王 芳，韓彩玲，任麗蕓，陳 華

（1.寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院婦科，銀川 750004；3.寧夏銀川市第二人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，銀川 750021）

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMs）是一種嚴(yán)重影響女性身心健康的慢性激素依賴性疾病，并可發(fā)生周期性盆腔疼痛、性交疼痛及不孕等[1]。50%～90%的EMs 青春期女性有痛經(jīng)或慢性盆腔疼痛，但目前控制EMs 婦女盆腔疼痛仍是一項挑戰(zhàn)[2]。目前，關(guān)于EMs 的疼痛發(fā)病機(jī)制仍有爭議，藥物治療主要包括雌孕激素相關(guān)藥物。EMs患者神經(jīng)纖維的異常分布、神經(jīng)生長因子（nerve growth factor，NGF）的異常表達(dá)與其疼痛密切相關(guān)[3]。有研究[4-6]顯示，NGF 除了作為重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子外，還可以誘導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）/環(huán)腺苷酸應(yīng)答元件結(jié)合蛋白（CREB）表達(dá)增加，增加機(jī)體對膝骨關(guān)節(jié)炎傷害性刺激的敏感性，參與疼痛的發(fā)生，但其在EMs 中的具體作用機(jī)制尚不清楚。因此，本研究借助雌激素及其抑制劑氟維司群藥物干預(yù)EMs 在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，檢測上述因子表達(dá)變化，探討其在EMs 疼痛發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

選取2019年3月至2020年10月就診于寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院因卵巢子宮內(nèi)膜異位囊腫行手術(shù)治療的患者9 例，分離培養(yǎng)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞作為EMs 組；收集同期因其他卵巢良性腫瘤行手術(shù)治療的患者9 例，分離培養(yǎng)子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞作為對照組。該研究已獲得寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（KYLL-2021-736）。

1.2 主要試劑

兔抗NGF 多克隆抗體（ab62557）、兔抗CREB多克隆抗體（ab52628）、β-actin 抗體（ab8227）、山羊抗兔HRP 二抗（ab6721）均購自英國Abcam 公司；兔抗MAPK 多克隆抗體（sc-377400）購自美國Santa Cruz Biotechnology 公司；17-β 雌二醇及氟維司群購自美國MCE 公司；SYBRRPremix Ex Taq（RR820A）、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（RR047A）均購自日本Takara 公司；BCA蛋白提取檢測試劑盒購自凱基公司；波形蛋白、角形蛋白均購自英國Abcam 公司。

1.3 方法

1.3.1 原代細(xì)胞培養(yǎng) 獲取新鮮的EMs 患者及對照組患者在位子宮內(nèi)膜組織，分別置于PBS 溶液反復(fù)沖洗去除血污，將內(nèi)膜組織剪成1 mm×1 mm×1 mm 大小，移至離心管中，加入膠原酶IV，消化10 min 左右，靜置離心管，將上層細(xì)胞液移至新離心管，加入培養(yǎng)基終止消化，1 000 r·min-1離心，取上清液1 mL 加入60 mm 培養(yǎng)皿中，加入2 mL 配制好的培養(yǎng)基，搖勻后顯微鏡下觀察細(xì)胞均勻分布于培養(yǎng)皿中，放置在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后換液觀察。

1.3.2 藥物配制 將細(xì)胞培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基去掉，對照組加入新鮮培養(yǎng)基，雌激素組加入含有100 nmol·L-1雌激素的培養(yǎng)基，氟維司群組加入含有100 nmol·L-1氟維司群的培養(yǎng)基。細(xì)胞放置在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后，對細(xì)胞進(jìn)行處理。

1.3.3 細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色檢測EMs 在位內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞NGF、CREB 及MAPK 定位表達(dá) 待細(xì)胞匯合度為70%～90%時，棄掉培養(yǎng)基，加入1 mL 0.25%的胰酶，37 ℃孵育1～2 min。將培養(yǎng)瓶中液體移至新離心管中，1 000 r·min-1速度離心5 min。去掉上清液，加入新鮮培養(yǎng)基吹打均勻，將細(xì)胞懸液滴入細(xì)胞計數(shù)板，使細(xì)胞懸液充滿蓋玻片與計數(shù)板間，靜置2～3 min，通過顯微鏡計算細(xì)胞總量。將細(xì)胞以5×104個/孔的量接種于24孔板，每孔加入500 μL 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h。4%多聚甲醛室溫固定。加入含0.1% Triton X-100 的PBS，室溫透化10 min。5% BSA 封閉液室溫封閉30 min。吸去液體，分別加入1% BSA 稀釋的兔CREB 抗體（稀釋比1∶200）、兔MAPK 抗體（稀釋比1∶200）、兔NGF抗體（稀釋比1∶200），4 ℃孵育過夜，PBS 洗滌。山羊抗兔二抗（稀釋比1∶1 000）避光室溫孵育1 h，PBS 洗滌。DAPI 染液室溫染色5 min，PBS 洗滌。熒光顯微鏡觀察拍照，顯微鏡下細(xì)胞核為藍(lán)色，使用488 標(biāo)記的蛋白為綠色。

