朱小靜，張 媛，孟梅霞

（陜西省西安市人民醫(yī)院（西安市第四醫(yī)院）西安 710004）

慢性腎臟病（chronic kidney disease，CKD）已經(jīng)成為全球嚴重威脅人類健康的重大公共衛(wèi)生問題。流行病學調(diào)查[1]顯示，我國成年人群中CKD的患病率為10.8%，據(jù)此估計我國現(xiàn)有成年慢性腎臟病患者達1.2 億例，由此造成了龐大的透析人群。雖然血液和腹膜透析這些腎臟替代治療為CKD 患者的生活質(zhì)量及存活時間帶來了極大的改善，但與一般人群相比，這些患者的全因死亡率仍較高，特別是心血管疾病、感染及惡性腫瘤[2-3]。多項研究[4-6]證實，CKD 患者具有獨特的全身性病理生物學改變，存在明顯的免疫功能紊亂。免疫系統(tǒng)是機體內(nèi)重要的防御系統(tǒng)，T 淋巴細胞亞群的輔助細胞CD4+/CD8+比例失調(diào)可影響人體免疫系統(tǒng)，導致機體免疫水平處于抑制狀態(tài)而發(fā)生腫瘤、肝炎、自身免疫病等[7-9]多種疾病。B 淋巴細胞在機體體液免疫方面也發(fā)揮著重要作用。有研究[10]證實，B 淋巴細胞在終末期腎臟?。╡ndstage renal disease，ESRD）過程中具有重要作用。NK 細胞在病毒、腫瘤、急性白血病等[11-12]多種疾病中發(fā)揮著重要的作用，其發(fā)生作用的機制已被充分認識。除了傳統(tǒng)觀點認為的代謝、血流動力學以及基因等[13]危險因素外，免疫因素也被證明在CKD 的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用。本課題旨在探討CKD 患者在不同階段免疫系統(tǒng)的變化趨勢，以及與炎癥指標C-反應蛋白（CRP）的相關(guān)性，從而為控制疾病并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展提供新的思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象

所有對象均來自西安市人民醫(yī)院住院及腹透管理中心、血液凈化中心，共91 例。以簡化的腎臟病膳食研究MDRD 公式計算腎小球濾過率（glo-merular filtration rate，GFR），GFR［mL/（min·1.732）］=186×（Scr）-1.154×（年齡）-0.203，女性×0.742。根據(jù)GFR 進行CKD 分期，分為CKD3期（GFR 為30～59）、CKD4 期（GFR 為15～29）、CKD5 期（GFR＜15），CKD5 期按照治療方式分為未行血液透析（NHD）、血液透析（HD）及腹膜透析（PD）。CKD3 期共22 例，男性12 例，女性10例，平均年齡（58.9±19.0）歲；CKD4 期共19 例，其中男性10 例，女性9 例，平均年齡（58.3±13.1）歲；CKD5 期共50 例，其中NHD 組14 例，男性8例，女性6 例，平均年齡（54±20.1）歲；HD 組18例，男性9 例，女性9 例，平均年齡（48.3±17.5）歲；PD 組18 例，男性9 例，女性9 例，平均年齡（46.6±15.0）歲。所有患者原發(fā)病均為慢性腎小球腎炎，同時符合以下條件：血壓控制穩(wěn)定；近3個月未合并感染、心力衰竭；近1 個月內(nèi)未輸血；無肝臟與結(jié)締組織性疾??；非妊娠或哺乳期婦女；未合并心腦血管及造血系統(tǒng)等嚴重并發(fā)癥及其他嚴重原發(fā)?。粺o嚴重精神疾?。晃从妹庖咭种苿┑扔绊懕緦嶒灆z測結(jié)果的藥物。若出現(xiàn)其中一項或多項與以上要求不符則無法入組。血透患者均符合尿毒癥期診斷標準且已規(guī)律透析（3 次/周）3 個月以上，透析劑量每次4 h，使用低分子肝素抗凝，透析器膜均為聚砜膜，膜面積1.2～1.5 m2，血流量200～250 mL·min-1，透析液流量500 mL·min-1。采用低鈣無糖透析液。腹透患者符合尿毒癥診斷標準且已規(guī)律腹透3 個月以上，采用低鈣腹透液，每日置換液量8 000 mL。

