朱莉文，孫彩敬

精神分裂癥屬于重性精神疾病，病人主要特征為認識(思維與感知)、行為活動異常。在人們生產(chǎn)生活方式不斷改變的今天，精神分裂癥臨床發(fā)病率表現(xiàn)出逐年升高趨勢。地卓西平(MK-801)可以通過拮抗N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體方式模擬精神分裂癥病人陽性(快速移動)與陰性(包括刻板行為和焦慮情緒)癥狀[1-2]。臨床常對精神分裂癥采取利培酮進行治療，尤其對于合并情感障礙病人，可產(chǎn)生良好的療效[3]。當前，銀杏葉提取物(extract of Ginkgo biloba，EGB)治療精神分裂癥相關研究很多，但涉及MK-801致精神分裂癥模型大鼠實驗的相關作用機制研究較少。鑒于此，本研究以上述模型大鼠為對象，研究給予EGB對該模型大鼠的改善作用及其機制，以期為EGB的進一步研發(fā)及臨床應用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 40只Sprague-Dawley(SD)大鼠，且均為成年雄性，體質量為250～300 g，來自黑龍江中醫(yī)藥大學動物實驗中心，許可證號：SCXK(黑)2013-004。置于20～26 ℃環(huán)境飼養(yǎng)，濕度控制為50%～60%，對其定期清洗消毒，飼養(yǎng)7 d后開始實驗。

1.2 儀器 LC-6A型高效液相色譜儀，購自日本島津公司；AG125型電子天平，購自梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；離心機(型號為TGL-16)，購自上海醫(yī)療器械廠)；WHI型漩渦震蕩器，購自浙江樂成電器廠；TU-1900型雙光束紫外線可見光光度計，購自北京普析通用儀器公司；Morris水迷宮與曠場實驗相關測試系統(tǒng)，由上海欣軟信息科技有限公司提供。

1.3 主要藥品及試劑 自行配置的0.9%氯化鈉溶液；MK-801(美國SIGMA公司，臨用時將其配制為0.01 mg/mL的注射液)；EGB761(Beaufour Ipsen Industrie，臨用時將其配制為100 mg/L的溶液)；利培酮(齊魯制藥，國藥準字：H20041807，臨用時將其配制為0.036 mg/mL的混懸液)；丙二醛(MDA)試劑盒(批號：A003)、超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒(批號：A001-3)，均購自南京建成生物工程研究所；自行配置的95%乙醇；谷氨酸(Glu)標準品，購自sigma公司；蒸餾水等。

1.4 方法

1.4.1 分組、建模及給藥 將40只大鼠隨機分為空白組、模型組、對照組與實驗組，各10只。模型組、對照組與實驗組大鼠采取腹腔注射方式注入0.01 mg/mL MK-801，取下側腹腔較為靠近外側1/3部位，連續(xù)注射2周；空白組大鼠連續(xù)注射2周0.9%氯化鈉溶液，注射體積同其他3組。建模后，對照組大鼠每天使用0.05 mL/kg利培酮懸浮液進行灌胃治療；實驗組每天使用200 mg/kg EGB761進行灌胃治療；另外2組使用等體積蒸餾水，連續(xù)2周。

1.4.2 大鼠血清及組織中相關指標檢測 Glu表達測定：采取HPLC-ECD法，在1 mL預冷95%乙醇之中加入大鼠額前腦組織，進行離心處理，取5 mg樣品放入離心管，再添加衍生工作液50 μL，進行渦旋震蕩處理1 min之后，取20 μL放進色譜儀，詳細記錄色譜圖，最后計算峰面積，獲取Glu表達情況。以黃嘌呤氧化酶法(WST-1)進行血清SOD水平的測定；以硫代巴比妥酸法(TBA)進行血清MDA水平的測定；均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4.3 鼠Morris水迷宮實驗觀察 逃避潛伏期：灌胃治療結束前5 d，把4組大鼠置于Morris水迷宮之中自由游泳1 min，讓其熟悉環(huán)境，確保大鼠泳姿以及速度正常，在治療結束前4、3、2、1、0 d(評估第1、第2、第3、第4、第5天)把4組大鼠置于Morris水迷宮之中訓練，每只訓練2組/天，1 min內(nèi)沒有找到平臺表明逃逸潛伏期60 s，把各大鼠置于不同象限，注意放入時保證其面向水池壁，詳細記錄具體逃逸潛伏期。

