任雅寧，崔玉寶

1967年，Voorhorst等[1]提出塵螨是屋塵過敏原的主要來源，并且認(rèn)為其在哮喘發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要的作用，當(dāng)塵螨在屋塵中生長時，過敏原的水平會增加。皮膚試驗證明80%以上的塵螨過敏性哮喘患兒，與塵螨主要過敏原Der p 1(屋塵螨過敏原第1組分)和Der p 2(屋塵螨過敏原第2組分)密切相關(guān)[2]。根據(jù)流行病學(xué)研究結(jié)果，在床墊和地毯沉積的每克灰塵中含有2 μg的Der p 1，就被視為過敏和出現(xiàn)哮喘的風(fēng)險因素；當(dāng)每克灰塵中含有10 μg的Der p 1(即每克灰塵中含有500只螨蟲)被視為過敏體質(zhì)者發(fā)生急性哮喘的一個重要風(fēng)險因素[3]，塵螨的數(shù)量或塵螨過敏原的濃度降低100倍以上，哮喘的癥狀就能得到改善。因此室內(nèi)塵螨過敏原濃度是超敏反應(yīng)性疾病和哮喘的風(fēng)險性因素。屋塵樣本在評估過敏原暴露、減少暴露水平、室內(nèi)過敏原調(diào)查和過敏性疾病的臨床研究中具有重要意義。本文對屋塵樣本的采集和塵螨過敏原的檢測進行系統(tǒng)綜述，為制定室內(nèi)塵螨控制措施提供參考依據(jù)。

1 屋塵樣本中塵螨過敏原檢測流程

對家庭塵樣中特定過敏原的量化、分析涉及以下幾個步驟：明確采樣地點、屋塵采集、過敏原提取、選用合適過敏原測定方法和結(jié)果報告(圖1)。首先要明確塵樣采集的位置，而在這之前，需要對居住者的病史有所了解，可以通過問卷調(diào)查、錄像、日記和訪談等。然后對環(huán)境進行采樣，得到屋塵后從中提取塵螨過敏原。而后對過敏原進行檢測。實驗室過敏原分析完成后，結(jié)果可以用幾種不同的方式表達，例如，每克灰塵的塵螨過敏原濃度(μg/g)，每平方米過敏原的數(shù)量(mg/m2)，以及每個采樣區(qū)域的過敏原總數(shù)量(mg)[4]，大多數(shù)研究報告形式為μg/g。

圖1 屋塵樣本中塵螨過敏原檢測流程Fig 1 Flowchart of dust mite allergens detection in house dust

2 屋塵樣本采集

2.1 采樣器

2.1.1 沉淀樣本采集：每克屋塵樣本中塵螨過敏原第1組分(group I allergen)的含量，被認(rèn)為是最佳的“暴露指數(shù)”(index of exposure)表示方法[5]。屋塵樣本采集的技術(shù)是在1970年以前建立起來的，并且大多數(shù)是擦拭取樣技術(shù)(Wipe Sampling Methods)。McArthur[6]介紹采用擦拭取樣評估表面污染，但其可靠性是有限的并且風(fēng)險較高。真空吸塵器通常用于收集塵樣中的過敏原，是最快捷、最簡單和最實用的取樣方法。

真空吸塵器采樣方式主要包括濾袋式、旋風(fēng)式和濕式[7]。三種方式的吸塵器均能達到同樣的除塵效率，其中旋風(fēng)除塵器和濕除塵器的集塵效率受到流速的影響較大，并不能斷定哪種方法更優(yōu)于其他方法。在使用吸塵器的過程中，其電機會釋放出微小的顆粒，這些顆粒是由于與電機的旋轉(zhuǎn)換向器保持電接觸的碳刷磨損而產(chǎn)生的，從而增加了氣傳過敏原的含量。為解決這一問題，吸塵器廠家提供了濾袋。濾袋的層數(shù)對于塵樣的收集效率也是有影響的，將其不同層數(shù)的濾袋放在相同吸塵器中進行比較，三層濾袋的收集效果最好，二層濾袋突出了制造商之間的差異，單層濾袋的表現(xiàn)是較差的[8]。吸塵器最初設(shè)計是用來收集大的灰塵顆粒，然后卻忽視了細顆粒物，通常細顆?？梢缘竭_肺深處并且傷害性極大，但已有一些廠家生產(chǎn)出了帶有高效過濾器(high efficiency particulate air，HEPA)的真空吸塵器來收集存在于地毯和地板上的較細顆粒物質(zhì)，Lioy等[9]測試了11臺標(biāo)準(zhǔn)真空吸塵器的細顆粒收集效率和其電機對細顆粒的排放速率，其中包括普通真空吸塵器和含有HEPA的真空吸塵器，結(jié)果顯示含有HEPA的真空吸塵器可以捕獲大于99%的細顆粒。并且提出如果一個真空吸塵器中含有濾袋以及HEPA，其效果是最好的。

