李紅芳，劉 鵬，曹 露，徐一君，陳志強，溫 文

移植血管再狹窄是影響冠脈旁路移植術(shù)遠(yuǎn)期效果的重要原因，其主要病理基礎(chǔ)是血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）發(fā)生表型轉(zhuǎn)化、增殖、遷移［1］，導(dǎo)致血管重塑、狹窄。抵抗素等脂肪因子可誘導(dǎo)VSMC增殖、遷移，但具體機制尚不清楚。腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophos?phate actived protein kinase，AMPK）／哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號在VSMC增殖中發(fā)揮重要作用［2］。本實驗觀察抵抗素誘導(dǎo)VSMCs表型轉(zhuǎn)化作用的可能機制，以及二甲雙胍的防治作用，為防治移植血管再狹窄提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 人血管平滑肌細(xì)胞（human aortic vascu?lar smooth muscle cells，HVSMCs）（ScienCell），高糖細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）（Gibco），胎牛血清（杭州四季青），0.25%胰蛋白酶（北京全式金），鹽酸二甲雙胍（AMPK激活劑）（Sigma），重組人抵抗素（Pepro?Tech），細(xì)胞周期檢測試劑盒（美國BD），UNIQ－10柱式Trizol總RNA提取試劑盒及引物（上海Sangon Biotech），cDNA合成試劑（PrimeScriptRT Master Mix Perfect Real Time）及熒光定量試劑盒（SYBR Premix Ex TaqTMⅡ）（大連Takara），p－AMPKα（Thr485）、mTOR、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）（Cell Signaling Technology），p－mTOR（Abcam），AMPKα1／2、β－肌動蛋白（β－actin）、HRP－linked antibody、Goat anti－rabbit IgG（武漢博士德）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 HVSMCs復(fù)蘇后，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（FBS）、100 IU／ml青霉素及100 μg／ml鏈霉素的高糖DMEM中。于37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2～3 d更換一次培養(yǎng)液，傳至4～5代細(xì)胞進行實驗。生長狀態(tài)良好的細(xì)胞，1.0×105個／孔接種于六孔板，用高糖DMEM培養(yǎng)24 h，用不含F(xiàn)BS的高糖DMEM饑餓24 h，分組進行相應(yīng)藥物處理。

1.3 實驗分組及處理 實驗分4組：對照組（Con）：不加干預(yù)；抵抗素組（Res）：加入含50 μg／L抵抗素培養(yǎng)；二甲雙胍組（Met）：加入含2 mmol／L二甲雙胍培養(yǎng)；抵抗素＋二甲雙胍組（Res＋Met）：二甲雙胍2 mmol／L處理細(xì)胞2 h后，再加入抵抗素50 μg／L培養(yǎng)22 h。分組處理后的細(xì)胞繼續(xù)孵育，各組孵育24 h后進行蛋白質(zhì)免疫印跡（Western blot）檢測p－AMPK、p－mTOR、AMPK、mTOR及Cyclin D1表達；孵育48 h后進行流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞周期，實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）測定α－平滑肌肌動蛋白（α－SMA）及骨橋蛋白（OPN）表達。抵抗素濃度的選擇參考本研究前期研究結(jié)果及相關(guān)文獻［3］。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期 胰蛋白酶消化并收集細(xì)胞，按照細(xì)胞周期檢測試劑盒說明進行相應(yīng)操作，流式細(xì)胞術(shù)檢測。

1.5 實時熒光定量PCR（RT－PCR）檢測相關(guān)基因表達 采用柱式Trizol法提取總RNA，并進行濃度測定，按照試劑盒步驟進行反轉(zhuǎn)錄及RT－PCR反應(yīng)。引物：α－SMA：上游：5＇－GGCTGAAGAATG?GCGTGATT－3′，下游：5′－CTGCCATGTCTTTGCCT?TCA－3′；OPN：上游：5＇－ACTGATTTTCCCACGGAC?CT－3＇，下游：5＇－CTCCTCGCTTTCCATGTGTG－3＇；內(nèi)參：β－actin。反應(yīng)條件：95℃30 s，（95℃5 s，60℃31 s），40個循環(huán)，即得出相應(yīng)CT值。待測樣本目的RNA表達量相對值＝2－△△Ct，△△Ct＝△Ct待測樣品－△Ct β－actin，△Ct＝Ct待測樣品－Ct陰性對照。

