張 靜，彭靖淇

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院病理科，烏魯木齊 830000；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院外科，烏魯木齊 830000）

卡波西肉瘤主要是由卡波西肉瘤相關(guān)病毒（KSHV）感染內(nèi)皮細(xì)胞引起的血管源性惡性腫瘤[1]。miRNAs 是一種非編碼小分子RNA，通過結(jié)合靶基因的3'非翻譯區(qū)（3'UTR）去降低或沉默靶基因的表達(dá)而發(fā)揮強(qiáng)大的調(diào)控作用。KSHV miRNA 也能通過復(fù)雜的機(jī)制誘導(dǎo)卡波西肉瘤的發(fā)生。課題組前期實(shí)驗(yàn)中通過對(duì)卡波西肉瘤miRNA 差異表達(dá)譜的篩選，證實(shí)卡波西肉瘤中miR-K1-5p表達(dá)明顯上調(diào)[2]，進(jìn)一步的體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在卡波西肉瘤細(xì)胞株中miR-K1-5p 可以促進(jìn)G1/S 期轉(zhuǎn)換，但其中的機(jī)制并不清楚。因此，本文檢測(cè)miR-K1-5p 相關(guān)的G1/S 期基因編碼的蛋白在卡波西肉瘤中的表達(dá)，以期為進(jìn)一步研究miR-K1-5p對(duì)卡波西肉瘤細(xì)胞周期的調(diào)控奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

收集新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院及市友誼醫(yī)院存檔的40 例卡波西肉瘤石蠟包埋塊，以新疆醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院40 例存檔的血管瘤石蠟包埋塊做對(duì)照（經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)實(shí)施，批件編號(hào)2019XE0133），由兩名高年資病理醫(yī)師獨(dú)立閱片后納入?？úㄎ魅饬龌颊撸耗行?5 例，女性5 例，年齡32～82 歲；血管瘤患者：男性24 例，女性16例，年齡1～80 歲。

1.2 主要試劑

免疫組化抗體均購自武漢博士德工程有限公司：細(xì)胞周期素依賴蛋白激酶抑制劑4（CDKN4）、細(xì)胞周期蛋白A（CCNA）、細(xì)胞周期蛋白D2（CCND2）、周期素依賴性激酶2（CDK2）、周期素依賴性激酶4（CDK4）。

1.3 篩選miR-K1-5p 的靶基因

通過生物信息軟件miRDB 和TargetScan Custom 篩選miR-K1-5p 的靶基因。miRDB：www.mirdb.org；TargetScan: http://www.targetscan.org/vert_60/。

1.4 確定miR-K1-5p 和靶基因的信號(hào)通路，分析通路上關(guān)鍵基因

通過生物信息數(shù)據(jù)庫Gene Ontology（GO）、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）分析靶基因的信號(hào)通路及通路上的關(guān)鍵基因。

1.5 免疫組化（IHC）檢測(cè)

切片放置65 ℃烤箱2 h；抗原修復(fù)，3%H2O2消除內(nèi)源性過氧化物酶；加入CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 一抗，4 ℃過夜；二抗孵育；DAB顯色復(fù)染，封片。

1.6 結(jié)果判斷

隨機(jī)選擇10 個(gè)400 倍（直徑0.05 cm）視野判讀結(jié)果。1）著色情況：無著色為0 分，淡黃色為1分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。2）陽性細(xì)胞數(shù)：1%～10%為1 分，11%～50%為2 分，51%～75%為3分，≥76%為4 分。兩者相加的和＜3 分視為陰性表達(dá)，≥3 分視為陽性表達(dá)。CDKN4、CCNA、CCND2、CDK4 為腫瘤梭形細(xì)胞胞核著色；CDK2 以腫瘤梭形細(xì)胞胞漿著色為主，部分胞核著色。由兩名高年資病理醫(yī)師共同判讀結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料組間比較采用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 秩相關(guān)分析。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-K1-5p 的靶基因