盡管接觸過敏原最常見的途徑是吸入，但一些攜帶過敏原的顆粒，尤其是塵螨，會迅速從空氣中沉淀下來，因此方便且易于使用的真空采樣器已經(jīng)被用于許多過敏原研究。大多數(shù)方法是通過過濾將灰塵收集到真空吸塵器或泵的容器中，丹麥ALK(Allergologisk Laboratorium K?benhavn) “公司”生產(chǎn)的吸塵器，易于使用。該設(shè)備由噴嘴組成，噴嘴連接到真空吸塵器軟管上，灰塵被收集到塑料盤的濾紙上。1991年Roberts等[10]開發(fā)了高體積小表面取樣器(high volume small surface sampler，HVS3)用于收集含粉塵的農(nóng)藥殘留，并且是一種專門用于收集室內(nèi)灰塵的真空取樣器。HVS3被認(rèn)為目前室內(nèi)屋塵取樣的“金標(biāo)準(zhǔn)”，它使用各種旋風(fēng)收集器收集大于5 μm的粒子和一個最終HEPA過濾器收集更小的粒子，其重量輕，收集效率高，并且可以快速清理和檢測殘留農(nóng)藥，鉛等，但HVS使用成本高，用于較小規(guī)模的研究中[11]。在塵螨和蟑螂暴露水平的研究中，通常采用強力螨(Eureka “Mighty Mite”，EURK)，檢測時將19毫米× 90毫米的纖維素提取套管放入真空延長管的遠端，并用橡膠o形圈密封[12]。ReadiVac為手持吸塵器，由Douglas-Quickut(Walnut Ridge，Arkansa)所研發(fā)，提供2.1A真空清洗電機的吸力，將空氣通過噴嘴面積約為16.7平方厘米的區(qū)域，顆粒由覆蓋在該采樣器的風(fēng)扇外殼和塑料噴嘴內(nèi)部的過濾器所收集[13]。

2.1.2 其他樣本采集：1992年，Tovey等[14]采用皮氏培養(yǎng)皿來收集空氣中沉降粉塵中家庭塵螨過敏原，其最大的特點是可以應(yīng)用于大規(guī)模的研究中，易于使用且價格便宜。但收集塵樣的面積相對較小，采樣時間較長。Noss等[15]研制出靜電塵落器(electrostatic dust fall collector，EDC)，其由一個定制的聚丙烯取樣器組成，具有4塊靜電布，每塊面積為0.032平方米，有采樣面積增大和采樣時間縮短的特點?？諝庵械幕覊m落到EDC表面，即可被布的靜電特性捕獲。但為了獲得真實的個人暴露水平，新型個人吸氣式粉塵采樣器(institute of occupational medicine，IOM)[16]的設(shè)計就是對工作場所中所接觸到的氣溶膠進行采樣，真正反應(yīng)每個佩戴者真實的屋塵暴露情況。為了方便于患者，2003年Custis等[17]設(shè)計出離子充電裝置，可插在家中的插座上，其是通過創(chuàng)造一個正電場來捕獲粒子，粒子通過電場而黏附于極板上，隨后將電極板上的粒子直接進行洗脫并檢測，最終獲得空氣中過敏原的水平。2016年Tovey等[18]研制出24小時監(jiān)測個人接觸塵螨過敏原生物氣溶膠的微型攝影取樣器，其對塵螨過敏原的研究開辟了新領(lǐng)域。此外，暖氣、通風(fēng)和空調(diào)(heating，ventilation，and air conditioning，HVAC)過濾器有望成為高容量且長期的采樣器，其特點在于收集的灰塵標(biāo)本可用于分析塵樣中的微生物群[19]。

