侯 骉，黃偉民，王曉明，韓志偉，員建平，鄒 龍，王 亮

缺血性心臟病的發(fā)病率和死亡率一直居高不下，嚴重威脅著人類的生命安全［1］。在臨床上，缺血性心臟病的治療策略，無論是支架介入還是冠狀動脈旁路移植，目的都是冠狀動脈再通恢復(fù)心肌供血［2］。因此，很難回避心肌缺血再灌注帶來的負面影響，如心肌細胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥等［3］。為了減輕缺血再灌注所致的心肌損傷，本文在細胞和分子水平，分別觀察了微小核糖核酸（miRNA）過表達對缺氧／復(fù)氧（hypoxia／reoxygenation，H／R）所致的細胞凋亡的影響。根據(jù)文獻報道，miRNA不僅參與了細胞分化、增殖和凋亡的調(diào)節(jié)，還與心血管疾病的發(fā)展密切相關(guān)，如心肌梗死、心肌肥大和心肌細胞凋亡等［4］。本研究利用miRNA家族之一的miR－342－5p，對H9c2細胞進行轉(zhuǎn)染，使之過表達miR－342－5p，并建立H9c2細胞缺氧／復(fù)氧損傷模型，探究miR－342－5p能否減輕H／R所致的細胞凋亡，為心血管疾病的治療提供新思路和新靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 H9c2細胞（富衡生物科技有限公司，上海）；胎牛血清（FBS）、高糖細胞培養(yǎng)基（DMEM）、胰酶（gibco公司，美國）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實時熒光聚合酶鏈式反應(yīng)（RT－qPCR）試劑盒、miRNA－342－5p模擬物（mimics）、陰性轉(zhuǎn)染質(zhì)粒（miR－NC mimics）（吉瑪基因有限公司，蘇州）；lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑（Sigma公司，美國）；CCK－8細胞增殖毒性檢測試劑盒、1%青霉素／鏈霉素、辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗（索萊寶科技有限公司，北京）；B淋巴細胞瘤－2基因相關(guān)X（Bax）蛋白、B淋巴細胞瘤－2基因（Bcl－2）、半胱氨酸蛋白酶－3（caspase－3）和3－磷酸甘油醛脫氫酶（Glyceraldehyde－3－phosphate dehy?drogenase，GAPDH）抗體（abcam公司，英國）。

1.2 研究對象 將H9c2細胞復(fù)蘇后接種于高糖DMEM完全培養(yǎng)基（含有10%胎牛血清、1%青霉素／鏈霉素）中，培養(yǎng)于恒溫恒濕孵箱中。適時更換新鮮培養(yǎng)基及傳代。

1.3 實驗分組和miRNA－342－5p轉(zhuǎn)染 根據(jù)不同的處理方法將細胞分為四組：空白對照（Sham）組；H／R處理（H／R組）；轉(zhuǎn)染miR－342－5p mimics后H／R處理（miR－342－5p）組；轉(zhuǎn)染mimics control后H／R（miR－NC）組，該組為miR－342－5p的陰性對照組。待細胞融合度為70%～80%時用胰酶進行消化處理，隨后接種于6孔培養(yǎng)板（2×105個細胞／孔）。嚴格按照lipofectamine3000操作說明書，分別將miRNA－342－5p mimics或miR－NC mimics轉(zhuǎn)染至H9c2細胞中，待轉(zhuǎn)染成功后，各組細胞同時給予H／R處理（Sham組除外），缺氧培養(yǎng)（1%O2＋5%CO2＋94%N2）24 h后，更換新鮮完全培養(yǎng)基，再放入常規(guī)孵箱（95%空氣＋5%CO2）復(fù)氧2 h。

1.4 miRNA－342－5p表達水平檢測 通過RTqPCR法檢測H9c2細胞中miRNA－342－5p的表達水平，用Trizol試劑從細胞中分離總RNA，使用分光光度計（NanoDrop2000）檢測總RNA的濃度及純度。嚴格按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，將miRNA合成為cDNA，并以cDNA作為模板，用實時定量聚合酶鏈反應(yīng) 儀 進 行 擴 增 反 應(yīng)。以U6（上 游5’－3GTGCTCGCTTCGGCACATATAC和下游5－3AAAAATATGGAACGCTCACGAATTTG）為 內(nèi) 參，用2－△△ct法計算miR－342－5p（上游5’－3CGGAG GGGT?GCTATCTG和下游5－3CAGATAG CACCCCTCCG）的相對表達水平。