1.6 Western blot法檢測相關(guān)信號蛋白表達 收集細(xì)胞并裂解，提取總蛋白質(zhì)，BCA法測得相應(yīng)濃度。每泳道上樣30 μg進行電泳；電泳結(jié)束后，Page－凝膠平衡后恒流半干轉(zhuǎn)膜；BSA液封閉，室溫2 h?？贵w雜交，一抗1∶1 000稀釋，4℃過夜；二抗1∶2 000稀釋，室溫孵育2 h。配制ECL化學(xué)發(fā)光液，熒光成像儀（ProteinSample－HD2）曝光成像。檢測AMPK、p－AMPK、mTOR、p－mTOR和Cyclin D1表達量。

1.7 統(tǒng)計方法 應(yīng)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用單因素方差分析和t檢驗，所有數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 抵抗素對HVSMCs細(xì)胞周期的影響 與Con組相比較，Res組細(xì)胞G0／G1期細(xì)胞減少（P＜0.01），S期細(xì)胞明顯增多（P＜0.01）；二甲雙胍預(yù)處理后，與Res組相比較，細(xì)胞G0／G1期細(xì)胞增多（P＜0.01），S期細(xì)胞明顯減少（P＜0.01）。Con組與Met組相比G0／G1期細(xì)胞所占比例無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Con組與Met組相比S期細(xì)胞所占比例無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。各組細(xì)胞及各期細(xì)胞所占比例見圖1、圖2、圖3。

圖1 經(jīng)相應(yīng)處理后的血管平滑肌細(xì)胞（100×）

圖2 抵抗素對血管平滑肌細(xì)胞周期G0／G1期的影響

2.2 抵抗素誘導(dǎo)HVSMCs表型轉(zhuǎn)化相關(guān)基因的表達 與Con組相比較，Res組α－SMA表達水平降低（P＜0.01），OPN表達水平升高（P＜0.01）；二甲雙胍預(yù)處理后，較Res組α－SMA表達水平升高（P＜0.01），OPN表達水平降低（P＜0.01）。Con組與Met組相比α－SMA基因相對表達量無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。Con組與Met組相比OPN基因相對表達量無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖4、圖5。

圖5 抵抗素對血管平滑肌細(xì)胞骨橋蛋白基因的影響

2.3 抵抗素對HVSMCs表型轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達的影響 細(xì)胞分組處理后通過熒光成像儀系統(tǒng)對各熒光條帶掃描，計算各蛋白相對表達量。與Con組相比較，Res組p－AMPK表達量明顯降低（P＜0.01），p－mTOR表達量明顯升高（P＜0.01），Cyclin D1表達量明顯升高（P＜0.01）；經(jīng)二甲雙胍預(yù)處理后，p－AMPK表達量升高（P＜0.01），p－mTOR表達降低（P＜0.05），Cyclin D1表達量降低（P＜0.05）；Con組與Met組AMPK、mTOR總量相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖6、圖7。

圖7 各組細(xì)胞p－AMPK、p－mTOR、Cyclin D1蛋白表達光度值相對值

3 討 論

冠脈旁路移植術(shù)是治療冠心病的主要方法之一，移植血管再狹窄是影響其遠(yuǎn)期效果的重要原因。在血管內(nèi)皮損傷、局部炎癥反應(yīng)和多種細(xì)胞因子等局部因素，以及高血壓病、糖尿病等全身因素的多重作用下，VSMC發(fā)生表型轉(zhuǎn)化、增殖、遷移，導(dǎo)致移植血管重塑、狹窄［1，4］。血管平滑肌細(xì)胞由分化良好的收縮表型轉(zhuǎn)化為去分化的合成表型，為以上病理過程的啟動環(huán)節(jié)，闡明其具體分子機制，對防治移植血管再狹窄具有重要意義。

