田 影，張愛清

(中南民族大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430074)

納米材料用于腫瘤治療在過去幾十年獲得了巨大的成功[1-3]。光熱治療(PTT)是一種很有潛力的腫瘤治療方法，利用納米材料吸收光能轉(zhuǎn)化為熱能，致使腫瘤細(xì)胞死亡，具有非侵襲性、高可控性等優(yōu)點(diǎn)，備受研究者關(guān)注[4-6]。由于納米材料在腫瘤中的富集是動(dòng)態(tài)的，且合適的腫瘤治療溫度窗口較小，很容易造成光熱治療腫瘤部位溫度過高，導(dǎo)致周圍正常組織受損[7-8]。另外，光熱治療溫度過高容易引起活性氧含量升高，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，甚至腫瘤轉(zhuǎn)移。因此，清除光熱治療誘導(dǎo)的活性氧對(duì)腫瘤治療的良好預(yù)后具有重大意義。

作者通過原位還原氯鉑酸制備鉑點(diǎn)綴的聚多巴胺納米粒子(PDA/Pt NPs)，對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并對(duì)PDA/Pt NPs的光熱性能、抗氧化性能及抗腫瘤性能進(jìn)行研究，為探究納米材料用于腫瘤的光熱治療提供新的思路。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與試劑

胎牛血清、1640培養(yǎng)基、MTT，Invitrogen公司。

氯鉑酸、鹽酸多巴胺、三羥甲基氨基甲烷(Tris)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2′,7′-二氯二氫熒光素雙乙酸酯(DCFH-DA)、Calcein-AM、碘化吡啶(PI)，碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 PDA納米粒子(PDA NPs)的制備

PDA NPs通過經(jīng)典的St?ber法制備。將60 mg Tris溶解于50 mL去離子水中，加入10 mL異丙醇，磁力攪拌15 min，混合均勻。將30 mg鹽酸多巴胺用1 mL去離子水溶解，加入到Tris+異丙醇混合溶液中，繼續(xù)攪拌24 h，離心洗滌,得到PDA NPs。

1.3 PDA/Pt納米粒子(PDA/Pt NPs)的制備

配制2.5 mg·mL-1聚乙烯吡咯烷酮乙醇溶液30 mL，加入3 mg PDA NPs，磁力攪拌，混合均勻；繼續(xù)加入0.3 mL 120 mmol·L-1氯鉑酸溶液，80 ℃回流24 h，離心洗滌，得到PDA/Pt NPs。

1.4 PDA/Pt NPs的光熱性能研究

配制不同濃度(50、100、200，μg·mL-1)的PDA NPs、PDA/Pt NPs水溶液，以去離子水為空白對(duì)照，在808 nm激光照射(1.5 W·cm-2，5 min)下，用熱成像儀(FLIR ONE)監(jiān)測(cè)溶液溫度，每隔30 s記錄溶液溫度變化。

1.5 PDA/Pt NPs的抗氧化性能研究

用H2O2作為模式活性氧，用PDA/Pt NPs催化H2O2分解產(chǎn)生氧氣，通過檢測(cè)溶氧量變化研究PDA/Pt NPs的抗氧化性能。將30 mL濃度為200 μg·mL-1的PDA/Pt NPs水溶液加入50 mL試管中，加入10 mmol·L-1H2O2溶液，觀察氣泡產(chǎn)生情況，用溶氧儀檢測(cè)溶氧量。

1.6 PDA/Pt NPs的體外抗腫瘤性能研究

首先，通過細(xì)胞活死染色法研究PDA/Pt NPs的細(xì)胞毒性。在6孔板中接種小鼠乳腺癌細(xì)胞(4T1)，培養(yǎng)24 h，加入濃度為100 μg·mL-1的PDA/Pt NPs水溶液，共培養(yǎng)4 h后，用808 nm激光照射(1.5 W·cm-2，8 min)；繼續(xù)培養(yǎng)6 h，吸棄培養(yǎng)基，用Calcein-AM和PI染色，在倒置熒光顯微鏡下觀察綠色和紅色熒光。

其次，通過MTT法研究PDA/Pt NPs的細(xì)胞毒性。在96孔板中接種4T1細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，加入不同濃度(0、12.5、25、50、100、200，μg·mL-1)的PDA/Pt NPs水溶液，共培養(yǎng)4 h后，用808 nm激光照射(1.5 W·cm-2，8 min)；繼續(xù)培養(yǎng)24 h，加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜，用酶標(biāo)儀檢測(cè)572 nm處的紫外吸收。

1.7 PDA/Pt NPs的體內(nèi)抗腫瘤性能研究

在BALB/c小鼠背部右腿跟處皮下注射100 μL約1×106個(gè)4T1細(xì)胞，構(gòu)建小鼠皮下移植腫瘤模型。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到約100 mm3后，隨機(jī)分成4組：PBS、PDA NPs+L(激光照射)、PDA/Pt NPs、PDA/Pt NPs+L，每組5只小鼠，通過尾靜脈分別注射相應(yīng)藥物(1 mg·mL-1，200 μL)。注射藥物1 h后，PDA NPs+L和PDA/Pt NPs+L組用808 nm激光照射(1.5 W·cm-2，8 min)腫瘤部位。每隔1 d測(cè)量腫瘤體積和小鼠體重。注射藥物21 d后，處死小鼠，收集腫瘤組織，拍照，并用4%多聚甲醛固定，用于腫瘤組織切片和H & E染色。