1.5 細胞增殖試驗 通過細胞計數(shù)試劑（CCK－8）評估H9c2細胞活力。轉(zhuǎn)染成功后，取各組對數(shù)期生長的H9c2將各組細胞接種于96孔板（2×103個細胞／孔）中，在正常環(huán)境中繼續(xù)培養(yǎng)24 h和72 h，在不同時間點內(nèi)加入10 μl CCK－8溶液，在37℃的正常培養(yǎng)箱中再培養(yǎng)2 h。通過酶標儀（Bio－Rad，Cal，USA）測定波長450 nm的光密度（optical density，OD）值，以此對細胞進行增殖測定和生長曲線繪圖。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡 收集各組生長至對數(shù)期的H9c2細胞，制成105／ml的細胞懸液，經(jīng)磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次后，離心取下層沉淀，再用結(jié)合緩沖液重懸細胞，加入5 μl膜聯(lián)蛋白V－異硫氰酸熒光素和10 μl碘化丙啶，避光輕輕振蕩混勻，室溫放置15 min。15 min后用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況并計算凋亡率。

1.7 蛋白印跡法檢測凋亡相關(guān)蛋白 將各組細胞收集并用細胞裂解液提取蛋白后，吹勻取20 μl用蛋白濃度測定試劑盒測定樣品內(nèi)蛋白含量，測定后向每組樣品加入PBS配平，按4∶1的比例加入5×加樣緩沖液后，100℃水浴5 min。取不同組別樣品20 μg，采用4%～15%濃度的變性蛋白預(yù)制膠（Bio－Rad垂直板式電泳儀）90 min進行分離，然后采用半干轉(zhuǎn)方式轉(zhuǎn)膜70 min。5%BSA封閉液37℃封閉2 h，加入一抗，Caepase－3和Bcl－2為1∶1 000，Bax為1∶2 000，4℃孵育過夜，Western洗滌緩沖液（TBS－T）洗滌3次，每次15 min，偶聯(lián)辣根過氧化物酶羊抗兔IgG（1∶5 000）室溫孵育2 h，TBS－T洗滌3次，每次15 min，顯影。內(nèi)參選用GAPDH。通過BioRad成像系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)條帶，隨后使用Image J軟件定量分析。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 采用Graphpad Prism 8.0統(tǒng)計軟件，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）呈現(xiàn)，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用方差分析（SNK－q檢驗），P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 經(jīng)轉(zhuǎn)染后H9c2細胞miR－342－5p的表達水平 激光共聚焦結(jié)果顯示H9c2細胞經(jīng)miR－342－5p和miR－NC轉(zhuǎn)染后，miR－342－5p組的熒光強度與miR－NC組無明顯差異，見圖1A。結(jié)果顯示，H9c2細胞經(jīng)miRNA－342－5p轉(zhuǎn)染后，miR－342－5p組的相對表達量（3.67±0.69）最高，顯著高于miR－NC組（1.02±0.11）和Sham組（1.02±0.13），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明miR－342－5p轉(zhuǎn)染成功。見圖1B。

圖1 H9c2細胞miR－342－5p的轉(zhuǎn)染和表達水平

2.2 細胞增殖實驗結(jié)果 通過CCK－8實驗發(fā)現(xiàn)，在24～72 h的時間范圍內(nèi)，隨著時間的推移，三組H9c2細胞逐漸增殖，并且增殖趨勢一致。但在24 h、48 h、72 h三個時間點，Sham組的細胞增殖率略高于其他兩組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.0316）。在被轉(zhuǎn)染的兩組，三個時間點的細胞增殖率保持一致，未出現(xiàn)組間差異。見圖2。

圖2 各組H9c2細胞相對增殖率

2.3 miR－342－5p減輕H／R誘發(fā)的細胞凋亡 流式細胞儀檢測結(jié)果右上象限為凋亡細胞所占比率，見圖3A。經(jīng)H／R處理后，與sham組相比H／R組的凋亡率［（12.4±1.02）%］顯著升高，但經(jīng)miRNA－342－5p轉(zhuǎn)染后的細胞，即miR－342－5p組，凋亡率［（7±1.03）%］又顯著下降，說明miR－342－5p可以部分消除H／R誘發(fā)的細胞凋亡，量化后的4組結(jié)果詳見圖3B。