1.4.4 大鼠曠場實驗行為觀察 曠場實驗：完成逃避潛伏期檢測后，采用曠場實驗測試系統(tǒng)(組成包括分析軟件、測驗箱、視頻圖樣采樣卡以及視頻合成器等)跟蹤大鼠活動，記錄其具體活動軌跡，并且算出活動路程；其中測驗箱選擇排凈水Morris水迷宮，控制環(huán)境之內(nèi)均照明200 lx，并且伴50 dB白噪音，把大鼠置于無安全平臺相應無水水池之中，大鼠依然尋找安全平臺，使其自由活動10 min，詳細記錄大鼠穿越次數(shù)、中央活動路程比(中心區(qū)活動路程/總路程)、中央活動時間比(中心區(qū)活動時間/總時間)。

1.5 統(tǒng)計學方法 采用t檢驗和q檢驗。

2 結果

2.1 各組大鼠血清MDA、SOD水平及腦組織Glu表達比較 與空白組相比，模型組大鼠MDA水平明顯升高，SOD、Glu表達水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，對照組與實驗組MDA水平明顯降低，SOD、Glu表達水平明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。與對照組相比，實驗組Glu表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，MDA、SOD水平差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表1)。各組大鼠腦組織Glu HPLC色譜圖見圖1。

表1 各組大鼠血清MDA、SOD水平及腦組織Glu表達比較

2.2 各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期比較 評估第1天、第2天，與空白組相比，模型組、對照組與實驗組大鼠逃避潛伏期明顯延長，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而模型組、對照組與實驗組3組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。評估第3天、第4天、第5天，與模型組相比，對照組與實驗組大鼠逃避潛伏期明顯縮短，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，而對照組與實驗組2組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表2)。

表2 各組大鼠Morris水迷宮逃避潛伏期比較

2.3 各組大鼠曠場實驗行為比較 與空白組相比，模型組大鼠穿越次數(shù)、中央活動時間比與中央活動路程比均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與模型組相比，對照組與實驗組穿越次數(shù)、中央活動時間比與中央活動路程比均明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，對照組與實驗組2間比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(見表3)。

表3 各組大鼠曠場實驗行為比較

3 討論

MK-801能夠通過抑制神經(jīng)沖動與人腦中興奮傳導通路，阻礙神經(jīng)興奮傳導，最終引起神經(jīng)遞質傳遞障礙。同時，MK-801也能有效阻斷顳葉-海馬系統(tǒng)與額葉-海馬系統(tǒng)NMDA受體，導致海馬神經(jīng)細胞功能出現(xiàn)缺陷。因而，實驗常采用MK-801建立精神分裂癥動物模型。有研究[4]表明，隨EGB761劑量增加，表現(xiàn)出劑量依賴關系，高劑量癥狀改善效果更好。故本研究直接選擇200 mg·kg-1·d-1EGB761，未根據(jù)劑量分組進行研究。

