徐之端，張懿剛，劉雙池，周 凱，吳斌全，尹宏祥，談 燚

肝癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅著人類(lèi)的健康。研究[1]表明近年來(lái)其發(fā)病率逐漸上升，在美國(guó)其每年新發(fā)病例超過(guò)42 000例，預(yù)計(jì)死亡病例約30 000例，且在發(fā)展中國(guó)家保持著較高的發(fā)病率。肝癌治療的常用手段有手術(shù)治療和非手術(shù)治療，其中手術(shù)切除是首選的治療方式[2]。但很多病人在腫瘤發(fā)現(xiàn)時(shí)即處于終末狀態(tài),手術(shù)已無(wú)意義,即便能夠通過(guò)外科手術(shù)去干預(yù)切除,約2/3 的病人仍然會(huì)出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移[3]。近年來(lái),放化療以及靶向治療和免疫治療等方面取得很大進(jìn)展,但由于其高侵襲性、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等因素,肝癌病人預(yù)后仍相對(duì)較差[4]。因此進(jìn)一步探究肝癌的發(fā)病機(jī)制，尋找新的潛在的治療靶點(diǎn)和預(yù)后相關(guān)因素，對(duì)于提高肝癌病人的生存率，改善其生活質(zhì)量至關(guān)重要。人類(lèi)NOP2核仁蛋白(NOP2 nucleolar protein,NOP2)也被稱為RNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族成員2(RNA methyltransferase 2,NSUN2)，是SUN結(jié)構(gòu)域家族成員之一，其是在mRNA和非編碼RNA中通過(guò)共價(jià)鍵催化5-甲基胞嘧啶M5C形成的主要酶[5-7]。既往已有研究[8-9]證實(shí)NOP2可促進(jìn)小鼠成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)和腫瘤的形成，在多種腫瘤如頭頸部鱗癌、結(jié)腸癌、口腔癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌和乳腺癌細(xì)胞及組織中高表達(dá)，發(fā)揮重要作用，但在正常組織中不表達(dá)。因此NOP2目前被證實(shí)可作為一種預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后的標(biāo)志物。本研究旨在通過(guò)生物信息學(xué)分析，探究NOP2在肝癌發(fā)生及進(jìn)展過(guò)程中的作用及其相關(guān)通路，進(jìn)一步研究其對(duì)于肝癌病人預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值，為肝癌的臨床治療提供相關(guān)思路和策略。

1 材料與方法

1.1 原始數(shù)據(jù) 從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portal.gdc.cancer.gov/)下載497例肝癌病例(腫瘤樣本497例。癌旁樣本54例)的RNA序列數(shù)據(jù)和486例臨床特征的相應(yīng)數(shù)據(jù)。

1.2 生成ImmuneScore、StormalScore和ESTIMATEScore 腫瘤微環(huán)境中每個(gè)樣本的免疫成分的比率以3個(gè)分?jǐn)?shù)的形式表示：ImmuneScore、StormalScore和ESTIMATEScore，這3個(gè)分?jǐn)?shù)由ESTIMATE算法(R 語(yǔ)言版本 4.0.2)實(shí)現(xiàn)。分?jǐn)?shù)越高，腫瘤免微環(huán)境中相應(yīng)成分的比例越大。

1.3 生存分析 使用R語(yǔ)言中的Survminer包執(zhí)行生存分析。在497例病人中，477例腫瘤樣本具有詳細(xì)的生存信息，能夠納入生存分析。生存曲線采用Kaplan-Meier法繪制，采用對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)作為檢驗(yàn)方式，P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.4 差異表達(dá)基因(DEGs)的篩選 根據(jù)ImmuneScore和StormalScore的中位數(shù)，將497例腫瘤標(biāo)本分為高、低表達(dá)2組。使用limma軟件包進(jìn)行差異分析，通過(guò)比較高表達(dá)組和低表達(dá)組樣本生成DEGs。log2(高表達(dá)組/低表達(dá)組)變化>1的DEGs和錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(FDR)<0.05時(shí)認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 熱圖 DEGs的熱圖由R語(yǔ)言和pheatmap軟件包生成。

1.6 臨床分期與評(píng)分的差異分析 與肝癌樣本對(duì)應(yīng)的臨床數(shù)據(jù)從TCGA下載。根據(jù)R軟件中比較的臨床分期，采用Wilcoxon秩和檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

