黃曉婧，林平冬，王晶晶，張 紅，陳麗妃，吳允昆

(福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建 福州 350108)

枳殼為蕓香科植物酸橙(CitrusaurantiumL.)及其栽培變種的干燥未成熟果實，最早記載于南北朝《雷公炮炙論》，其味苦、辛、酸，性微寒，歸脾、胃經(jīng)，具有理氣寬中、行滯消脹的功效[1-2]。枳殼主要含有黃酮類、揮發(fā)油類、香豆素類和生物堿類等化學(xué)成分，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等多種藥理活性[3-4]。目前，天然藥材中總黃酮的提取方法主要有乙醇回流法、酶提取法、超聲波提取法、微波提取法等[5]。在此，作者采用超聲輔助雙水相體系提取枳殼總黃酮，通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化提取工藝，并通過DPPH法和ABTS法評價枳殼總黃酮的體外抗氧化活性。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

枳殼片，購于江西。置于60 ℃烘箱中烘干至恒重，粉碎，過60目篩，密封干燥保存。

柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品(純度98%)，上海源葉生物科技有限公司；ABTS(純度98%)、維生素C(VC，純度99%)，Sigma公司；DPPH自由基(純度97.03%)，MedChemExpress公司；無水乙醇、正丁醇、異丙醇、丙酮、K2S2O8、(NH4)2SO4、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、Na2CO3，均為分析純，西隴科學(xué)股份有限公司。

DZF-6051型真空干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HZF-A2000型電子天平，華志(福建)電子科技有限公司；PX224ZH/E型電子天平，奧豪斯儀器(常州)有限公司；WJX-200型高速多功能粉碎機，上海緣沃工貿(mào)有限公司；DTC-15J型超聲波清洗機，湖北鼎泰生化科技設(shè)備有限公司；5810R型臺式高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；UVmini-1285型紫外分光光度計，島津儀器有限公司；ReadMax1901型光吸收全波長酶標(biāo)儀，上海閃譜生物科技有限公司；Master Touch-S15/30UVF型純水系統(tǒng)，上海和泰儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 枳殼總黃酮含量的測定

采用比色法測定總黃酮含量。準(zhǔn)確稱取5 mg柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容至刻度，得濃度為0.1 mg·mL-1的柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL于50 mL容量瓶中，用無水乙醇定容至刻度，搖勻靜置，得系列濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液；以無水乙醇為空白對照，分別測定283 nm處吸光度。以柚皮苷濃度(c)為橫坐標(biāo)、吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)，擬合得線性回歸方程：A=0.0323c+0.0007，R2=0.9999。

圖1 柚皮苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of naringin

取200 μL枳殼提取液于10 mL容量瓶中，用純水定容至刻度，混勻后，取2 mL提取稀釋液測定283 nm處吸光度，以純水為空白對照，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算枳殼總黃酮含量。

1.2.2 雙水相體系的選擇

基于沈美榮等[6]的報道，對雙水相體系略作調(diào)整，雙水相體系為20 g，按質(zhì)量比配制。分別稱取質(zhì)量分?jǐn)?shù)35%的有機溶劑無水乙醇、正丁醇、異丙醇、丙酮及質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的無機鹽(NH4)2SO4、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、Na2CO3，加蒸餾水補齊至20 g，振蕩混勻，靜置；待溶液分相完全后加入0.5 g枳殼粉末，置于超聲波清洗機中，40 ℃、300 W條件下超聲提取10 min；4 000 r·min-1離心10 min后，過濾，分離上、下相，記錄體積，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除有機溶劑，分別取樣測定283 nm處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算雙水相體系上、下相中枳殼總黃酮含量，按下式分別計算枳殼總黃酮在雙水相體系的分配系數(shù)(K)、雙水相體系上、下相的體積比(R)、上相中枳殼總黃酮收率(Y1，%)以及上相中枳殼總黃酮得率(Y2，mg·g-1)[7]：

(1)

(2)

(3)

(4)

式中：c1、c2分別為雙水相體系上、下相中枳殼總黃酮含量，mg·mL-1；V1、V2分別為雙水相體系上、下相體積，mL；m為枳殼粉末質(zhì)量，g。

1.2.3 丙酮/NaH2PO4·2H2O雙水相體系相圖的繪制

雙水相體系相圖可用來表示雙水相形成的條件和定量關(guān)系，采用Albertson濁點法[7]繪制丙酮/NaH2PO4·2H2O雙水相體系相圖。準(zhǔn)確稱取4.5 g NaH2PO4·2H2O于100 mL錐形瓶中，加入10 mL蒸餾水，用玻璃棒攪拌至NaH2PO4·2H2O完全溶解，靜置10 min，得濃度為45%的NaH2PO4·2H2O溶液。用滴定管將丙酮緩慢滴入錐形瓶中，振蕩，使之混合均勻至渾濁不再消失為止，記錄消耗的丙酮體積；向錐形瓶中加入蒸餾水使溶液澄清，記錄消耗的蒸餾水體積。不斷重復(fù)上述操作30次，分別計算每次溶液渾濁時NaH2PO4·2H2O和丙酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。以NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)繪制雙水相體系相圖。