通過生物信息軟件篩選CDKN4 基因?yàn)閙iRK1-5p 的靶基因，結(jié)合位點(diǎn)如表1所示。

表1 3'UTR of CDKN4 與miR-K1-5p 的結(jié)合位點(diǎn)

2.2 miR-K1-5p 與靶基因的信號(hào)通路和通路上的關(guān)鍵基因

通過生物信息數(shù)據(jù)庫GO 和KEGG 分析：miR-K1-5p 和靶基因CDKN4 參與細(xì)胞周期信號(hào)通路，通路下游的關(guān)鍵基因?yàn)镃CNA、CCND2、CDK2、CDK4。

2.3 CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 在卡波西肉瘤與血管瘤中的表達(dá)

卡波西肉瘤與血管瘤中CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 的表達(dá)情況見圖1。CDKN4 在卡波西肉瘤中的陽性率低于血管瘤中的陽性率（P＜0.05）；CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 在卡波西肉瘤中的陽性率均高于血管瘤中的陽性率（P均＜0.05），見表2。

表2 免疫組化檢測(cè)CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 在卡波西肉瘤及血管瘤中的表達(dá)［例（%）］

圖1 免疫組化檢測(cè)CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 在卡波西肉瘤及血管瘤中的表達(dá)

2.4 CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 與卡波西肉瘤患者性別、年齡的關(guān)系

不同性別、年齡卡波西肉瘤患者的CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 陽性表達(dá)率差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 均＞0.05），見表3。

表3 CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 與卡波西肉瘤患者性別、年齡的關(guān)系［例（%）］

2.5 卡波西肉瘤中CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 表達(dá)的相關(guān)性分析

在卡波西肉瘤患者中，CDKN4 的表達(dá)與CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 均呈負(fù)相關(guān)，CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 的表達(dá)互為正相關(guān)關(guān)系（P 均＜0.05），見表4。

表4 卡波西肉瘤中CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 表達(dá)的相關(guān)性（rs 值）

3 討論

卡波西肉瘤是血管及梭形細(xì)胞增生伴侵襲特征的惡性間葉源性腫瘤[3]，分為經(jīng)典型、艾滋病病毒（AIDS）相關(guān)型、非洲型及免疫抑制型。編碼miRNA 的KSHV 是引起卡波西肉瘤最主要的致瘤病毒。miRNA 作為一類特殊的調(diào)控分子已受到科學(xué)界的廣泛關(guān)注[4-7]，它們調(diào)控細(xì)胞的周期、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、侵襲等多種生物學(xué)行為，并廣泛參與基因表達(dá)及細(xì)胞通路轉(zhuǎn)導(dǎo)等[8]，與腫瘤學(xué)、病毒學(xué)等領(lǐng)域密切相關(guān)[9-10]。KSHV miRNA 也可以通過沉默轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)控宿主細(xì)胞的周期等不同途徑誘導(dǎo)卡波西肉瘤的發(fā)生。Wu 等[11]對(duì)卡波西肉瘤及瘤旁組織行RTq-PCR 檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)包括miR- K1-5p 在內(nèi)的13 個(gè)KSHV miRNA 在卡波西肉瘤中表達(dá)均上調(diào)，推測(cè)KSHV miRNA 扮演促癌角色[12]。進(jìn)一步的細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)證實(shí)miRK1-5p 能夠縮短細(xì)胞周期，加速細(xì)胞增殖，推測(cè)miR-K1-5p 可能與細(xì)胞周期的調(diào)控密切相關(guān)。