1.7 基因集富集分析(GSEA) GSEA采用軟件GSEA-4.1.0(從BroadInstitute下載)Hallmark作為目標(biāo)集(從Molecular SignaturesDatabase下載)。所有納入樣本，NOM的P<0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.8 免疫細(xì)胞相關(guān)性分析 采用CIBERSORT 計(jì)算方法估算所有腫瘤樣本中腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的分布，并進(jìn)行質(zhì)量篩選，P<0.05 時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，納入研究。該數(shù)據(jù)均下載自 TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)(https://portal.gdc.cancer.gov)。

1.9 qRT-PCR試驗(yàn) 從蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院2021年6月至2022年6月行肝切除術(shù)的原發(fā)性肝癌病人中獲得的10對(duì)石蠟切片對(duì)癌巢及相鄰癌旁組織進(jìn)行qRT-PCR試驗(yàn)。根據(jù)廠家說(shuō)明書(shū)，使用 TRIzol 試劑提取總 RNA，合成 cDNA，采用 2-△△Ct方法進(jìn)行qRT-PCR 計(jì)算。相關(guān)引物顯示如下:NOP2,F:5′-AAG GGT GCC GAG ACA GAA CT-3′，R:5′-GAG CAC GAC TAG ACA GCC TC-3′;β-actin,F:5′-CTC GCC TTT GCC GAT CC-3′，R:5′-TTC TCC ATG TCG TCC CAG TT-3′。本研究獲得蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院機(jī)構(gòu)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有統(tǒng)計(jì)分析和繪圖均使用 R 軟件(版本 4.0.2)或 GraphPad Prism(版本 8.0.1)完成。Student′st檢驗(yàn)用于比較基因的表達(dá)差異。Spearman 相關(guān)分析用于評(píng)估 NOP2表達(dá)水平與各種免疫相關(guān)細(xì)胞表達(dá)之間的關(guān)系。生存分析基于 Kaplan Meier方法，P<0.05 被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 生存相關(guān)性分析 采用Kaplan-Meier生存分析計(jì)算ESTIMATEScore、ImmuneScore和StormalScore，以確定估計(jì)評(píng)分與肝癌病人生存期之間的關(guān)系。較高的ESTIMATEScore表明腫瘤微環(huán)境中的相應(yīng)成分含量較多，ESTIMATEScore是兩種成分的總和，代表所有免疫相關(guān)成分的綜合百分比。結(jié)果顯示，ESTIMATEScore和ImmuneScore與肝癌病人的總生存率呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)(見(jiàn)圖1A、1B)；而StormalScore與肝癌病人總生存率無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)(見(jiàn)圖1C)。

2.2 病理分期和TNM分期與ESTIMATEScore、ImmuneScore和StormalScore相性分析 在T1與T2、T3、T4分期方面，ESTIMATEScore和ImmuneScore表現(xiàn)出較大的相關(guān)性(P<0.05)；M分期方面，ESTIMATEScore、ImmuneScore和StormalScore均呈明顯正相關(guān)(見(jiàn)圖1D～1F)。

2.3 DEGs的篩選 將差異表達(dá)基因分為高評(píng)分組和低評(píng)分組，隨后進(jìn)行比較分析。交叉的結(jié)果顯示，共有3個(gè)上調(diào)基因和3個(gè)下調(diào)基因與免疫評(píng)分和基質(zhì)評(píng)分均相關(guān)。

2.4 NOP2表達(dá)與肝癌病人生存及臨床特點(diǎn)的相關(guān)性分析 將所有的肝癌病人樣本分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，通過(guò)生存分析結(jié)果表明，NOP2與肝癌病人的生存率表現(xiàn)出明顯相關(guān)性，NOP2高表達(dá)組的生存期低于低表達(dá)組(P<0.01)(見(jiàn)圖2A)，此外，Wilcoxon秩和檢驗(yàn)的結(jié)果顯示，NOP2在肝癌腫瘤樣本中的表達(dá)明顯高于癌旁組織樣本(見(jiàn)圖2B)。