對照組20 例，源于我院體檢中心的健康志愿者，其中男性12 例，女性8 例，平均年齡（48.9±11.4）歲，無高血壓糖尿病史，無肝炎結(jié)核等疾病史，無相關(guān)免疫性疾病及近期感染史。該研究得到西安市人民醫(yī)院倫理委員會的批準，所有參與調(diào)查的患者及志愿者均知情同意。

1.2 試劑和儀器

CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5、CD3-FITC/CD16+56-PE、CD3-FITC/CD19-PE、mouse IgG1- RD1/IgG1-ECD/IgG1-PC5（Beckman Coulter USA）；紅細胞裂解液、固定緩沖液（FBS）、BD FACS Calibur 流式細胞儀、流式上樣管（美國BD 公司）；鹽酸鹽緩沖液（PBS，由西安交通大學免疫組化實驗室提供）；淋巴細胞分離液（美國Amresco 公司）；高速冷凍離心機、各種規(guī)格移液槍（德國Eppendorf 公司）；各種規(guī)格EP 管（湖北孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司）；15 mL 及50 mL 離心管（美國Sigma 公司）；超低溫冰箱（美國REVCO 公司）。

1.3 標本制備及流式分析過程

1.3.1 血常規(guī)及有關(guān)生化指標的測定 所有入選患者及志愿者晨起空腹抽肝素抗凝血2 mL×2管，促凝血3 mL×1 管（血液透析患者上機治療前采血），抗凝血2 mL 送檢驗科行血常規(guī)檢查（紅細胞及血紅蛋白），促凝血3 mL 送檢驗科行腎功、胱抑素-C、甲狀旁腺素（PTH）及CRP 等檢測。

1.3.2 流式T 細胞檢測過程 取抗凝全血2 管各約100 μL，分別加單克隆四色抗體CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5 以及同型對照抗體mouse IgG1- RD1/IgG1-ECD/IgG1-PC5，室溫避光反應15～20 min，加2 mL 稀釋后的溶血劑，室溫避光反應10 min，300 ×g 離心5 min，棄上清，以2 mL PBS 洗滌2 遍，最后加入0.5 mL PBS 立即上機檢測。采用雙平臺法四色流式細胞術(shù)以CD45 設門后分析總T 細胞（CD3+）、T4 細胞（CD3+CD4+）和T8 細胞（CD3+CD8+）的百分含量，并計算CD4+/CD8+細胞比值。

1.3.3 流式B 及NK 細胞檢測過程 取抗凝全血4 管各約100 μL，分別加單克隆二色抗體CD3-FITC/CD16+56-PE、CD3-FITC/CD19-PE（Beckman Coulter USA）及各自相應的同型對照抗體，室溫避光反應15～20 min，加2 mL 稀釋后的溶血劑，室溫避光反應10 min，300 ×g 離心5 min，棄上清，以2 mL PBS 洗滌2 遍，最后加入0.5 mL PBS 立即上機檢測。分析總B 細胞（CD3-CD19+）、NK 細胞（CD3-CD16+56）比例。采用BD Calibur 流式細胞儀檢測，F(xiàn)low Jo 流式細胞分析軟件分析。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計學軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩間比較采用LSD-t 檢驗。相關(guān)性采用Spearman’s秩相關(guān)分析。P≤0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 所有CKD 患者與對照組血常規(guī)及生化相關(guān)指標比較

與對照組相比，肌酐、尿素氮、胱抑素-C 等反應腎功能的指標均隨著CKD 病程的進展逐漸升高，CKD5 組（NHD、HD、PD）增高最為明顯（P 均＜0.05），CKD5 期中NHD 與HD、PD 者差異均無統(tǒng)計學意義（P 均＞0.05）；與對照組相比，CKD患者血紅蛋白隨著病程進展逐漸下降（P＜0.05），CKD5 組中NHD、HD、PD 間血紅蛋白差異有統(tǒng)計學意義，以NHD 者下降最明顯（P 均＜0.05）；與對照組相比，PTH、CRP 隨著病程進展逐漸上升，CKD5 組（NHD、HD、PD）增高最為明顯（P 均＜0.05），在CKD5 組中NHD、HD、PD 間PTH、CRP差異均有統(tǒng)計學意義，以PD 組上升最明顯（P 均＜0.05）。CKD 患者與對照組的性別、年齡均無統(tǒng)計學意義（P均＞0.05），見表1。