1.3.4 Western blot 蛋白檢測各組細(xì)胞中NGF、CREB 及MAPK 蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，棄掉培養(yǎng)液，并用1 mL 的PBS 緩沖液清洗1 次。按照0.2 mL/孔加入細(xì)胞裂解液，置于-80 ℃超低溫冰箱中，使細(xì)胞完全裂解。收集充分裂解后的細(xì)胞，置于EP 管中離心（4 ℃，1 000 r·min-1），留取細(xì)胞上清液，-20 ℃下保存?zhèn)溆?。按照BCA 蛋白提取試劑盒和檢測試劑盒說明提取總蛋白并測定蛋白濃度。每個加樣孔上樣30 μg 蛋白，電泳、PVDF膜轉(zhuǎn)膜2 h，再經(jīng)5%脫脂牛奶室溫封閉3～4 h，一抗用TBST 溶液按照說明書操作稀釋（NGF 1 ∶1 000，MAPK 1∶1 000，CREB 1∶1 000，β-actin 1∶10 000），4 ℃孵育過夜。經(jīng)過室溫復(fù)溫，二抗孵育用TBST 按照1∶5 000 稀釋，TBST 洗滌，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。運(yùn)用Image J 軟件分析蛋白相對表達(dá)量。

1.3.5 實時熒光定量PCR 檢測各組細(xì)胞中NGF、CREB 及MAPK mRNA 表達(dá) 實時熒光定量PCR 檢測NGF、MAPK 及CREB 的mRNA 表達(dá)：提取細(xì)胞中的總RNA，使用微量分光光度計檢測RNA 濃度和純度，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄PCR 反應(yīng)，以融解曲線判斷PCR 反應(yīng)的特異性，以β-actin 為內(nèi)參，所得各樣品Ct 值利用公式計算各樣品mRNA 的相對表達(dá)量。

計算公式：

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

所有實驗數(shù)據(jù)均使用GraphPad Prism 6 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩樣本均數(shù)比較采用t 檢驗，多組間比較采用ANOVA 分析。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞分離鑒定

利用差速離心法分離培養(yǎng)原代子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，用細(xì)胞免疫化學(xué)法進(jìn)行細(xì)胞鑒定，顯微鏡下觀察到波形蛋白組細(xì)胞呈長梭形，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)染成棕黃色，角蛋白組與PBS 組細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)未見染色，即鑒定細(xì)胞為子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞，見圖1。

圖1 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的鑒定（細(xì)胞免疫化學(xué)法×50）

2.2 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中NGF、MAPK 及CREB蛋白熒光染色

細(xì)胞免疫熒光染色結(jié)果顯示，熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞核為藍(lán)色，目的蛋白為綠色。子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中NGF、MAPK 及CREB 蛋白熒光染色均能看到綠色熒光產(chǎn)生，且NGF、MAPK 及CREB蛋白主要定位于胞漿中，見圖2。

圖2 子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞熒光染色觀察結(jié)果（細(xì)胞免疫熒光×200）

2.3 NGF、MAPK 及CREB 蛋白在EMs 組和對照組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)情況

Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，NGF、MAPK 及CREB 蛋白在EMs 組子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)均升高（P 均<0.05），見圖3。

圖3 各組細(xì)胞中NGF、MAPK、CREB 蛋白表達(dá)水平

2.4 雌激素與氟維司群作用后對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中NGF、MAPK 及CREB 蛋白表達(dá)的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與對照組相比，加入雌激素后，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中NGF、MAPK 及CREB 的蛋白表達(dá)水平均升高（P 均＜0.01）；給予氟維司群后，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中NGF、MAPK 及CREB 的蛋白表達(dá)水平均降低（P 均＜0.05），見圖4。

圖4 雌激素與氟維司群作用后各組細(xì)胞中NGF、MAPK、CREB 蛋白表達(dá)水平

2.5 雌激素與氟維司群作用后對子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中NGF、MAPK 及CREB mRNA 表達(dá)的影響

實時熒光定量PCR 結(jié)果顯示，與對照組相比，加入雌激素后，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中NGF、MAPK、CREB 的mRNA 表達(dá)水平均升高（P 均＜0.01）；加入氟維司群后，子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中NGF、MAPK、CREB 的mRNA 表達(dá)水平均降低（P 均＜0.01），見圖5。