2.5 NOP2與免疫細(xì)胞的相關(guān)性分析 GSEA結(jié)果顯示NOP2的高表達(dá)與部分免疫活動(dòng)相關(guān)，如腫瘤壞死因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、輔助T細(xì)胞分化的調(diào)控、CD4+T細(xì)胞分化調(diào)控和自然殺傷(NK)細(xì)胞活化的調(diào)控等(見(jiàn)圖3A)，因此本研究進(jìn)一步探究NOP2與腫瘤微環(huán)境之間的關(guān)系。在肝癌樣本中有15種免疫細(xì)胞在腫瘤和鄰近組織之間呈現(xiàn)明顯不同的表達(dá)水平(見(jiàn)圖3B)，然后進(jìn)行免疫細(xì)胞相關(guān)分析，共有15個(gè)免疫細(xì)胞與NOP2的表達(dá)相關(guān)。在差異表達(dá)的免疫細(xì)胞和相關(guān)細(xì)胞交叉后，最終獲得了11個(gè)與腫瘤微環(huán)境相關(guān)的免疫細(xì)胞(見(jiàn)圖4A)。6種免疫細(xì)胞與NOP2表達(dá)呈正相關(guān)，包括M0巨噬細(xì)胞、靜止期NK細(xì)胞、激活期CD4+記憶T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)。5種免疫細(xì)胞與NOP2的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，包括記憶B細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、休止期CD4+記憶T細(xì)胞(見(jiàn)圖4B～4L)。

2.6 NOP2在肝癌和癌旁組織中的mRNA表達(dá) 結(jié)果顯示,NOP2在癌組織中高表達(dá)(1.137±0.02)，在癌旁組織中低表達(dá)(0.443±0.03)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t= 25.41，P<0.01)。

3 討論

雖然目前對(duì)于肝癌的病理分級(jí)、臨床分期和治療方案有一套成熟的國(guó)際指南，但對(duì)于每個(gè)肝癌病人的個(gè)體化最佳治療方案，仍有許多問(wèn)題未得到解決，手術(shù)肝切除作為早期肝癌的重要治療方案，但其仍然存在一定的局限性，如病灶不可切除、術(shù)后復(fù)發(fā)、腫瘤轉(zhuǎn)移等[10]。但大多數(shù)病人在診斷時(shí)已屬中晚期，病情復(fù)雜，預(yù)后差，目前我國(guó)肝癌病人5年總體生存率不足15%[11]。近年來(lái)，針對(duì)肝癌的靶向聯(lián)合免疫治療取得了一系列積極進(jìn)展。如晚期肝癌病人常用靶向聯(lián)合免疫藥物如索拉非尼、侖伐替尼以及PD-1單抗，然而，鑒于肝癌的異質(zhì)性，只有不到 30%的病人從該療法中獲益，并且其耐藥性明顯[12]?；诖耍覀兤惹行枰獙ふ倚碌闹委熀蜐撛诘念A(yù)測(cè)靶點(diǎn)，從而對(duì)小分子抑制劑、單克隆抗體和表觀遺傳因子的進(jìn)一步研究提供方案，對(duì)于延長(zhǎng)肝癌病人生存時(shí)間以及改善晚期肝癌病人生活質(zhì)量至關(guān)重要。

目前，腫瘤微環(huán)境作為癌癥治療的起點(diǎn)，發(fā)揮著重要作用，尋找和探索與特定腫瘤相關(guān)的腫瘤微環(huán)境機(jī)制，改變腫瘤微環(huán)境狀態(tài)，可為未來(lái)腫瘤治療提供新的潛在靶點(diǎn)[13]。本研究目的在于從TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找與腫瘤微環(huán)境相關(guān)的基因，從而幫助預(yù)測(cè)肝癌病人的臨床特征。本研究結(jié)果表明腫瘤微環(huán)境中的免疫組分與肝癌病人的生存表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性，較晚的M分期與較高的免疫評(píng)分相關(guān)，因此可推斷腫瘤微環(huán)境中的免疫基質(zhì)和免疫成分可促進(jìn)肝癌的惡性生物學(xué)行為如轉(zhuǎn)移和侵襲等。經(jīng)過(guò)一系列生物信息學(xué)分析，最終NOP2被認(rèn)為是一個(gè)潛在的與肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因，其表達(dá)與肝癌病人的生存率表現(xiàn)出明顯的相關(guān)性。Wilcoxon秩和檢驗(yàn)的結(jié)果表明，NOP2在肝癌腫瘤樣本中的表達(dá)明顯高于癌旁組織樣本，與在同一病人的癌旁組織和腫瘤組織之間的配對(duì)分析結(jié)果一致。從而證明腫瘤微環(huán)境中NOP2的表達(dá)水平與肝癌病人的生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。

