mu，常規(guī)培養(yǎng)48 h 后，按照Promega Dual-Luciferase system 試劑盒說明進(jìn)行檢測。

1.2.5 CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)miR-34b-5p 的AN3CA 細(xì)胞增殖情況 取在對數(shù)生長期的AN3CA細(xì)胞，將103個(gè)/孔細(xì)胞接種于96 孔板，依據(jù)試劑盒說明書分組操作，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，于培養(yǎng)箱內(nèi)分別培養(yǎng)0、24、48、72、96 h 后，加入10 μL的CCK-8 溶液，繼續(xù)培養(yǎng)2 h 后，用酶標(biāo)儀測450 nm 波長處吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率（%）=［（對照孔A 值-實(shí)驗(yàn)孔A 值）/（對照孔A 值-空白孔A 值）］×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

1.2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)miR-34b-5p 的AN3CA 細(xì)胞遷移能力 在6 孔板每孔背面畫5 條橫線，取各組細(xì)胞5×105個(gè)接種于其中，培養(yǎng)過夜，用200 μL 的槍頭垂直于背后的橫線劃痕，洗去劃下的細(xì)胞。于48 h 后，取樣拍照。用Image J 軟件計(jì)算細(xì)胞遷移率，遷移率（%）=［（0 h 劃痕寬度-48 h 劃痕寬度）/0 h 劃痕寬度］×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 26、GraphPad Prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，使用GraphPad Prism、Adobe Photoshop CS5、Image J 軟件繪制圖像。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t 檢驗(yàn)。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Gab1 和miR-34b-5p 在EC 及癌旁組織中的表達(dá)情況

RT-qPCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與癌旁組織相比，Gab1 在EC 組織中表達(dá)水平增高（t=6.900，P＜0.05），miR-34b-5p 在EC 組織中表達(dá)水平降低（t=6.495，P＜0.05），見圖1。

圖1 RT-qPCR 檢測Gab1 和miR-34b-5p 在EC 和癌旁組織中的表達(dá)

2.2 在293T 細(xì)胞中檢測miR-34b-5p 與Gab1 的相關(guān)關(guān)系

miR-34b-5p 與Gab1 的3’UTR 區(qū)具有2 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，序列模式見圖2A。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC mimics+Gab1-3UTR-wt 組相比，miR-34b-5p+Gab1-3UTR-wt 組的熒光素酶的表達(dá)水平下調(diào)（t=24.23，P＜0.05）；NC mimics+Gab1-3UTR-mu 組及miR-34b-5p+Gab1-3UTRmu 組的熒光素酶的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=0.19，P＞0.05），見圖2B。

圖2 雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)檢測miR-34b-5p 與Gab1 在293T 細(xì)胞中存在靶向結(jié)合關(guān)系

2.3 miR-34a-5p 慢病毒過表達(dá)AN3CA 細(xì)胞模型構(gòu)建

miR-34b-5p 過表達(dá)慢病毒載體成功感染AN3CA 細(xì)胞，見圖3A。Control 組、Nc 組、pre-miR-34b-5p 組miR-34b-5p cDNA 的相對表達(dá)水平分別為：（1.03±0.05）、（0.92±0.07）、（19.09±0.47），各組miR-34b-5p 表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=4371，P<0.05）。pre-miR-34b-5p 組miR-34b-5p 表達(dá)水平高于Control 組和Nc 組（t=61.20、70.58，P 均<0.05），提示miR-34b-5p 的過表達(dá)AN3CA細(xì)胞模型構(gòu)建成功，見圖3。

圖3 miR-34b-5p 過表達(dá)慢病毒AN3CA 細(xì)胞模型構(gòu)建

2.4 miR-34b-5p 過表達(dá)抑制AN3CA 細(xì)胞的遷移和增殖

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各組細(xì)胞遷移率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=72.26，P<0.05），與pre-miR-34b-5p 組相比，Control 組和Nc 組劃痕寬度降低（t=10.52、13.17，P<0.05），見圖4A、B。CCK-8 增殖實(shí)驗(yàn)表明，與pre-miR-34b-5p 組相比，其他兩組在第3 天時(shí)細(xì)胞增殖上升（P<0.05），見圖4C。

