張棲瀝

(玉溪明鏡司法鑒定中心，云南 玉溪 653100)

血液中乙醇的測定，經(jīng)歷不斷地發(fā)展和完善，目前常用于司法鑒定機(jī)構(gòu)中的方法是頂空-氣相色譜法。頂空-氣相色譜法，是在氣相色譜儀進(jìn)樣口前增加一個頂空進(jìn)樣裝置(分為手動和自動)的一種色譜技術(shù)，也常被解釋為將頂空進(jìn)樣器與氣相色譜儀聯(lián)用的儀器。其工作原理是以氣體作為流動相，樣品由微量注射器“注射”進(jìn)入進(jìn)樣器，氣化后被載氣攜帶進(jìn)入填充色譜柱或毛細(xì)管柱。由于樣品中各組分在色譜中的流動相(氣相)和固定相(固相)間分配或吸附系數(shù)的差異，各組分在兩相間做反復(fù)多次分配，使各組分在柱中得到分離，在色譜柱后的檢測器將各組分按順序檢測出來。頂空氣相色譜分析相比普通色譜分析主要有以下優(yōu)點：一、廣泛使用，范圍更廣。既可分析液體樣品中的揮發(fā)性組分，也能分析固體樣品中的揮發(fā)性物質(zhì)；既適用于單組分揮發(fā)性氣樣的分析，也能對組成復(fù)雜的揮發(fā)性組分混合物進(jìn)行分離分析；既能用于常量頂空氣樣分析，又能檢測低含量的揮發(fā)性組分。二、快速簡便、進(jìn)樣準(zhǔn)確。頂空氣相色譜分析直接取液體樣品(或固體樣品)的揮發(fā)性氣態(tài)樣品送進(jìn)氣相色譜儀進(jìn)行分離分析。在很多情況下，可以省去樣品前處理操作，人為干擾因素少，故此法要比普通的色譜分析更為快速簡便。另外，由于采用定量管進(jìn)樣，分析更準(zhǔn)確。三、低檢測限、重現(xiàn)性好。頂空氣相色譜分析有時還可獲得比普通氣相色譜分析更低的檢測限，這是因為避開了常規(guī)樣品前處理過程中所帶來的溶劑干擾、以及頂空樣品的某些特殊性的緣故。其由于壓力平衡自動進(jìn)樣，重現(xiàn)性更好。由于頂空-氣相色譜儀分析具有獨特的優(yōu)越性，因此，在食品科學(xué)、環(huán)境科學(xué)、材料科學(xué)、生化科學(xué)分析領(lǐng)域中，得到了廣泛的應(yīng)用。我國公安部發(fā)布的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)GA/T 1073-2013《生物樣品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、異丙醇和正丁醇的頂空-氣相色譜檢驗方法》[1]和GA/T 842-2019《血液酒精含量的檢驗方法》[2]中對血液中乙醇的測定就是通過使用頂空-氣相色譜法，以乙醇的保留時間或相對保留時間進(jìn)行定性，采用內(nèi)標(biāo)法或外標(biāo)法定量，從而完成對液中乙醇的定性定量測定。

1 血液中乙醇測定影響因素

1.1 色譜柱分析系統(tǒng)的影響

氣化后的樣品在色譜柱種中被分離，隨載氣進(jìn)入檢測器。因此。色譜柱是氣相色譜儀的核心部件，合理地選擇色譜柱是建立較佳的色譜分析方法的中心環(huán)節(jié)。

色譜柱一般分為：填充柱和毛細(xì)管柱兩大類型。填充柱通常柱長1～3 m，內(nèi)徑3～6 mm，一般短柱用玻璃管，長柱用不銹鋼管。毛細(xì)管柱是用玻璃或熔融石英拉制成毛細(xì)管的色譜柱。柱長20～50 m，內(nèi)徑0.1～0.5 mm。相對于填充柱來說，毛細(xì)管柱一般具有更高的分離效能，這是因為：(1)毛細(xì)管柱孔徑小，內(nèi)壁固定液膜極薄，中心是空的，故阻力很小，而且渦流擴(kuò)散項不存在，譜帶展寬變小。由于毛細(xì)管柱的阻力很小，其長度可為填充柱的幾十倍，其總柱效比填充柱高得多。(2)毛細(xì)管柱的分析速度約為填充柱的數(shù)十倍。由于液膜極薄，分配比k很小，相比大，組分在固定相中的傳質(zhì)速度極快，因此有利于提高柱效和分析速度。(3)柱使用壽命長。當(dāng)然，毛細(xì)管柱也有其局限性。因其內(nèi)徑小，柱容量小，且對進(jìn)樣技術(shù)的要求更高，所以載氣流速的控制要求更為精確。進(jìn)樣量越小，意味著對檢測器的靈敏度要求就更高。因此，在血液中乙醇檢測的氣相色譜系統(tǒng)中，常用的色譜柱為毛細(xì)管色譜柱，檢測器為FID檢測器(火焰離子化檢測器)。在GA/T 1073-2013《生物樣品血液、尿液中乙醇、甲醇、正丙醇、乙醛、丙酮、異丙醇和正丁醇的頂空-氣相色譜檢驗方法》和GA/T 842-2019《血液酒精含量的檢驗方法》氣相色譜檢測參考條件中，DB-ALC1和DB-ALC2就是血液中乙醇分析中常用的超高惰性色譜柱，在很長一段時間內(nèi)都能保持良好的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性。