表1 所有CKD 患者與正常對照組臨床資料指標比較（±s）

表1 所有CKD 患者與正常對照組臨床資料指標比較（±s）

與對照組比較*P＜0.05；與CKD3 組比較#P＜0.05；※與CKD4 組P＜0.05；與NHD 組比較＆P＜0.05；與HD 組比較§P＜0.05；與PD 組比較＄P＜0.05。

CKD5 組NHD（n=14）HD（n=18）PD（n=18）年齡/歲48.90±11.4058.90±19.0058.30±13.1054.00±20.1048.3±17.546.6±15.0性別（男/女）/例12/812/1010/98/69/910/8紅細胞/（×1012/L）4.62±0.573.46±0.82*2.81±0.65*#2.55±0.68*#3.30±0.72*&2.89±0.69*#血紅蛋白/（g·L-1） 135.00±15.50104.00±26.00*82.8±18.10*77.50±12.70*#101.00±21.30*※&85.30±20.00*#肌酐/（μmol·L-1）69.60±11.60267.20±112.30*556.6±80.30*#983.40±372.70*#※ 897.30±242.20*#※ 851.60±218.00*#※尿素氮/（mmol·L-1）4.30±0.9314.50±7.01*20.00±5.94*#25.80±9.50*#※26.10±7.64*#※20.70±8.12*#胱抑素-C/（mg·L-1）0.77±0.163.42±1.90*5.31±1.86*#5.84±1.94*#8.22±4.10*#※&$6.06±1.09*#尿酸/（μmol·L-1）276.00±89.40 400.70±136.40*370.70±108.10*412.20±158.40*400.20±83.80*434.20±119.80*PTH/（pg·mL-1）38.00±14.80129.30±131.70*203.80±87.10*274.70±129.20*#397.30±349.50*#※ 319.50±136.90*#※CRP/（mg·L-1）6.80±0.6612.60±0.78*15.70±0.58*18.20±0.46*#19.40±0.57*#15.70±0.61*項目對照組（n=20）CKD3 組（n=22）CKD4 組（n=19）F/χ2 值1.919 3.175 10.905 13.827 19.403 23.481 18.778 14.940 16.482 14.372 P 值0.551 0.787 0.004＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.001＜0.001＜0.001

2.2 不同組間淋巴細胞亞群水平比較

與對照組相比，NHD 患者的CD3+細胞比例降低（P＜0.05），其余病例組與對照組差異均無統(tǒng)計學意義（P 均＞0.05）。與對照組相比，CKD 病例組患者的CD4+淋巴細胞比例均降低（P 均＜0.05），各病例組間差異均無統(tǒng)計學意義（P 均＞0.05）。CKD 各組CD8+淋巴細胞百分比及CD4+/CD8+比值與對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義（P 均＞0.05）。與對照組相比，反應B 淋巴細胞比例的CD19+細胞比例隨著CKD 病程的進展逐漸降低，CKD5組（NHD、HD、PD）降低最為明顯（P 均＜0.05），HD、PD 及NHD 組間差異均無統(tǒng)計學意義（P 均＞0.05）。反應NK 淋巴細胞比例的CD16+56 細胞比例隨著CKD 病程的進展逐漸增高，CKD5 組（NHD、HD、PD）增高最為明顯（P 均＜0.05），HD、PD 及NHD者間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

表2 不同組間T、B、NK 淋巴細胞水平比較（±s）

表2 不同組間T、B、NK 淋巴細胞水平比較（±s）

與對照組比較*P＜0.05；與CKD3 組比較#P＜0.05。

CKD5 組NHD（n=14） HD（n=18）CD3+/%73.20±4.3871.50±6.1470.30±5.81 63.60±8.30* 72.40±5.12 CD4+/%54.10±5.2941.60±4.68* 40.90±4.17* 42.10±6.50* 41.50±8.01*CD8+/%27.20±5.0824.10±9.6224.80±6.1122.60±5.31 24.90±7.12 CD4+/CD8+1.96±0.771.70±0.921.63±0.881.84±0.971.66±0.81 CD19+/%22.20±5.3813.50±4.14* 10.30±4.82* 5.60±5.32*# 6.40±2.15*#CD16+56/%8.50±6.1215.80±5.19* 16.50±3.84* 26.60±3.49*# 23.90±5.06*#項目對照組（n=20）CKD3 組（n=22）CKD4 組（n=19）PD（n=18）69.80±7.04 42.00±7.03*23.10±8.04 1.80±0.61 7.00±4.03*#24.80±6.01*#F/χ2 值1.236 19.778 1.382 0.896 22.473 9.798 P 值0.219＜0.001 0.176 0.412＜0.001 0.002