1.2.4 超聲輔助雙水相體系提取工藝的優(yōu)化

在固定超聲功率為300 W的基礎(chǔ)上，首先采用單因素實驗分別考察液料比、提取時間、提取溫度、NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)對枳殼總黃酮得率的影響，實驗重復(fù)3次。然后在單因素實驗的基礎(chǔ)上，以液料比(A)、提取時間(B)、提取溫度(C)、NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)(D)、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)(E)為考察因素，以枳殼總黃酮得率(Y2)為評價指標(biāo)，進(jìn)行L18(37)正交實驗優(yōu)化超聲輔助雙水相體系提取枳殼總黃酮的工藝。

1.2.5 枳殼總黃酮體外抗氧化活性的評價

1.2.5.1 DPPH自由基清除實驗

參照文獻(xiàn)[8]方法，并略作調(diào)整。精密稱取DPPH自由基2 mg，加入25.36 mL無水乙醇，配制成0.2 mmol·L-1DPPH自由基溶液。取濃度(μg·mL-1)分別為10、20、50、100、200、400、800、1 600、2 000、3 000的枳殼總黃酮提取液各0.2 mL，加入1.5 mL EP管中，分別加入0.2 mmol·L-1DPPH自由基溶液0.2 mL，振搖混勻，在室溫避光條件下靜置30 min，測定517 nm處吸光度(A1)；以等體積無水乙醇代替DPPH自由基溶液，同法操作，測定其吸光度(A2)；以等體積蒸餾水代替枳殼總黃酮提取液，同法操作，測定其吸光度(A0)；以VC為陽性對照。按式(5)計算DPPH自由基清除率：

(5)

1.2.5.2 ABTS自由基清除實驗

參照文獻(xiàn)[8]方法，并略作調(diào)整。取4.06 mg ABTS，加入1 mL蒸餾水，配制成7.4 mmol·L-1ABTS溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用；取1.05 mg K2S2O8，加入1.5 mL蒸餾水，配制成2.6 mmol·L-1K2S2O8溶液；將等體積的ABTS溶液和K2S2O8溶液混合，室溫避光保存12 h，得ABTS自由基母液，稀釋至0.1 mmol·L-1ABTS自由基工作液。取濃度(μg·mL-1)分別為10、20、50、100、200、400、800、1 600、2 000、3 000的枳殼總黃酮提取液各0.1 mL，加入1.5 mL EP管中，分別加入0.1 mmol·L-1ABTS自由基工作液0.9 mL，振搖混勻，置于避光處10 min，測定735 nm處吸光度(A1)；以等體積蒸餾水代替ABTS自由基溶液，同法操作，測定其吸光度(A2)；以等體積蒸餾水代替枳殼總黃酮提取液，同法操作，測定其吸光度(A0)；以VC為陽性對照。按式(6)計算ABTS自由基清除率：

(6)

1.3 統(tǒng)計分析

采用正交設(shè)計助手(3.1)進(jìn)行正交實驗設(shè)計，采用SPSS(V25.0)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，并計算IC50值。

2 結(jié)果與討論

2.1 雙水相體系的確定

分別選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)35%的有機溶劑無水乙醇、正丁醇、異丙醇、丙酮及質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%的無機鹽(NH4)2SO4、NaH2PO4·2H2O、Na2HPO4·12H2O、Na2CO3組成16種有機溶劑/無機鹽雙水相體系，采用超聲輔助雙水相體系提取枳殼總黃酮，結(jié)果見表1。

表1 不同雙水相體系對枳殼總黃酮提取的影響

由表1可知，枳殼總黃酮富集于雙水相體系的上相，在13種雙水相體系中枳殼總黃酮收率超過80%；枳殼總黃酮得率在不同雙水相體系中差別較大，其中采用丙酮/NaH2PO4·2H2O雙水相體系的提取效果最好，總黃酮得率最高達(dá)到67.75 mg·g-1。在4種有機溶劑體系中，總體上丙酮/無機鹽體系的提取效果較好，其次為乙醇、異丙醇，正丁醇最差；在4種無機鹽體系中，對枳殼總黃酮的萃取能力大小總體上為：NaH2PO4·2H2O>Na2HPO4·12H2O>(NH4)2SO4>Na2CO3，但Na2HPO4·12H2O和Na2CO3體系容易結(jié)晶，會影響實驗結(jié)果。綜合考慮，選擇丙酮/NaH2PO4·2H2O雙水相體系。