圖5 各組細(xì)胞中NGF、MAPK、CREB 的mRNA 表達(dá)水平

3 討論

EMs 作為以不同程度疼痛綜合征為主要癥狀的雌激素依賴性全身性疾病，疼痛已成為威脅患者生活質(zhì)量的主要因素。目前其疼痛發(fā)病機(jī)制仍不明確。治療方式的核心是非甾體激素類藥物的應(yīng)用，許多激素和激素聯(lián)合用藥誘導(dǎo)了子宮內(nèi)膜和子宮內(nèi)膜異位病灶蛻膜化的假孕狀態(tài)，這些藥物在一定程度上可緩解EMs 疼痛[7]。已有研究[8-9]報道，作為一種疼痛介質(zhì)，神經(jīng)生長因子NGF 的異常表達(dá)與EMs 疼痛發(fā)生存在明顯的相關(guān)性，其可能直接參與了EMs 疼痛過敏和炎癥性疼痛反應(yīng)。本課題組前期已經(jīng)證實神經(jīng)生長因子NGF、MAPK 及CREB 在EMs 患者組織中高表達(dá)，揭示其與EMs 疼痛發(fā)生密切相關(guān)[6]。本研究通過原代分離培養(yǎng)子宮內(nèi)膜在位間質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞模型鑒定成功后給予雌激素及其抑制劑藥物氟維司群，觀察NGF、MAPK 及CREB 蛋白及mRNA表達(dá)水平變化，探討雌激素相關(guān)藥物在內(nèi)異癥疼痛治療中的可能作用。

疼痛病理生理學(xué)是一個被廣泛研究的巨大課題。深部浸潤的異位細(xì)胞的存在可能與局部腹膜炎癥有關(guān)，從而導(dǎo)致組織損傷釋放與疼痛相關(guān)聯(lián)的化學(xué)介質(zhì)，這是EMs 可能涉及的疼痛機(jī)制[10-12]。NGF 是最早從神經(jīng)組織中分離出來的神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員，是調(diào)節(jié)神經(jīng)生長、增殖、分化和存活的主要介質(zhì)[13]。NGF 已經(jīng)被證實在各種急慢性病理性疼痛的產(chǎn)生中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。正常人體注射NGF 后可在局部產(chǎn)生痛覺過敏反應(yīng)，其可能機(jī)制是[14-15]：1）NGF 作為一種疼痛介質(zhì)，參與了外周痛覺致敏反應(yīng)和持續(xù)性疼痛發(fā)生；2）NGF 可使相關(guān)神經(jīng)生長因子激活并觸發(fā)絲裂原蛋白激酶/細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶（MAPK/ERK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)，誘導(dǎo)CREB 相關(guān)基因表達(dá)增多，調(diào)控疼痛反應(yīng)。EMs 相關(guān)研究[9]表明，神經(jīng)因子NGF 的異常表達(dá)可能通過降低患者的疼痛閾值，增加疼痛敏感性，從而參與EMs疼痛的發(fā)生。課題組也從蛋白及基因水平證實NGF、MAPK 等因子在EMs 患者組織中高表達(dá)，但目前有關(guān)NGF 在EMs 中的研究仍主要停留在臨床組織相關(guān)性驗證層面，其在病理性疼痛情況下具體通過何種調(diào)控機(jī)制發(fā)揮作用仍不明確。有研究[16]報道，MAPK 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被發(fā)現(xiàn)參與了NGF 的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，共同介導(dǎo)了病理性疼痛的發(fā)生。因此，為了進(jìn)一步明確NGF 參與EMs 疼痛發(fā)生的具體機(jī)制，本研究建立EMs 原代間質(zhì)細(xì)胞模型，采用免疫熒光證實了NGF、MAPK 及CREB蛋白主要在子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞胞漿中表達(dá)，結(jié)合Western blot 及qRT-PCR 證實EMs 患者間質(zhì)細(xì)胞中NGF、MAPK 及CREB 蛋白表達(dá)水平升高，借助臨床常見的雌激素及其抑制劑藥物氟維司群干預(yù)，檢測了干預(yù)后子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中NGF、MAPK 及CREB 蛋白及mRNA 表達(dá)變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，雌激素組NGF、MAPK 及CREB蛋白及mRNA 表達(dá)均升高，而雌激素抑制劑組（氟維司群組）NGF、MAPK 及CREB 蛋白及mRNA 表達(dá)均下降。因此，雌激素抑制劑很有可能通過抑制NGF/MAPK 途徑發(fā)揮治療EMs 疼痛的作用。

綜上所述，EMs 患者間質(zhì)細(xì)胞中存在參與病理性疼痛的化學(xué)介質(zhì)NGF 的高表達(dá)，雌激素抑制劑氟維司群可以拮抗子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞中NGF、MAPK 及CREB 蛋白及mRNA 的表達(dá)，揭示雌激素抑制劑很有可能通過抑制NGF/MAPK 途徑減輕EMs 相關(guān)疼痛。