蘇保壽，薛治乾，余鵬飛，吳益敏，喻聞慶

膠質(zhì)瘤是原發(fā)性腦腫瘤，起源于神經(jīng)膠質(zhì)干細胞或祖細胞，其基因多態(tài)性與病人預(yù)后及生存時間有關(guān)，雖然手術(shù)、放療和烷基化劑化療是治療的主要手段，但個體化治療策略可改善預(yù)后和延長生存時間[1-2]。研究膠質(zhì)瘤細胞增殖和凋亡的分子機制，可為膠質(zhì)瘤病人提供個體化策略并改善預(yù)后。

有研究[3]用芯片篩選膠質(zhì)瘤組織中差異表達的miRNA，并將膠質(zhì)瘤組織和非腫瘤腦組織進行聚類分析發(fā)現(xiàn)miR-18b在膠質(zhì)瘤中上調(diào)表達；另一研究[4]通過實時熒光定量PCR進一步驗證了miR-18b在膠質(zhì)瘤中高表達；但miR-18b-5p對膠質(zhì)瘤細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響目前還不清楚。包含WW域的氧化還原酶基因(WWOX)在膠質(zhì)瘤組中的表達明顯低于正常對照組，WWOX基因缺失或低表達在膠質(zhì)瘤發(fā)生過程中起重要作用[5]，且上調(diào)WWOX的表達可促進膠質(zhì)瘤的免疫反應(yīng)[6]。WWOX和miR-18b-5p在膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中都具有重要作用，而兩者是否存在某種調(diào)控關(guān)系尚不明確。本研究探討了miR-18b-5p對膠質(zhì)瘤U251細胞增殖、凋亡的影響，并探討WWOX在此機制中的作用。現(xiàn)作報道。

1 材料與方法

1.1 材料 選取2014年6月至2017年6月于本院病理檢查確診為膠質(zhì)瘤的病人手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤組織及癌旁組織(距離膠質(zhì)瘤組織邊緣>2 cm)各56例，男30例，女26例，年齡18～66(41.02±14.6)歲，膠質(zhì)瘤分級：Ⅰ級5例、Ⅱ級12例、Ⅲ級19例、Ⅳ級20例。所有病人術(shù)前未接受放療和化療。本研究通過醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，并與所有病人簽訂知情同意書。

1.2 試劑與儀器 人膠質(zhì)瘤細胞株U251購自美國ATCC；DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司，牛血清白蛋白(BSA)、胰蛋白酶Trypsin、四氮唑藍(MTT)和二甲基亞砜(DMSO)購自美國Sigma-Aldrich公司；Trizol試劑、real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購自美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告系統(tǒng)購自美國Promega公司；引物、WWOX干擾物(si-WWOX)、miR-18b-5p mimics(miR-18b-5p)、miR-18b-5p抑制劑(anti-miR-18b-5p)、陰性對照(miR-NC、anti-miR-NC和si-NC)、雙熒光素酶報告系統(tǒng)WWOX突變型和野生型載體購自上海吉瑪制藥有限公司；WWOX抗體、Cyclin D1抗體、p21抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體和GAPDH抗體購自英國Abcam公司；流式細胞儀和流式試劑盒(購自美國BD公司)；顯微鏡、全自動酶標儀及Real-time PCR儀(購自美國Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) 將膠質(zhì)瘤U251細胞培養(yǎng)于含10% FBS、1%青-鏈霉素、谷氨酰胺和丙酮酸鈉的DMEM高糖培養(yǎng)液中，置于濕度95%、37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞鋪滿瓶底時，消化傳代，進行后續(xù)實驗。

1.3.2 細胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的U251細胞以2×105個細胞/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)細胞至融合度達到80%～90%時進行轉(zhuǎn)染。無血清OptiMEM培養(yǎng)液稀釋脂質(zhì)體和各載體或片段，包括anti-miR-NC、anti-miR-18b-5p、miR-NC、miR-18b-5p、si-NC、si-WWOX、pcDNA3.1、pcDNA3.1-WWOX、anti-miR-18b-5p+si-NC、anti-miR-18b-5p+si-WWOX、WT-WWOX+miR-NC、WT-WWOX+miR-18b-5p、MUT-WWOX+miR-NC和MUT-WWOX+miR-18b-5p的載體，將等體積脂質(zhì)體與各組載體輕柔混勻，室溫孵育20 min，加入培養(yǎng)好的細胞中，混勻后常規(guī)培養(yǎng)6 h，棄上清液，換成DMEM完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h，收集細胞，通過Real-timePCR驗證轉(zhuǎn)染效果。