圖3 miR－342－5p對缺氧／復(fù)氧誘導(dǎo)細胞凋亡的影響

2.4 miR－342－5p對H／R誘發(fā)凋亡蛋白的影響 利用Western blot免疫印跡方法，檢測了三種凋亡蛋白：Bcl－2、Bax和Caspase－3。結(jié)果miR－342－5p組中的Bcl－2的蛋白表達水平顯著高于miR－NC組與H／R組，而Bax與Caspase－3的蛋白表達水平顯著低于miR－NC和H／R組，miR－342－5p部分抑制H／R誘發(fā)的細胞凋亡。見圖4。

圖4 缺氧／復(fù)氧后H9c2細胞相關(guān)凋亡蛋白的變化

3 討 論

目前全球心臟病患者的首位死亡原因為缺血性心臟病，給社會經(jīng)濟造成了重大負擔(dān)，雖然醫(yī)療技術(shù)飛速發(fā)展，但其治療方法目前仍以血運重建為主［5］。缺血意味著心肌細胞缺氧，心肌再灌注就類似于心肌細胞缺氧后復(fù)氧，導(dǎo)致心肌細胞受損凋亡，近年來，尋找能有效抑制心肌細胞再灌注損傷后的細胞凋亡一直是國內(nèi)外基礎(chǔ)與臨床研究的熱點。

以往多項研究表明，細胞凋亡是受到多種凋亡相關(guān)基因調(diào)控的，其中包括Bcl－2、Bax和Caspase－3等［6］。而miRNA作為真核生物中廣泛存在的一種RNA，在細胞生長發(fā)育過程中扮演著不可替代的角色，如調(diào)節(jié)細胞的凋亡、分化、自我更新等［7］。miR－342－5p作為眾多miRNA家族中的一員，具有抗凋亡和抗氧化等多種生物學(xué)特性。Sun等研究發(fā)現(xiàn)，miR－342－5p可通過調(diào)節(jié)細胞外因子通路，抑制氧化應(yīng)激水平從而調(diào)節(jié)動脈斑塊的穩(wěn)定性，以發(fā)揮保護血管的作用［8］。Bi等發(fā)現(xiàn)，其可靶向磷脂酰肌醇3－激酶Ⅰ型受體來激活蛋白激酶通路，起到促進血管內(nèi)皮平滑肌細胞的增殖和分化，來保護血管內(nèi)皮的完整性和光滑性［9］。也有報道指出，長期的運動會增加體內(nèi)miR－342－5p表達水平的增高，繼而減少心肌缺血再灌注損傷［10］。H9c2細胞被廣泛用于心肌缺血再灌注損傷的相關(guān)研究［11］，因此本研究擬采用H9c2細胞探究miR－342－5p的保護作用和相關(guān)機制。

細胞凋亡是心肌缺血再灌注損傷的主要因素［5］。Bcl－2和Bax作為凋亡家族中的主要調(diào)節(jié)因子，但在細胞凋亡途徑中卻有相反作用，Bcl－2抗細胞凋亡而Bax促細胞凋亡［12］。為了驗證miR－342－5p是否影響H9c2的增值效率及抗凋亡作用，筆者通過CCK－8實驗和流式細胞術(shù)發(fā)現(xiàn)，miR－342－5p并不會影響細胞增殖效率，同時也能夠有效減少因H／R誘導(dǎo)的凋亡。在細胞相關(guān)凋亡蛋白表達方面，筆者通過Western blot實驗發(fā)現(xiàn)，miR－342－5p可以顯著增強H9c2細胞經(jīng)H／R誘導(dǎo)后Bcl－2的表達量，降低Bax的表達，同時也能有效抑制Caspase－3的表達。

總之，本研究分別從細胞水平和分子水平證實了miRNA家族之一的miR－342－5p，能夠有效改善H／R帶來的細胞損傷，其保護機制是通過調(diào)控Bcl－2／Bax的表達，抑制H／R引起的細胞凋亡。希望這一研究發(fā)現(xiàn)能為臨床上治療缺血性心臟病提供新靶點和新思路。