1.1.1 單柱與雙柱的定性

采用頂空-氣相色譜法(單柱單檢測器)進(jìn)行血液中乙醇含量檢測時，當(dāng)存在與乙醇(如鹵代羥基烷類吸入用全身麻醉劑)具有相似色譜行為的化合物時，在某些特定的色譜條件下，此類化合物的保留時間會和乙醇的保留時間相近，進(jìn)而導(dǎo)致色譜峰重合，最終會對檢測的結(jié)果形成干擾，此時將無法對陽性結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確有效的甄別[3]。當(dāng)定性無法準(zhǔn)確甄別判定時，就可能導(dǎo)致假陽性的定性，對當(dāng)事人造成不利影響，進(jìn)而讓辦案機(jī)關(guān)對鑒定機(jī)構(gòu)的鑒定質(zhì)量產(chǎn)生質(zhì)疑。

通過改變色譜柱、柱溫、載氣流速等氣相色譜檢測條件，可在一定程度上排除此類干擾物對乙醇定性分析的影響。因此，使用區(qū)分效能充足的雙色譜柱和雙FID檢測器系統(tǒng)進(jìn)行血液中乙醇含量檢測是定性判定的關(guān)鍵因素，雙柱雙檢測器的氣相色譜系統(tǒng)可以顯著降低假陽性判定的發(fā)生率，從而最終達(dá)到保障檢測機(jī)構(gòu)公信力的目的。

1.1.2 雙柱存在定量差異

在日常檢測工作中，血液中乙醇的定量方法通常采用內(nèi)標(biāo)法(主要為內(nèi)標(biāo)工作曲線法)。即在一系列不同濃度對照品溶液中加入相同內(nèi)標(biāo)物，分別測定其峰面積，以對照品峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值對對照品溶液濃度作線性回歸，求出線性回歸方程或繪制工作曲線，最終測定檢材的待測物的濃度。檢測過程中若出現(xiàn)干擾物，尤其是干擾物與內(nèi)標(biāo)物保留時間相近，此時便會造成內(nèi)標(biāo)物與干擾物未良好分離，從而導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)峰面積受到影響，最終造成雙柱的定量結(jié)果有較大差異。2016 年，文迪等[4]在對兩例血液乙醇含量檢測中，均檢出了丙酮成分，丙酮與叔丁醇的保留時間重合導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)峰面積增加。2019年，許龍慧等[5]在對一例血液乙醇含量檢測中，檢出未知干擾物，干擾物與叔丁醇的保留時間重合導(dǎo)致內(nèi)標(biāo)峰面積增加。當(dāng)內(nèi)標(biāo)峰面積增加，最終會使乙醇測定值降低，對乙醇定量結(jié)果產(chǎn)生干擾。因此，在檢測過程中，還應(yīng)該特別注意未知干擾物對檢測體系的影響。雙柱雙檢測器是提高氣相色譜系統(tǒng)抗干擾能力有效方法(其中前文提到的DB-ALC2由于獨特的極性，對于關(guān)鍵的乙醇/丙酮峰，比其它血液乙醇確證毛細(xì)管柱有更高的分離度)，通過雙柱雙檢測器系統(tǒng)，可以及時發(fā)現(xiàn)內(nèi)邊峰面積的異常變化，除此之外，檢測機(jī)構(gòu)在日常工作中，需要經(jīng)常關(guān)注容易產(chǎn)生假陽性的有關(guān)化合物和干擾物的相關(guān)文獻(xiàn)報道，有條件的機(jī)構(gòu)還可以通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法對未知干擾物進(jìn)行定性的確證分析。

1.2 血液樣本的采集和保存條件的影響

1.2.1 血液采集前處理

在采集血液前的消毒過程中，如果抽血人員使用了含有乙醇類的消毒劑時，并且在消毒劑未揮發(fā)前便進(jìn)行采血，可能導(dǎo)致提取的血液受到外來乙醇污染，并最終引發(fā)血液中乙醇的定量結(jié)果異常升高的問題[6]。因此采集血液樣本時，皮膚消毒劑宜使用不含醇類的聚維酮碘、0.1%苯扎氯銨溶液、0.1%苯扎溴銨溶液、1.0%醋酸氯己定溶液、雙氧水(20%)及不含乙醇的碘伏溶液，不應(yīng)使用含醇類或其他揮發(fā)性有機(jī)物的消毒劑[7]，徹底避免血液的假性升高問題。