T 淋巴細胞流式細胞檢測分析流程示意圖：1）畫FSC/SSC 點圖，圈淋巴細胞門CD45；2）畫CD3/CD8 點圖，圈CD3+及CD8 細胞門；3）畫CD3/CD4 點圖，圈CD3+及CD4 細胞門。見圖1。

圖1 T 淋巴細胞流式分析流程示意圖

B 淋巴細胞流式細胞檢測分析流程示意圖：1）畫FSC/SSC 點圖，圈淋巴細胞門；2）畫CD3/CD19 點圖，圈CD3+及CD19 細胞門。見圖2。

圖2 B 淋巴細胞分析流程示意圖

NK 細胞式細胞檢測分析流程示意圖：1）畫FSC/SSC 點圖，圈淋巴細胞門；2）畫CD3/CD16+56 點圖，圈CD3+及CD16+56 細胞門。見圖3。

圖3 NK 細胞分析流程示意圖

2.3 淋巴細胞亞群與CRP 相關(guān)性分析

CD3+、CD3+CD4+、CD3-CD19+細胞比例均與CRP 呈負相關(guān)（r=-0.273、-0.300、-0.323，P 均＜0.05）；CD3-CD16+56 與CRP 呈正相關(guān)（r=0.591，P＜0.01）。

3 討論

本文結(jié)果顯示，CKD 患者不但存在腎功明顯受損，相關(guān)并發(fā)癥如腎性貧血、腎性骨病相關(guān)指標亦存在明顯異常，尤以CKD5 組中的各組變化最為明顯，證實CKD 并非單一系統(tǒng)受損，而是使全身各系統(tǒng)受累的一種臨床綜合征。除了泌尿系統(tǒng)，CKD 患者常常存在全身各個系統(tǒng)的病變及異常，其中以心血管系統(tǒng)異常最為常見，且是致死的主要原因。同時，CKD 患者由于細胞損傷及氧化應激反應，導致患者長期存在微炎癥狀態(tài)，CKD組患者CRP 高于對照組，尤以CKD5 組的變化最為顯著。

本研究結(jié)果顯示，CKD 患者的CD4+T 淋巴細胞較對照組下降，說明T 淋巴細胞可能參與了CKD 疾病的發(fā)生、發(fā)展。Wherry 等[14]研究認為CKD患者長期存在微炎癥狀態(tài)，長時間的炎癥信號改變了T 細胞的功能，從而導致其處于衰竭狀態(tài)。Blank 等[15]亦認為，T 細胞在長期慢性刺激下會損害細胞因子的產(chǎn)生，如果炎癥持續(xù)存在，將最終導致細胞耗竭。Liu 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，尿毒癥患者存在T 細胞異常且CD4+T 淋巴細胞促進慢性腎纖維化的進展。Chung 等[17]研究也證實CKD 患者T細胞相關(guān)的免疫系統(tǒng)發(fā)生明顯改變，但在CKD中免疫紊亂變化規(guī)律及其引起疾病發(fā)展的機制并不明確。本文結(jié)果與有關(guān)研究結(jié)果一致[18-19]。Griveas 等[20]研究認為，CD4+明顯下降可能是尿毒癥毒素，尤其是PTH 對T 細胞功能抑制的作用；Bhasksran 等[21]認為其可能是由Fas/FasL 介導而導致T 細胞凋亡增加引起的；Meier 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，在慢性腎衰竭患者中氧化的低密度脂蛋白通過Fas 機制激活了CD4+T 的凋亡。大量的研究[23-25]也證實T 細胞的凋亡與心血管疾病、慢性炎癥及自身免疫性疾病密切相關(guān)，也是CKD患者死亡風險明顯高于普通人群的主要原因，而通過調(diào)節(jié)免疫細胞來改善CKD 患者的預后可能具有重要的意義。