前期研究[14]表明，NOP2與細(xì)胞增殖、干細(xì)胞分化和人類(lèi)癌癥有關(guān)，F(xiàn)rye和Watt 首先描述了NOP2在細(xì)胞增殖中的作用，認(rèn)為NOP2是細(xì)胞增殖狀態(tài)的關(guān)鍵調(diào)控因子，他們發(fā)現(xiàn) NOP2的表達(dá)在MYC激活后明顯升高，并能夠調(diào)控整個(gè)細(xì)胞周期，使細(xì)胞周期發(fā)生顯著的變化。在腫瘤惡性程度方面，NOP2基因拷貝數(shù)在口腔癌和結(jié)直腸癌中明顯增加且呈高表達(dá)狀態(tài)，認(rèn)為NOP2參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。在宮頸癌中，tRNA修飾酶因子NOP2和METTL1，參與宮頸癌HeLa細(xì)胞的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移，并增強(qiáng)了宮頸癌HeLa細(xì)胞對(duì)氟尿嘧啶化療的敏感性[15]。在膽囊癌中，高表達(dá)的NOP2通過(guò)調(diào)控轉(zhuǎn)錄下游因子RPL6，在體內(nèi)外均促進(jìn)膽囊癌的增殖、侵襲與轉(zhuǎn)移，并參與膽囊癌的致瘤功能[16]。在干細(xì)胞分化方面， lncRNA-mPvt1是一種癌胎兒RNA，被發(fā)現(xiàn)可促進(jìn)細(xì)胞增殖、細(xì)胞循環(huán)和小鼠細(xì)胞干細(xì)胞樣特性的表達(dá)。利用高通量芯片和質(zhì)譜分析技術(shù)篩選出lncRNA-hPVT1在原發(fā)性肝癌組織中表達(dá)上調(diào)，且lncRNA-hPVT1高表達(dá)與病人臨床預(yù)后不良相關(guān)，NOP2作為lncRNA-hPVT1結(jié)合的 RNA結(jié)合上游蛋白，LncRNA-hPVT1通過(guò)上調(diào)NOP2的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤增殖、肝細(xì)胞分化、肝再生，在肝轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了極其重要的作用[17]。在透明細(xì)胞型腎癌中，NOP2在透明細(xì)胞型腎癌中呈高表達(dá)，且與病人的不良預(yù)后相關(guān)，因此認(rèn)為核仁蛋白NOP2可作為一種潛在的治療靶點(diǎn)[18]。在前列腺癌中，長(zhǎng)鏈非編碼RNALINC00963在前列腺癌組織中增加，促進(jìn)了PCa細(xì)胞的體外遷移和體內(nèi)轉(zhuǎn)移，LINC00963通過(guò)結(jié)合miR-542-3p調(diào)控上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，從而促進(jìn)核仁蛋白NOP2的表達(dá)。與此同時(shí)，NOP2作為白細(xì)胞介素(IL)-6的特異性受體，IL-6和IGF-I在高表達(dá)的NOP2受體中具有高效的協(xié)同作用，進(jìn)一步闡述了IL-6與NOP2在人類(lèi)骨髓瘤細(xì)胞中受體交叉對(duì)話的信號(hào)機(jī)制[19]。本研究進(jìn)一步探索了 NOP2 在肝癌腫瘤微環(huán)境中的免疫學(xué)作用，結(jié)果表明NOP2可對(duì)11種腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞產(chǎn)生影響，其中6種免疫細(xì)胞與NOP2表達(dá)呈正相關(guān)，包括M0巨噬細(xì)胞、靜止期NK細(xì)胞、激活期CD4+記憶T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、濾泡輔助性T細(xì)胞、Treg。5種免疫細(xì)胞與NOP2的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，包括記憶B細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、M2巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、休止期CD4+記憶T細(xì)胞。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了NOP2參與肝癌腫瘤微環(huán)境中的免疫反應(yīng)性調(diào)節(jié)。

綜上所述，采用ESTIMATE算法挖掘出與肝癌腫瘤微環(huán)境相關(guān)的基因，證實(shí)NOP2是肝癌病人的潛在預(yù)后基因。更重要的是證實(shí)了NOP2可參與調(diào)節(jié)肝癌腫瘤微環(huán)境中的免疫細(xì)胞的數(shù)量。但本研究仍然存在一定的局限性，NOP2發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步探索，且進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證也是非常有必要的。本研究證實(shí)了NOP2對(duì)于肝癌的預(yù)后價(jià)值，為肝癌的臨床治療提供新的思路，進(jìn)而有助于改善肝癌病人的預(yù)后，提高其生存質(zhì)量。