1.2.2 血液采集部位

真空靜脈采血由于在全封閉的系統(tǒng)下進(jìn)行，而且真空采血管蓋帽密封性較好、膠塞中間有凹槽，這樣從根本上減少了血液受到接觸污染的機(jī)會，降低了血液樣本污染、溶血、凝血的發(fā)生，因此，活體的血液采集一般都選擇體表淺靜脈的真空采血。但是在有人員傷亡的交通事故或者因酗酒導(dǎo)致乙醇中毒的死亡案件中，由于人體在死亡后，身體代謝機(jī)能停止，胃內(nèi)的乙醇會彌散到鄰近的器官，當(dāng)彌散發(fā)生后，此時各器官組織內(nèi)的乙醇含量會存在明顯的差別。采集不同器官組織部位的血液，最終的乙醇定量結(jié)果也會不同。因此，在抽取尸體血液時，為了防止乙醇彌散所帶來的影響，此時需要首選股靜脈或鎖骨下靜脈血液采集；溺死尸體因液體進(jìn)入肺內(nèi)，心血被稀釋，亦應(yīng)采周圍血；對于損傷嚴(yán)重或殘缺的尸體，在無法提取到股靜脈或鎖骨下靜脈血液時，則可選擇心臟包腔血液[7]。

1.2.3 血液的保存

(1)血液儲存容器

謝春等[8]研究發(fā)現(xiàn)，不同儲存容器對血液中乙醇濃度均有影響。普通采血管的乙醇濃度高于真空普通管，而真空普通管的乙醇濃度又高于真空抗凝管。造成乙醇濃度有差異的原因是：真空抗凝管能使血液保持在真空封閉的狀態(tài)，避免了乙醇的揮發(fā)、阻止了抗凝管內(nèi)外物質(zhì)的交換，并且因為抗凝劑的添加，有效防止了血液發(fā)生凝固。使用普通采血管、甚至促凝劑管采集的血樣，由于采血管內(nèi)未添加抗凝劑，血漿中的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗艿睦w維蛋白，血細(xì)胞聚集從而形成血凝塊。當(dāng)血液發(fā)生凝固后，此時采血管內(nèi)的固相便會增加、而相對應(yīng)的液相便會減少，最終導(dǎo)致血樣中乙醇含量檢測結(jié)果比抗凝管的結(jié)果高，因此真空抗凝管是血液中乙醇測定中樣本儲存的最佳容器。而在常見的真空抗凝管中，當(dāng)抗凝劑的種類不同時，因為抗凝管自身所含的液體體積會有差異，所以采集血樣后，不同種類抗凝劑對血液的稀釋作用也會有差異，最終導(dǎo)致血樣中乙醇含量定量結(jié)果也會有差異。涂國章等[9]研究發(fā)現(xiàn)EDTA-K2采血管作為儲存容器時，其血液乙醇含量檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性最好。因此，道路交通執(zhí)法人員為了確保血液乙醇檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，最好采用EDTA-K2采血管來儲存涉嫌酒駕的的人員的血樣，并按相關(guān)規(guī)定送檢。

(2)采血管的保存條件

血樣在保存過程中，會因溫度和時間而發(fā)生不同程度的自溶、腐敗、揮發(fā)、氧化等問題，不同溫度及時間對保存血液的有效期和質(zhì)量均有影響，隨溫度的升高，血液保存時效將會縮短，血液質(zhì)量將因損傷加強而下降，同一時期內(nèi)血液保存損傷作用隨溫度的降低而減輕[10]，所以血液乙醇含量檢測必須控制好合適的血樣保存溫度以確保血液質(zhì)量在有效的檢測時間內(nèi)不發(fā)生變化，從而保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。涂國章等[11]研究的4個溫度保存條件中，14天內(nèi)保存可在4～8 ℃冰箱冷藏，較長時間則在-20 ℃冰柜保存對血液乙醇含量檢測影響較小。因此，執(zhí)法機(jī)構(gòu)在按照規(guī)定抽血后需要低溫保存并及時送檢，檢測機(jī)構(gòu)在受理委托后，需要及時鑒定，不能及時鑒定的也必須低溫直立保存。