抵抗素是脂肪細(xì)胞和巨噬細(xì)胞分泌的富含同型半胱氨酸的肽類分子，具有引起胰島素抵抗、誘發(fā)炎癥反應(yīng)、促使細(xì)胞增殖等多種生物學(xué)活性［5－6］。Hi?royuki等［7］研究發(fā)現(xiàn)，抵抗素可以誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞增殖，促進動脈粥樣硬化形成。近期研究發(fā)現(xiàn)，抵抗素也可以促進高糖誘導(dǎo)的VSMC表型轉(zhuǎn)化及增殖［8］。本實驗通過抵抗素干預(yù)HVSMCs，通過RTPCR法檢測顯示，平滑肌細(xì)胞收縮型標(biāo)志蛋白基因α－SMA明顯減少，分泌型標(biāo)志蛋白基因OPN表達明顯增多，提示抵抗素可以誘導(dǎo)HVSMCs表型轉(zhuǎn)化。

AMPK是調(diào)節(jié)細(xì)胞能量代謝關(guān)鍵激酶，通過感知細(xì)胞能量代謝狀態(tài)，調(diào)節(jié)ATP合成與分解代謝，進而調(diào)節(jié)細(xì)胞生物活動［9］；mTOR可感知細(xì)胞營養(yǎng)、能量代謝等外界刺激，整合細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，并傳至細(xì)胞核內(nèi)誘發(fā)相應(yīng)生物效應(yīng)［10］。實驗研究證實，AMPK／mTOR信號通路在VSMC增殖、遷移及周期變化中發(fā)揮重要作用［11］。Yang等［12］通過大鼠動靜脈瘺模型中發(fā)現(xiàn)，通過激活A(yù)MPK，抑制mTOR而抑制大鼠VSMC表型轉(zhuǎn)化。本實驗中發(fā)現(xiàn)，抵抗素可以誘導(dǎo)HVSMCs表型轉(zhuǎn)化，與AMPK磷酸化表達減少，mTOR磷酸化表達增加有關(guān)。通過二甲雙胍激活A(yù)MPK可以逆轉(zhuǎn)抵抗素誘導(dǎo)的表型轉(zhuǎn)化作用。據(jù)此，我們推測抵抗素可以通過抑制AMPK／mTOR信號通路誘導(dǎo)HVSMCs表型轉(zhuǎn)化，在移植血管重塑中發(fā)揮起始作用。

Cyclin和細(xì)胞周期蛋白激酶（CDKs）組成的復(fù)合體Cyclin／CDKs是調(diào)控細(xì)胞周期的主要信號蛋白分子，其中CDKs保持相對恒定，主要通過Cyclin的周期變化來完成細(xì)胞周期調(diào)控［13］。Cyclin D1結(jié)合并激活CDK4而促進細(xì)胞周期由G1期進入S期，從而引起細(xì)胞增殖，在細(xì)胞周期調(diào)控中起關(guān)鍵作用［14－15］。研究發(fā)現(xiàn)，脂聯(lián)素激動劑AdipoRon可以激活mTOR信號而上調(diào)Cyclin D1表達，抑制血小板生長因子誘導(dǎo)的VSMC增殖［16］。本研究顯示，抵抗素可誘導(dǎo)HVSMCs的G0／G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞明顯增多，通過二甲雙胍預(yù)處理HVSMCs后，G0／G1期細(xì)胞增多，S期細(xì)胞減少。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Cyc?lin D1表達明顯增加，而通過二甲雙胍預(yù)處理細(xì)胞，Cyclin D1表達明顯減少。這提示抵抗素通過抑制AMPK／mTOR信號，上調(diào)Cyclin D1表達，促進細(xì)胞進入S期，進而使VSMC由收縮型向合成型轉(zhuǎn)化。

實驗研究表明，二甲雙胍具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖，改善心肌細(xì)胞肥大，減緩血管內(nèi)膜重塑等多種生物作用［17］。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)二甲雙胍預(yù)處理的HVSMCs明顯改變細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化，可能與抑制AMPK／mTOR信號有關(guān)，但能否在移植血管狹窄防治中起到同樣作用，需要進一步研究證實。

綜上，抵抗素可以誘導(dǎo)HVSMCs表型轉(zhuǎn)化，其機制可能是抑制AMPK，激活mTOR信號，進而上調(diào)細(xì)胞周期蛋白Cyclin D1表達，促進細(xì)胞進入S期，誘導(dǎo)表型轉(zhuǎn)化。二甲雙胍可減輕抵抗素對血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換的作用，有潛在抑制冠脈移植血管平滑肌細(xì)胞增殖、重塑及防治移植血管狹窄的作用。