1.3.3 Real-timePCR檢測RNA的表達 收集各組轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h的U251細胞、膠質(zhì)瘤組織和癌旁組織，用Trizol試劑提取細胞總RNA，保存于-80 ℃。然后取總RNA按照反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒說明書合成cDNA，同樣-80 ℃保存。按照 real-timePCR的說明書取cDNA進行反應(yīng)合成miR-18b-5p，反應(yīng)程序為：94 ℃ 1 min；94 ℃ 40 s、59 ℃ 30 s、72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。根據(jù)2-ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)分析。

1.3.4 MTT實驗測定細胞增殖 收集轉(zhuǎn)染后48 h的U251細胞，消化細胞并用培養(yǎng)液稀釋細胞，以2×103個細胞/孔接種于96微孔板中，分別在培養(yǎng)至24、48、72 h時進行 MTT 實驗，每孔加入 20 μL MTT(5 mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，室溫振蕩5 min溶解結(jié)晶，酶標儀測定490 nm吸光度值。

1.3.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 將轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至對數(shù)生長期的各組U251細胞，接種于96孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細胞，洗滌2次，根據(jù)流式試劑盒說明書操作，加入100 μL Binding buffer重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC和 10 μL碘化丙啶，室溫避光15 min，再加入400 μL Binding buffer，上流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.3.6 Western blotting檢測蛋白表達 收集轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)至對數(shù)生長期的U251細胞，加入細胞裂解液，室溫裂解細胞20 min，超聲破碎細胞，收集蛋白并檢測蛋白濃度，將蛋白樣本進行SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)PVDF膜，室溫封閉1 h，然后將膜加入稀釋的一抗中(WWOX抗體1∶2 000、Cyclin D1抗體1∶5 000、p21抗體1∶4 000、Bax抗體1∶3 000、Bcl-2抗體1∶1 000和GAPDH抗體1∶3 000)，4 ℃過夜，用緩沖液洗膜2次，加入稀釋后的酶標二抗，室溫孵育2 h，洗膜，顯影。分析蛋白表達量。

1.3.7 雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗 U251細胞培養(yǎng)，當細胞融合度達到80%時，進行轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建的WWOX的野生型(WT-WWOX)和突變型(MUT-WWOX)雙熒光素酶報告載體分別共轉(zhuǎn)染miR-NC或miR-18b-5p，培養(yǎng)72 h，收集細胞，裂解細胞，離心收集裂解后的上清液，加入熒光素酶底物，發(fā)光儀檢測熒光素酶活性。以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，計算WT-WWOX和MUT-WWOX的相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用兩獨立樣本t(或t′)檢驗和配對t檢驗、方差分析和q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 miR-18b-5p在膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤瘤旁組織中的表達 與瘤旁組織(0.52±0.05)相比，在膠質(zhì)瘤組織中miR-18b-5p的表達量(1.31±0.13)升高(t=42.44，P<0.01)(見圖1)。

2.2 抑制miR-18b-5p表達可抑制膠質(zhì)瘤U251細胞增殖并促進細胞凋亡 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-18b-5p組的miR-18b-5p表達量下降，細胞活性在24、48和72 h均下降，增殖相關(guān)蛋白Cyclin D1表達量下降，p21表達升高，細胞凋亡率上升，凋亡蛋白Bax表達上升，抗凋亡蛋白Bcl-2表達降低(P<0.01)(見圖2和表1～2)。

表1 抑制miR-18b-5p表達對細胞U251凋亡率及細胞活性的影響

表2 抑制miR-18b-5p表達對細胞U251中Cyclin D1、p21、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

2.3 miR-18b-5p靶向調(diào)控WWOX miR-18b-5p的序列中含有與WWOX3′UTR互補的核苷酸序列(見圖3)。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示，與對照miR-NC組相比，miR-18b-5p組野生型WT-WWOX的螢火蟲熒光素酶相對活性下降(P<0.01)，而突變型MUT-WWOX的螢火蟲熒光素酶相對活性無明顯變化(P>0.05)(見表3)。與miR-NC組相比，miR-18b-5p組的WWOX蛋白表達量降低；與anti-miR-NC組相比，anti-miR-18b-5p組的WWOX表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見表4)。

表3 雙熒光素酶報告實驗

表4 WWOX蛋白蛋白的表達

2.4 過表達WWOX可抑制U251細胞增殖和誘導(dǎo)細胞凋亡 與pCDNA3.1組相比，pCDNA3.1- WWOX組的WWOX蛋白表達量升高，增殖蛋白Cyclin D1表達降低，p21表達上升，細胞活性在24、48和72 h均下降，凋亡蛋白Bax表達升高，抗凋亡蛋白Bcl-2表達下降，細胞凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)(見圖4和表5～6)。

表5 過表達WWOX對細胞U251的細胞活性及凋亡率的影響

表6 過表達WWOX對細胞U251中Cyclin D1、p21、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響