1.3 腐敗尸體血

人體死亡后，在適當(dāng)?shù)臏囟?、濕度和空氣氣流條件下，組織蛋白質(zhì)會在人體內(nèi)的微生物(主要是腐敗細(xì)菌)的作用下發(fā)生腐敗分解，從而發(fā)生尸體腐敗。尸體腐敗會伴隨產(chǎn)生乙醇、正丙醇、正丁醇等多種產(chǎn)物，且隨著時間延長，腐敗程度會加重。尤其是超過一天的尸體，不可忽視死后組織腐敗產(chǎn)生的乙醇量。針對死后腐敗血液中乙醇含量測定，需要綜合考慮死者生前的飲酒史以及是否患有糖尿病，避免血液腐敗后的自生醇現(xiàn)象對乙醇含量測定結(jié)果分析產(chǎn)生干擾[12]。劉兆等[13]研究發(fā)現(xiàn)腐敗尸體中生成的正丙醇和乙醇具有相關(guān)性，尸體在產(chǎn)生乙醇的同時，會平行地產(chǎn)生正丙醇，如果血中乙醇含量在正丙醇的20倍以內(nèi)，可以認(rèn)定是死后產(chǎn)生的乙醇；如超過此值，則系生前飲酒的標(biāo)志。但是隨著研究的不斷深入，正丙醇已不能作為血液中乙醇系腐敗產(chǎn)生的唯一依據(jù)，其作為腐敗尸體中乙醇生成濃度的指標(biāo)價值變得越來越有限。禹明筠等[14]研究表明，尸體血樣腐敗產(chǎn)生的乙醇不能導(dǎo)致 EtG (乙基葡萄糖醛酸苷)或 EtS (乙基硫酸酯)的產(chǎn)生。因此，血樣中的 EtG 和 EtS 可作為判斷尸體血樣中乙醇生前入體和死后產(chǎn)生的依據(jù)，從而避免由于較高濃度的自生乙醇而導(dǎo)致乙醇認(rèn)定的假陽性結(jié)果。除此之外，腐敗尸體也可取玻璃體液測定乙醇含量(玻璃體液的乙醇含量在尸體腐敗后一段時間內(nèi)仍能保持穩(wěn)定，血液與玻璃體液乙醇濃度的比例系數(shù)是0.98)。

1.4 檢測機(jī)構(gòu)日常質(zhì)量控制

在實際的檢測過程中，日常的質(zhì)量控制是檢測機(jī)構(gòu)最基本同時也是最重要的一個環(huán)節(jié)。一、檢測人員除了要具備最基本的相關(guān)專業(yè)知識和檢測能力以外，還得不斷學(xué)習(xí)新的專業(yè)技能，做到與時俱進(jìn)，并且按時進(jìn)行考核。二、檢測機(jī)構(gòu)按照規(guī)范要求配備好相應(yīng)的檢測設(shè)備后，在進(jìn)行檢測工作前，必須要對相應(yīng)的設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)檢定，保證設(shè)備能夠達(dá)到相對應(yīng)的校準(zhǔn)檢定的規(guī)范要求達(dá)到的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，并制定期間核查計劃和設(shè)備維護(hù)計劃。三、檢測機(jī)構(gòu)需要定期查新血液中乙醇測定的檢驗規(guī)范和要求，通過實驗室間比對或者能力驗證考核，優(yōu)化好設(shè)備的儀器參數(shù)條件。四、制備曲線時候所用到的標(biāo)準(zhǔn)品(不同濃度的乙醇標(biāo)準(zhǔn)樣品)一定得選擇有質(zhì)檢證書的國家級別的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，且標(biāo)準(zhǔn)品在有效期內(nèi)，這樣才能保證曲線的有效性及準(zhǔn)確性。五、檢驗檢測的環(huán)境條件需要滿足相關(guān)的標(biāo)準(zhǔn)要求，同時環(huán)境條件的記錄需要真實和及時。檢測結(jié)果會受到檢測人員、分析儀器、檢測方法和技術(shù)、檢材質(zhì)量、實驗室環(huán)境等影響而產(chǎn)生一定的誤差，產(chǎn)生檢測結(jié)果的不確定度。血液中乙醇含量檢測的不確定度主要來于檢材重復(fù)性檢測、乙醇標(biāo)準(zhǔn)曲線和氣相色譜儀的誤差[15]。因此檢測機(jī)構(gòu)的日常質(zhì)量控制，是一項系統(tǒng)、復(fù)雜但是又基本、關(guān)鍵的工作，為了保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性，檢測機(jī)構(gòu)應(yīng)該重視日常的質(zhì)量控制管理工作。

2 結(jié) 論

在司法鑒定中，血液中乙醇濃度測定的鑒定意見被視為醉駕案件審判的重要證據(jù)之一，其鑒定意見的合法性、真實性、準(zhǔn)確性將會直接影響辦案機(jī)關(guān)審判的公平公正，同時在酒駕醉駕案件處理、處罰及量刑上起著決定性作用。因此，檢測機(jī)構(gòu)在日常的血液中乙醇檢測工作中，通過識別并規(guī)避血液中乙醇測定中的不利影響因素，可有效提高血液中乙醇測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，提高其司法鑒定意見的證據(jù)價值。