圖4 miR-34b-5p 過表達(dá)抑制AN3CA 細(xì)胞的遷移和增殖

2.5 過表達(dá)miR-34b-5p 抑制AN3CA 細(xì)胞Gab1蛋白及p-mTOR、p-s6k 和p-4EBP 蛋白的表達(dá)

Western blot 結(jié)果顯示，各組細(xì)胞中Gab1、pmTOR、p-s6k、p-4EBP 蛋白表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=45.74、38.32、40.96、504.5，P 均<0.05）。與miR-34b-5p 過表達(dá)組相比，空白對照組（t=8.80、15.21、5.34、177.9，P<0.05）和空載體（t=5.73、8.07、14.57、8.96，P<0.05）組Gab1、p-mTOR、ps6k、p-4EBP 蛋白表達(dá)量均上升，見圖5。

圖5 miR-34b-5p 過表達(dá)抑制AN3CA 細(xì)胞Gab1 蛋白和p-mTOR 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

3 討論

EC 是起源于子宮上皮細(xì)胞的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，早期EC 預(yù)后較好，但高級別、復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性子宮內(nèi)膜樣腺癌預(yù)后較差[8]。故對于EC 的機(jī)制研究仍然很有必要。研究[9-12]表明，多種miRNAs 在EC 中呈現(xiàn)高表達(dá)或低表達(dá)水平，從而起到促癌或抑癌作用。在多種癌癥中已得到證實(shí)，miR-34b-5p 可抑制癌細(xì)胞的生物學(xué)行為，例如，miR-34b-5p 可抑制肺癌的侵襲、腎癌的增殖、彌漫大B 細(xì)胞淋巴瘤的侵襲[13-15]。研究[16]表明，miR-34b-5p 是EC 治療的關(guān)鍵標(biāo)靶，但還未涉及其對EC 作用的具體機(jī)制研究。本課題組在EC組織中證實(shí)miR-34b-5p 低表達(dá)，為進(jìn)一步研究miR-34b-5p 在EC 中的具體機(jī)制，本研究通過miR-34b-5p 過表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染AN3CA 細(xì)胞，構(gòu)建了miR-34b-5p 過表達(dá)細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-34b-5p 可以抑制EC 細(xì)胞AN3CA 的增殖和遷移，這與miR-34b-5p 在其他腫瘤中發(fā)揮的抑癌功能研究結(jié)果一致。

Gab1 在受體酪氨酸激酶、細(xì)胞因子受體和G 蛋白偶聯(lián)受體激活后，可以調(diào)控受體下游的信號[17]，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為[18]。本研究通過生信分析發(fā)現(xiàn)Gab1 是miR-34b-5p 的靶基因，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了二者的靶向相關(guān)性。此結(jié)果與Qiu 等[19]在肺損傷模型中，證明miR-34b-5p 與Gab1 有靶向關(guān)系的結(jié)論相符。同時(shí)，EC 組織cDNA 芯片顯示Gab1 過表達(dá)，與miR-34b-5p 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，AN3CA 細(xì)胞中miR-34b-5p 過表達(dá)可使Gab1 蛋白的表達(dá)量降低，均證實(shí)了二者的互作關(guān)系。Gab1是多位點(diǎn)對接蛋白，通過協(xié)調(diào)參與絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK）和磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）信號，參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[20]。mTOR 為哺乳動物雷帕霉素的靶點(diǎn)，PI3K/Akt 和MAPK/ERK 信號通路可激活mTOR，從而激活下游分子4EBP1 和S6K1，進(jìn)而增強(qiáng)蛋白質(zhì)的合成，促進(jìn)腫瘤的生長、增殖、遷移及腫瘤血管的生成[21]。本研究證實(shí)，miR-34b-5p 的過表達(dá)下調(diào)Gab1 的同時(shí)可抑制p-mTOR、p-s6k、p-4EBP 的蛋白水平，證實(shí)其磷酸化蛋白水平均下調(diào)，這或許解釋了EC 細(xì)胞AN3CA 增殖和遷移被抑制的原因。

綜上所述，miR-34b-5p 可以靶向抑制Gab1蛋白的表達(dá)，從而抑制p-mTOR、p-s6k、p-4EBP等磷酸化蛋白水平，抑制mTOR 通路從而抑制AN 細(xì)胞的增殖和遷移能力。在未來EC 的臨床診療領(lǐng)域內(nèi)，針對miR-34b-5p 靶點(diǎn)干預(yù)治療可能成為新的診療手段和方式。