2.2 丙酮/NaH2PO4·2H2O雙水相體系相圖分析(圖2)

圖2 丙酮/ NaH2PO4·2H2O雙水相體系相圖Fig.2 Binodal curve of acetone/NaH2PO4·2H2O aqueous two-phase system

曲線將相圖劃分為上下兩相，下方是不分相的單相區(qū)；上方是兩相區(qū)，在兩相區(qū)內(nèi)，上相富含丙酮，下相富含NaH2PO4·2H2O；雙水相體系應(yīng)從曲線上方選擇。由圖2可知，在雙水相體系中有機溶劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與無機鹽的質(zhì)量分?jǐn)?shù)呈負(fù)相關(guān)，丙酮加入量越大，所需NaH2PO4·2H2O的量就越小。當(dāng)NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%時，丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)至少為30%。

2.3 單因素實驗結(jié)果

2.3.1 液料比對枳殼總黃酮得率的影響

在提取時間為20 min、提取溫度為40 ℃、NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%、超聲功率為300 W的條件下，考察液料比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1，g∶g，下同)對枳殼總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著液料比的增大，即提取溶劑用量的增加，枳殼總黃酮得率逐漸升高；當(dāng)液料比超過50∶1后，提取的枳殼總黃酮已達(dá)到飽和，總黃酮得率趨于穩(wěn)定。因此，選取50∶1作為正交實驗液料比的中心點。

圖3 液料比對枳殼總黃酮得率的影響Fig.3 Effect of liquid-solid ratio on yield of total flavonoids from Fructus Aurantii

2.3.2 提取時間對枳殼總黃酮得率的影響

在液料比為60∶1、提取溫度為40 ℃、NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%、超聲功率為300 W的條件下，考察提取時間(10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)對枳殼總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖4所示。

圖4 提取時間對枳殼總黃酮得率的影響Fig.4 Effect of extraction time on yield of total flavonoids from Fructus Aurantii

由圖4可知，隨著提取時間的延長，枳殼總黃酮得率逐漸升高；當(dāng)提取時間超過40 min后，提取的枳殼總黃酮已達(dá)到飽和，總黃酮得率趨于穩(wěn)定。因此，選取40 min作為正交實驗提取時間的中心點。

2.3.3 提取溫度對枳殼總黃酮得率的影響

在液料比為60∶1、提取時間為40 min、NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)為15%、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%、超聲功率為300 W的條件下，考察提取溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)對枳殼總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著提取溫度的升高，枳殼總黃酮得率呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)提取溫度為60 ℃時，總黃酮得率達(dá)到最高，為65.96 mg·g-1；繼續(xù)升高提取溫度至70 ℃后，總黃酮得率急劇下降?？赡苁怯捎冢崛囟壬?，黃酮分子擴散加快，總黃酮得率升高；但提取溫度過高會導(dǎo)致黃酮氧化分解，總黃酮得率下降。因此，選取60 ℃作為正交實驗提取溫度的中心點。

圖5 提取溫度對枳殼總黃酮得率的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on yield of total flavonoids from Fructus Aurantii

2.3.4 NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)對枳殼總黃酮得率的影響

在液料比為60∶1、提取時間為40 min、提取溫度為60 ℃、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%、超聲功率為300 W的條件下，考察NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)(17%、19%、21%、23%、25%)對枳殼總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖6所示。

圖6 NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)對枳殼總黃酮得率的影響Fig.6 Effect of mass fraction of NaH2PO4·2H2O on yield of total flavonoids from Fructus Aurantii

由圖6可知，隨著NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，枳殼總黃酮得率呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23%時，總黃酮得率達(dá)到最高，為66.75 mg·g-1；繼續(xù)增大NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)，總黃酮得率下降?？赡苁且驗?，隨著NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，下相與水的結(jié)合能力更強，使得上相體積減小，間接使丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，溶劑萃取能力增強，總黃酮得率升高;但隨著上相體積越來越小，減少了總黃酮在上相的容納量，造成總黃酮得率下降。因此，選擇23%作為正交實驗NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)的中心點。

2.3.5 丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)對枳殼總黃酮得率的影響

在液料比為60∶1、提取時間為40 min、提取溫度為60 ℃、NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23%、超聲功率為300 W的條件下，考察丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)(25%、30%、35%、40%、45%)對枳殼總黃酮得率的影響，結(jié)果如圖7所示。

圖7 丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)對枳殼總黃酮得率的影響Fig.7 Effect of mass fraction of acetone on yield of total flavonoids from Fructus Aurantii