由于miRNA 通過影響靶基因的翻譯而發(fā)揮其生物學(xué)作用，因此研究miRNA 功能的核心是尋找靶基因。本研究通過基因軟件篩選CDKN4為miR-K1-5p 的靶基因，通過基因數(shù)據(jù)庫分析靶基因參與細(xì)胞周期信號(hào)通路，通路下游的關(guān)鍵基因?yàn)镃CNA、CCND2、CDK2、CDK4，它們編碼的蛋白在細(xì)胞周期中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞周期有G1/S 期和G2/M 期兩個(gè)重要檢查點(diǎn)，從細(xì)胞周期進(jìn)程來看，G1/S 期的檢查點(diǎn)比G2/M 期更重要。CDKN4 屬于細(xì)胞周期非特異性抑制蛋白，是G1期負(fù)性調(diào)控蛋白，通過與CCN-CDK 復(fù)合物結(jié)合并抑制其活性，發(fā)揮阻礙G1/S 期轉(zhuǎn)化和細(xì)胞增殖的作用，避免DNA 錯(cuò)誤復(fù)制[13-15]。CCNA 在G1晚期表達(dá)，CCND2 在G1 期早期表達(dá)[16-17]，CDK2和CDK4 是G1 期-S 期轉(zhuǎn)變的主要限速因子，形成CCNA/CDK2 及CCND2/CDK4 復(fù)合物后促進(jìn)G1/ S轉(zhuǎn)化[18-19]。因此，CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2 和CDK4 是調(diào)控G1/S 期轉(zhuǎn)換的5 個(gè)重要蛋白，其表達(dá)異?？赡軐?dǎo)致腫瘤的發(fā)生。

本研究使用免疫組化的方法在卡波西肉瘤（血管瘤為對(duì)照組）中檢測(cè)CDKN4、CCNA、CCND2、CDK2 和CDK4 的表達(dá)情況。血管瘤是血管源性的良性腫瘤，全身任何部位均可發(fā)生，大體上形成境界較清楚的藍(lán)-紫-紅色的斑點(diǎn)或結(jié)節(jié)，光鏡下由大小不等的血管腔構(gòu)成；卡波西肉瘤是血管源性的惡性腫瘤/肉瘤，多發(fā)生在四肢，初為藍(lán)-紅色的斑片（斑點(diǎn)），后形成斑塊及結(jié)節(jié)，光鏡下以梭形細(xì)胞增生及血管之間含有紅細(xì)胞的狹縫狀腔隙為特點(diǎn)。血管瘤與卡波西肉瘤是組織起源相同的良惡性腫瘤，大體形態(tài)及鏡下特征均有相似之處，具有良好的可比性。本研究發(fā)現(xiàn)：與血管瘤（對(duì)照組）相比，CDKN4 在卡波西肉瘤中表達(dá)下調(diào)；CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 在卡波西肉瘤中表達(dá)上調(diào)。在卡波西肉瘤中CDKN4 的表達(dá)與CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 均呈負(fù)相關(guān)，CCNA、CCND2、CDK2、CDK4 的表達(dá)互為正相關(guān)，推測(cè)在卡波西肉瘤中miR-K1-5p 靶向CDKN4 使其表達(dá)明顯下調(diào)，減弱了對(duì)CCNA/CDK2、CCND2/CDK4的抑制作用，引起其表達(dá)上調(diào)（CCNA 與CCND2的過度表達(dá)可導(dǎo)致CDK2 和CDK4 的激活），損傷G1/S 關(guān)卡，引起細(xì)胞增殖、周期紊亂，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。在卡波西肉瘤中，CDKN4、CCNA/CDK2、CCND2/CDK4 與患者的性別、年齡均無關(guān)，可能與它們?cè)诳úㄎ魅饬霭l(fā)生中功能的復(fù)雜性有關(guān)。

綜上所述，卡波西肉瘤中，CDKN4、CCNA/CDK2、CCND2/CDK4 的異常表達(dá)可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。CDKN4 的表達(dá)下調(diào)和CCNA/CDK2、CCND2/CDK4 的過度表達(dá)可作為引起卡波西肉瘤細(xì)胞周期異常的生物學(xué)指標(biāo)，其分子機(jī)制可能與CDKN4/CCN/CDK 通路有關(guān)，而它們作為G1/S 期相關(guān)的重要蛋白，有望成為卡波西肉瘤的治療靶點(diǎn)。