SOD清除氧自由基主要通過催化超氧陰離子O2-生成過氧化氫H2O2方式，再由過氧化氫酶(CAT)與谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)催化H2O2形成具有安全無害性產(chǎn)物[水(H2O)與氧(O2)]，同時SOD亦能保護CAT以及GSH-Px不被O2-滅活，防止脂質過氧化反應損傷細胞。相關研究[5]表明，精神分裂癥病人會產(chǎn)生血清抗氧化物質水平異?，F(xiàn)象，推測腦內(nèi)存在大量氧自由基，同時生理性清除功能減弱，使得脂質過氧化反應損傷加重，對病人中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)揮毒性作用，可能促進精神分裂癥發(fā)生及發(fā)展。MDA屬于機體內(nèi)氧自由基在抗氧化物質參與鏈式反應下形成的降解產(chǎn)物，可一定程度反映精神分裂癥病人體內(nèi)脂質過氧化程度，如果氧自由基堆積量增多，則會加劇脂質過氧化，由此會生成大量MDA。氧化-抗氧化系統(tǒng)動態(tài)平衡被破壞，將出現(xiàn)氧化應激反應，損傷腦組織之中神經(jīng)細胞，引起精神分裂癥等各種精神障礙疾病，而SOD和MDA表達與氧化應激反應損傷具有相關性。有研究指出，Glu系統(tǒng)活動異常，可對神經(jīng)元可塑性產(chǎn)生影響，引起神經(jīng)毒性，同時啟動神經(jīng)元分泌Glu等遞質，對γ-氨基丁酸能神經(jīng)元上相應NMDA 受體產(chǎn)生作用，從而形成負反饋作用來調(diào)節(jié)Glu釋放水平；MK-801可以破壞該循環(huán)回路里面的NMDA 受體，引起興奮性傳導處于脫抑制狀態(tài)，導致腦內(nèi)遞質失衡，最終引發(fā)精神癥狀[6-7]。相關研究[8-9]發(fā)現(xiàn)，EGB能夠起到保護Glu導致的興奮性毒性損害的功效。EGB治療精神分裂癥主要倫理依據(jù)為：發(fā)揮抗氧化以及質膜穩(wěn)定功能，EGB可優(yōu)化中樞神經(jīng)能力代謝狀態(tài)，減少自由基，有效降低脂質過氧化反應，達到改善腦血液流變性目的[10-11]。本實驗中，與空白組相比，模型組大鼠MDA水平明顯升高，SOD、Glu表達水平明顯降低；與模型組相比，對照組與實驗組MDA水平明顯降低，SOD、Glu表達水平明顯升高；與對照組相比，實驗組Glu表達水平明顯升高。提示大鼠模型存在血清MDA水平顯著升高、血清SOD水平與腦組織Glu表達顯著降低的現(xiàn)象，而EGB能夠促進血清MDA、SOD水平和腦組織Glu表達恢復，產(chǎn)生良好的抗氧化與抑制脂質過氧化的功效。

Morris水迷宮可用于評估大鼠空間認知功能與記憶學習能力[12]。曠場實驗能夠評估情緒反應情況、中樞興奮狀態(tài)、自主探索活動能力以及運動功能等，通常中央?yún)^(qū)域探索活動量降低，說明中樞興奮性減弱，出現(xiàn)情緒障礙(如抑郁)行為；如果周邊區(qū)域自主活動逐漸增多，則表示興奮性升高且出現(xiàn)焦慮恐懼情緒[13-14]。同時，曠場實驗也能在一定程度上將模型大鼠記憶能力有效反映出來。本實驗結果顯示，評估第1天、第2天，與空白組相比，其余3組逃避潛伏期具有明顯延長表現(xiàn)，且3組間比較無統(tǒng)計學意義；評估第3天、第4天、第5天，與模型組相比，對照組與實驗組大鼠逃避潛伏期明顯縮短；與空白組相比，模型組大鼠平均穿越次數(shù)、中央活動時間比以及中央活動路程比明顯更大；與模型組相比，對照組與實驗組平均穿越次數(shù)、中央活動時間比與中央活動路程比明顯增加，與蔡菡等[15]研究結論一致。說明EGB能夠提高精神分裂癥大鼠認知與學習記憶能力，改善不良情緒。

綜上所述，EGB對MK-801致精神分裂癥模型大鼠的改善作用機制可能為通過抑制脂質過氧化反應，改善Glu功能障礙引起的精神分裂癥狀，從而提高記憶、認知能力，緩解不良情緒狀態(tài)。但本次實驗樣本較少，且未比較不同劑量與不同時間處理結果，具有一定局限性，更詳細、確切的作用機制仍待后續(xù)更全面、更大樣本的研究進一步證實。