由圖7可知，隨著丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增大，枳殼總黃酮得率呈先升高后降低的趨勢，當(dāng)丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%時，總黃酮得率達(dá)到最高；繼續(xù)增大丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)，總黃酮得率下降?？赡苁且驗?，丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)增大，丙酮與下相爭奪水分子使得上相體積增大，但是黃酮已經(jīng)被完全萃取，體積增大導(dǎo)致總黃酮得率下降。因此，選擇40%作為正交實驗丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)的中心點。

2.4 正交實驗結(jié)果

正交實驗的因素與水平見表2，設(shè)計與結(jié)果見表3。

表2 正交實驗的因素與水平

由表3可知，各因素對枳殼總黃酮得率影響的大小順序為A>C>E>B>D，即液料比>提取溫度>丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)>提取時間>NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)，最佳提取條件組合為A3B3C3D3E3，即液料比60∶1、提取時間50 min、提取溫度70 ℃、NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)45%， 由于該條件不在正交實驗的18次實驗中，因此需進(jìn)一步驗證。

表3 正交實驗設(shè)計與結(jié)果

正交實驗的方差分析見表4。

表4 正交實驗的方差分析

由表4中F值可知，各因素對枳殼總黃酮得率影響的大小順序為A>C>E>B>D，即液料比>提取溫度>丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)>提取時間>NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)，與表3極差分析結(jié)果一致。液料比、提取溫度、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)對總黃酮得率影響顯著(P<0.05)，提取時間、NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)對總黃酮得率影響不顯著(P>0.05)。由于NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)對總黃酮得率無顯著影響，其濃度過高會降低總黃酮得率，所以選擇NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)為23%。確定最佳提取工藝為：液料比60∶1、提取時間50 min、提取溫度70 ℃、NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)23%、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)45%。

在最佳提取工藝下進(jìn)行3次驗證實驗，測得枳殼總黃酮得率分別為76.63 mg·g-1、75.41 mg·g-1、75.65 mg·g-1，平均得率為75.90 mg·g-1，高于預(yù)測值，說明正交實驗優(yōu)化的提取工藝可行。

2.5 枳殼總黃酮的抗氧化活性

2.5.1 枳殼總黃酮對DPPH自由基的清除率(圖8)

圖8 枳殼總黃酮對DPPH自由基的清除率Fig.8 Scavenging rate of DPPH free radicals by total flavonoids from Fructus Aurantii

由圖8可知，枳殼總黃酮對DPPH自由基的清除能力隨著濃度的增加而增強，當(dāng)濃度從10 μg·mL-1增至800 μg·mL-1時，DPPH自由基清除率由27.70%升至98.57%； 在濃度為800 μg·mL-1時，枳殼總黃酮對DPPH自由基的清除能力與VC相當(dāng)；枳殼總黃酮、VC對DPPH自由基的IC50值分別為48.96 μg·mL-1、3.51 μg·mL-1。

2.5.2 枳殼總黃酮對ABTS自由基的清除率(圖9)

圖9 枳殼總黃酮對ABTS自由基的清除率Fig.9 Scavenging rate of ABTS free radicals by total flavonoids from Fructus Aurantii

由圖9可知，枳殼總黃酮對ABTS自由基的清除能力隨著濃度的增加而增強；當(dāng)濃度從10 μg·mL-1增至3 000 μg·mL-1時，ABTS自由基清除率由13.55%升至98.40%；枳殼總黃酮、VC對ABTS自由基的IC50值分別為207.71 μg·mL-1、62.08 μg·mL-1。

3 結(jié)論

采用超聲輔助丙酮/NaH2PO4·2H2O雙水相體系提取枳殼總黃酮，通過單因素實驗和正交實驗確定最佳提取工藝為：液料比60∶1(g∶g)、提取時間50 min、提取溫度70 ℃、NaH2PO4·2H2O質(zhì)量分?jǐn)?shù)23%、丙酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)45%，在此條件下，枳殼總黃酮得率為75.90 mg·g-1。與傳統(tǒng)乙醇回流提取法相比，雙水相提取法縮短了提取時間，而且在雙水相萃取過程中，大多數(shù)黃酮類物質(zhì)富集于上相，而糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)富集于下相，提高了枳殼總黃酮的提取效率和純度。體外抗氧化活性實驗結(jié)果表明，枳殼總黃酮具有一定的抗氧化活性，濃度為800 μg·mL-1時，其對DPPH自由基的清除率為98.57%，IC50值為48.96 μg·mL-1；濃度為3 000 μg·mL-1時，其對ABTS自由基的清除率為98.40%，IC50值為207.71 μg·mL-1；且在一定濃度范圍內(nèi)，其抗氧化活性與總黃酮濃度呈正相關(guān)。