CKD 患者B 淋巴細胞較對照組下降，且隨著腎衰竭程度的加重，B 淋巴細胞比例逐漸下降，表明B 淋巴細胞在CKD 的發(fā)生、發(fā)展中亦發(fā)揮了重要作用，慢性腎臟損傷造成免疫細胞下降，而下降的免疫功能進一步加劇了腎臟損傷的進展，二者互為因果，惡性循環(huán)。Pahl 等[10]研究認為，B細胞分化不良與白細胞介素17（IL-17）、B 淋巴細胞活化因子（BAFF）及其受體關(guān)系密切；Fernandez-Fresnedo 等[26]研究也證實在尿毒癥中存在B淋巴細胞凋亡及分化不良，認為可能與抗凋亡蛋白Bcl-2 的減少導致凋亡增加有關(guān)，而腎替代治療并不能明顯糾正抗凋亡細胞的減少。同時也有研究[23]認為B 細胞可以調(diào)控T 細胞反應，二者關(guān)系密切，相輔相成，也進一步證實了CKD 患者免疫紊亂對預后的影響。

本研究結(jié)果顯示，NK 細胞活性隨著腎衰竭程度的加重而逐漸升高，而替代治療組未見下降，這與Nishimoto 等[27]的研究結(jié)果一致，可能是尿毒癥患者機體對執(zhí)行特異性免疫功能的淋巴細胞數(shù)量下降的一種代償機制或者是由機體的慢性炎性反應導致。本研究結(jié)果顯示，免疫細胞變化與CRP 呈正相關(guān)，說明免疫系統(tǒng)與炎癥的發(fā)生密切相關(guān)，證明CKD 患者存在明顯的免疫系統(tǒng)紊亂現(xiàn)象，且多以免疫功能低下為主，由于CKD 患者存在免疫功能低下，因此容易引起感染及腫瘤發(fā)病的增加，且隨著疾病進展，免疫紊亂持續(xù)惡化，使相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生概率進一步增加，從而進入惡性循環(huán)，這也是尿毒癥患者中感染及腫瘤高發(fā)的原因，其具體機制還有待進一步評估。

本研究還顯示，血液透析對于糾正患者的免疫系統(tǒng)紊亂作用不明顯，雖然透析治療可以明顯地清除患者體內(nèi)的毒素及一些中小分子物質(zhì)，維持患者電解質(zhì)及酸堿平衡，使部分免疫細胞活性增強，進而延長和提高尿毒癥患者的生存時間及質(zhì)量，但血液透析患者可能存在因透析中失血而加重貧血、血流動力學不穩(wěn)定、鋁中毒以及透析器的生物相容性等多種多樣的問題，并不能使免疫細胞的活性完全恢復，甚至可能加重患者的免疫功能紊亂。腹膜透析雖然在這些方面略優(yōu)于血液透析，但由于其具有易導致蛋白丟失過多、葡萄糖攝入過量以及三酰甘油異常等缺點，故其糾正免疫紊亂的作用也不顯著。從本研究結(jié)果中也可以看出，替代治療僅代替腎臟清除水分及毒素，而腎臟的分泌功能、神經(jīng)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)是無法替代的，機體內(nèi)其他系統(tǒng)的病變亦無法改善，因此并沒有顯著改善患者的免疫紊亂及炎癥狀態(tài)，想要改善患者的異常狀態(tài)需要尋找新的途徑。

綜上所述，CKD 患者明顯存在體液及細胞免疫的紊亂以及炎癥狀態(tài)，從而導致感染、心血管疾病及腫瘤等發(fā)病率增高，因此，改善CKD 患者的免疫功能及炎癥狀態(tài)對患者的治療及預后極其重要。免疫功能狀態(tài)是CKD 患者預后的重要因素之一，而腎臟替代治療對于糾正免疫系統(tǒng)的紊亂作用有限，需要尋找新的路徑來改善患者的免疫失衡及炎癥狀態(tài)，對延長患者生命、降低并發(fā)癥發(fā)生率及提高生活質(zhì)量具有重要意義。