2.5 抑制WWOX表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-18b-5p對U251細胞增殖、凋亡的影響 與anti-miR-NC組相比，anti-miR-18b-5p組的WWOX蛋白表達量升高，miR-18b-5p表達量下降，細胞活性在24、48和72 h均下降，Cyclin D1表達量下降，p21表達升高，細胞凋亡率上升，Bax表達上升，Bcl-2表達降低(P<0.01)，anti-miR-18b-5p+si-NC組與anti-miR-18b-5p組結(jié)果差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-18b-5p+si-WWOX組與anti-miR-18b-5p組結(jié)果相反(P<0.05～P<0.01)(見圖5和表7～8)。

表7 抑制WWOX表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-18b-5p對細胞U251的細胞活性就凋亡率的影響(x±s)

表8 抑制WWOX表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-18b-5p對細胞U251中Cyclin D1、p21、Bax、Bcl-2蛋白表達的影響(x±s)

3 討論

miRNA在膠質(zhì)瘤中差異表達，可能是膠質(zhì)瘤的診斷和預(yù)后生物標志物[7]。miRNA富含于大腦，其差異表達對膠質(zhì)瘤的發(fā)生起重要作用，其參與受體酪氨酸激酶信號傳導(dǎo)、血管生成、侵襲、分化抑制、細胞周期增強和凋亡抑制[8]。識別關(guān)鍵的miRNA也可為開發(fā)膠質(zhì)瘤有效的生物標志物和抑制性RNA策略提供依據(jù)。

miR-18b-5p在多種腫瘤組織中表達異常。WANG等[9]最新研究發(fā)現(xiàn)，在紫杉醇抵抗的乳腺癌細胞株MCF-7/PR中，miR-18b-5p是lncRNA AC073284.4的直接靶點，AC073284.4可通過上調(diào)DOCK4靶向結(jié)合miR-18b-5p，從而減輕乳腺癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化。miR-18b-5p在結(jié)直腸癌病人血漿[10]和大腸癌組織[11]中表達上調(diào)，通過下調(diào)PTEN表達誘導(dǎo)PI3K/Akt2信號通路持續(xù)活化，促進大腸癌發(fā)生發(fā)展。miR-18b-5p在前列腺癌中表達降低，與腫瘤惡性程度有關(guān)，對預(yù)測前列腺癌具有較高的敏感性和特異性[12]。研究[3-4]發(fā)現(xiàn)，miR-18b在膠質(zhì)瘤組織中表達上調(diào)，其作用尚不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，在膠質(zhì)瘤癌組織中miR-18b-5p的表達量顯著升高，抑制miR-18b-5p表達可以抑制膠質(zhì)瘤U251細胞增殖并促進細胞凋亡，說明miR-18b-5p在膠質(zhì)瘤中具有重要作用。

本研究通過生物信息學預(yù)測發(fā)現(xiàn)，WWOX的3′UTR中含有與miR-18b-5p互補的核苷酸序列，提示兩者可能存在結(jié)合位點或調(diào)控關(guān)系，WWOX可能參與miR-18b-5p對膠質(zhì)瘤的調(diào)控過程。WWOX包含兩個WW域和一個短鏈脫氫酶/還原酶域的相對分子質(zhì)量為46 000的蛋白質(zhì)，是一種腫瘤抑制因子，在乳腺癌、前列腺癌、食管癌、肺癌、胃癌和胰腺癌中表達缺失或減少，位于染色體16q23，跨越人類基因組第二常見的脆弱位點FRA16D[13]。WWOX在多形性膠質(zhì)母細胞瘤(GBM)中表達下調(diào)，其可誘導(dǎo)p53突變的GBM細胞發(fā)生凋亡，抑制GBM[14]。在膠質(zhì)母細胞瘤細胞T98G中高表達WWOX可抑制細胞增殖和對細胞外基質(zhì)的黏附力，促進細胞凋亡[15]。對3 622名中國成年人的研究發(fā)現(xiàn)，WWOX基因缺失可能易患膠質(zhì)瘤[16]。本研究結(jié)果表明，過表達WWOX可抑制U251細胞增殖和促進細胞凋亡，與這些研究結(jié)果一致，說明WWOX可抑制膠質(zhì)瘤。

雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果表明，miR-18b-5p靶向負調(diào)控WWOX的表達，進一步的實驗發(fā)現(xiàn)，抑制WWOX表達逆轉(zhuǎn)了下調(diào)miR-18b-5p表達對U251細胞增殖、凋亡的影響，說明兩者在膠質(zhì)瘤細胞中具有調(diào)控關(guān)系。miRNA的主要功能是在轉(zhuǎn)錄后水平對其靶基因進行負調(diào)控，每個miRNA調(diào)節(jié)多個靶標基因的表達[17]。因此，miR-18b-5p/WWOX的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍需進一步驗證。

綜上，本研究證實miR-18b-5p和WWOX在膠質(zhì)瘤中具有重要的作用，miR-18b-5p和WWOX有望做為膠質(zhì)瘤分子診治靶點。