雖然采樣方法很多，但仍然缺乏一種標(biāo)準(zhǔn)化方法，在選擇采樣方式時，需要考慮多種因素，其中主要包括精確度、準(zhǔn)確度，以及收集的過敏原數(shù)量是否與致敏性相關(guān)等，其次還需要考慮檢測成本、技術(shù)人員和受試者的負(fù)擔(dān)，儀器的便攜性和可操作性等。Grant等[20]對不同類型采樣器的優(yōu)缺點進行評價，表明每種檢測儀器或方法都有其局限性和不足，因此可以根據(jù)自己的研究目的來選擇不同的方法，以便進行后續(xù)研究(表1)。

表1 常見采樣器舉例及其特點Table 1 Common dust sample collecters and their characteristics

2.2 塵樣中過敏原提取和塵螨分離

為了獲得待測過敏原，我們需要從塵樣中提取過敏原。有試驗比較4種不同的緩沖液(包括添加或不添加0.05% Tween 20的硼酸鹽緩沖液(BBS)和添加或不添加0.05% Tween 20的磷酸鹽緩沖液(PBS))對樣本分別進行提取并且計算其對應(yīng)的所提取過敏原濃度，結(jié)果顯示推薦使用0.05% Tween 20的PBS[21]。從塵樣中分離活螨和死螨，目前最常用的方法是漂浮和懸浮[22]。

2.3 取樣器評估

對不同采樣器進行比較時通常從塵樣收集重量即收集效率(collection efficiency，CE)、氣傳過敏原含量、從塵樣中獲取過敏原濃度(concentration ratio，CR)這三方面進行比較。CE通常用于評估采樣器性能，CE隨采樣器和粒度分?jǐn)?shù)的不同而變化很大。氣傳過敏原含量則反應(yīng)了采集器出現(xiàn)過敏原滲漏現(xiàn)象。除此之外，還應(yīng)考慮采樣器重量、堅固性、操作方便性和過濾原件的數(shù)量等參數(shù)。

3 影響塵樣收集因素

3.1 濕度和溫度

塵螨的生存依靠于溫度，環(huán)境相對濕度(relative humidity，RH)。Arlian等[23]已證明濕度是調(diào)節(jié)塵螨取食和水分平衡的重要因素。對于螨蟲來說，唯一的水源是從周圍空氣的水蒸氣中所獲得的。平均日相對濕度維持在50%以下可以有效抑制螨類種群的生長[24]。當(dāng)暴露于-18℃、48小時以上時，大多數(shù)的塵螨無法存活[25]。在不同的季節(jié)中，溫度和濕度是不同且變化的，因此塵螨種群密度的消長與氣候條件變化有關(guān)。Der p 1濃度從秋季中旬到冬季是最高的，在夏季中旬是最低點。螨蟲流行率與室內(nèi)的季節(jié)性波動是有關(guān)系的，在夏季末，隨著濕度和溫度的增加，塵螨種群會增加，使得變應(yīng)原濃度達到高峰[26]。

3.2 采樣地點

采樣地點十分重要，即對室內(nèi)哪些物體表面進行吸塵，從而獲得足夠數(shù)量的樣本，反映出可能的最高暴露水平。室內(nèi)地毯、床墊、沙發(fā)和窗簾上的灰塵中發(fā)現(xiàn)了高水平的過敏原。因此，檢測室內(nèi)裝飾、床墊、地板表面積塵是評估過敏原暴露最常用的地點[27]。通常，基于單個家庭采樣的單一或者少數(shù)的灰塵樣本的流行病學(xué)研究不能恰當(dāng)?shù)乇硎炯彝m螨呈陰性，這時就需要對多個地點進行采樣。

4 室內(nèi)塵螨過敏原檢測方法

室內(nèi)塵螨過敏原的檢測方法在不斷的發(fā)展(圖2)，Voohorst等(1967)[1]在顯微鏡下發(fā)現(xiàn)了屋塵螨，鏡檢可以觀察塵螨形態(tài)并對其進行計數(shù)(包括死螨和活螨)和分類[28]。但鑒定螨種需要很強的專業(yè)性，并且需要時間較長，無法適用于大量樣品。隨后Tovey等[29]利用放射過敏原吸附試驗(radioallergosorbent，RAST)和放射免疫法(radioimmunoassay，RIA) 對屋塵中的過敏原進行檢測。后來發(fā)現(xiàn)許多地方同時存在Der p 1和Der f 1，而同時又證明兩者間具有共同的抗原表位，所以通過免疫滲濾(immunodiffusion)發(fā)現(xiàn)主要針對Der p 1和Der f 1上存在的共同抗原決定因素(稱為Ag P1 Eq)，采用雙位點RIA進行檢測，根據(jù)每克粉塵中的Ag P1 Eq來評價螨過敏原的含量水平[30]，該方法表明Ag P1 Eq可以準(zhǔn)確地反應(yīng)屋塵或塵螨提取物中存在的塵螨過敏原的含量。1985年10月1日起ACAREX試驗(ACAREX-Test)開始進行商業(yè)銷售[31]。其原理是將鳥嘌呤固定在一種帶有紅色的偶氮染料上來測量鳥嘌呤的含量，通過觀察顏色來對其進行分析。鳥嘌呤是蛛形綱動物的主要分泌物，是塵螨糞便和Der p 1過敏原濃度的標(biāo)志物，灰塵中的鳥嘌呤濃度與塵螨Der p 1過敏原濃度及塵螨種群密度之間具有明顯的統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性。ELISA是目前塵螨過敏原濃度定量測定最廣泛的方法[32]，一般使用商用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(indoor Biotechnologies，Clwyd，UK)，其中雙位點單克隆抗體(Mab)ELISA可同時檢測主要吸入性過敏原Der p 1和Der f 1，采用了一種非同位素免疫分析法使單克隆抗體在Der p 1和Der f 1上識別一個共同的表位[33]。點印跡法(dot blot)可以半定量的估計過敏原含量，快速簡單，巧妙地利用的塵螨引起過敏反應(yīng)的臨界值：床墊和地毯中沉積的每克灰塵中含有2 μg的Der p 1，就被視為過敏和出現(xiàn)哮喘的風(fēng)險因素[34]。在大型流行病學(xué)研究或以人群為基礎(chǔ)的環(huán)境調(diào)查中，由于樣本量較大，2007年Earle等[35]采用熒光多重陣列實現(xiàn)了同時檢測室內(nèi)6 種包括屋塵螨、粉塵螨、貓過敏原和犬過敏原(Der p 1：The group 1 allergen fromDermatophagoidespteonyssinus、Der f 1：The group 1 allergen fromDermatophagoidesfarinae、Der p 2：The group 2 allergen fromDermatophagoidespteronyssinus、Der f 2：The group 2 allergen fromDermatophagoidesfarinae、Fel d 1：The group 1 allergen fromFelisdomesticus和Can f 1：The group 1 allergen fromCanisfamiliaris)過敏原水平，方法是采用純化的天然過敏原組成的通用標(biāo)準(zhǔn)，利用單抗與熒光微球共價偶聯(lián)(luminex xMAP system)，建立了6種過敏原的多重陣列。2013年Roussel等[36]利用實時定量PCR(Real-time quantitative PCR)檢測環(huán)境中的塵螨過敏原含量，利用引物及探針分析塵螨過敏原的核酸含量，實現(xiàn)定量檢測。2017年Spiric等[37]提出多反應(yīng)檢測(MRM)質(zhì)譜法不僅可以實現(xiàn)對過敏原的定量檢測而且可以測定塵螨過敏原的物種及序列特異性，并且靈敏度較高。每種檢測方法都有其特點(表2)，應(yīng)選擇適當(dāng)方法做出準(zhǔn)確檢測。就目前而言，用于實驗室的過敏原檢測方法在不斷的發(fā)展，而方便于普通大眾用于家庭過敏原的檢測方法還是缺少。因此期待這些檢測可以對過敏患者的家庭灰塵過敏原管理提供有用的幫助。

圖2 建立塵螨過敏原檢測方法的時間軸Fig 2 Development of dust mite allergen detection method

表2 屋塵樣本中塵螨過敏原常見檢測方法Table 2 Common detection methods of dust mite allergens in house dust

5 問題與展望

隨著技術(shù)的進步，人們對屋塵采集和過敏原檢測技術(shù)在不斷提高，但仍然存在一些問題。其一，缺乏便于患者的家庭檢測方法，使患者對家庭暴露水平了解較少。同時在檢測方面，要加強定量檢測，從而對患者達到更精準(zhǔn)的治療。其二，缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的塵樣采集方法，不同的采樣器都有其優(yōu)缺點也很難進行比較。其三，以家庭為基礎(chǔ)的干預(yù)是有效的，但仍然缺乏對其知識的教育，為此不應(yīng)該僅僅聚焦于患者，更要放眼于普通群眾，增加教育，如通過科普書籍、網(wǎng)絡(luò)、自媒體等手段增加塵螨基礎(chǔ)知識及其危害的宣傳教育。