2 結(jié)果與討論

2.1 PDA/Pt NPs的結(jié)構(gòu)表征

PDA/Pt NPs的掃描電子顯微鏡(SEM)照片、透射電子顯微鏡(TEM)照片及PDA NPs、PDA/Pt NPs的水合粒徑見圖1。

圖1 PDA/Pt NPs的SEM照片(a)、TEM照片(b)和局部放大照片(c)及PDA NPs、PDA/Pt NPs的水合粒徑(d)Fig.1 SEM image(a),TEM image(b),and locally amplified image(c) of PDA/Pt NPs,and hydrated particle size of PDA NPs and PDA/Pt NPs(d)

由圖1a可知，PDA/Pt NPs為單分散的球形結(jié)構(gòu)，平均直徑約為150 nm，沒有明顯的結(jié)塊。由圖1b可知，PDA/Pt NPs由PDA NPs原位還原氯鉑酸制備成功，Pt NPs點(diǎn)綴在PDA NPs上。由圖1c可知，Pt NPs直徑約為3 nm。通過動(dòng)態(tài)光散射(DLS)檢測(cè)，PDA NPs的平均水合粒徑(Dh)約為161 nm，粒度分布(PDI)約為0.023；而PDA/Pt NPs的平均水合粒徑約為200 nm(圖1d)，納米顆粒的粒度分布略有增加，表明制備的PDA NPs和PDA/Pt NPs粒徑較為均勻。

PDA NPs和PDA/Pt NPs的Zeta電位和紫外吸收光譜見圖2。

圖2 PDA NPs和PDA/Pt NPs的Zeta電位(a)和紫外吸收光譜(b)Fig.2 Zeta potential(a) and UV absorption spectra(b) of PDA NPs and PDA/Pt NPs

由圖2a可知，PDA NPs和PDA/Pt NPs顯示出相似的負(fù)Zeta電位，因?yàn)镻DA/Pt NPs表面仍有很多類似多酚的基團(tuán)，這與PDA NPs的基團(tuán)相似。由圖2b可知，PDA NPs和PDA/Pt NPs有相似的紫外吸收光譜，在近紅外光區(qū)808 nm處有較高的紫外吸收，表明PDA/Pt NPs具有光熱效應(yīng)的潛能。

2.2 PDA/Pt NPs的光熱性能(圖3)

圖3 PDA NPs和PDA/Pt NPs的光熱性能

由圖3a可知，PDA NPs水溶液隨著光照時(shí)間的延長溫度快速上升，且隨著PDA NPs水溶液濃度的增加，溫度上升速度越快。PDA/Pt NPs水溶液也顯示出與PDA NPs水溶液類似的光熱效應(yīng)(圖3b)，表明PDA/Pt NPs水溶液的光熱效應(yīng)同樣受其濃度和光照時(shí)間的影響。相比之下，空白對(duì)照組的溫度在光照600 s后出現(xiàn)了約0.5 ℃的微弱升高。表明，PDA/Pt NPs可以快速有效地將808 nm近紅外光能量轉(zhuǎn)化為熱能。

2.3 PDA/Pt NPs的抗氧化性能

PDA/Pt NPs催化H2O2分解產(chǎn)生氧氣的結(jié)果見圖4。

由圖4a可知，PDA/Pt NPs可以迅速催化H2O2分解產(chǎn)生肉眼可見的氣泡。利用溶氧儀檢測(cè)到PDA/Pt NPs水溶液中確實(shí)產(chǎn)生了氧氣，且溶氧量在2 min內(nèi)迅速增加，2 min后，隨光照時(shí)間的延長，溶氧量增加緩慢(圖4b)。

(a)產(chǎn)生氣泡照片 (b)溶氧量變化

2.4 PDA/Pt NPs的體外抗腫瘤性能(圖5)

由圖5a可知，當(dāng)用PBS、PDA/Pt NPs處理4T1細(xì)胞時(shí)，有大量的綠色熒光(圖中淺灰色區(qū))出現(xiàn)，表明PBS或PDA/Pt NPs對(duì)細(xì)胞沒有毒性。相比之下，當(dāng)用PDA NPs+L、PDA/Pt NPs+L處理4T1細(xì)胞時(shí)，有大量的紅色熒光(圖中淺灰色區(qū))出現(xiàn)，表明PDA NPs或PDA/Pt NPs在808 nm激光照射下能夠殺死腫瘤細(xì)胞。由圖5b可知，PBS和PDA/Pt NPs對(duì)4T1細(xì)胞沒有明顯的毒性；在808 nm激光照射下，隨著PDA NPs和PDA/Pt NPs濃度的增加，對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性增強(qiáng)。表明，PDA/Pt NPs在808 nm激光照射下有較好的體外光熱抗腫瘤效果。

圖5 細(xì)胞活死染色法(a)和MTT法(b)研究PDA/Pt NPs的體外抗腫瘤性能Fig.5 In vitro antitumor property of PDA/Pt NPs determined by staining of live and dead cells(a) and MTT assay(b)

2.5 PDA/Pt NPs的體內(nèi)抗腫瘤性能

小鼠的相對(duì)體重變化、腫瘤相對(duì)體積變化和實(shí)驗(yàn)結(jié)束后剝離出的腫瘤照片見圖6。

圖6 小鼠的相對(duì)體重變化(a)、腫瘤相對(duì)體積變化(b)和腫瘤照片(c)

由圖6a可知，在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)，所有組中小鼠的體重均沒有發(fā)生十分明顯的變化。由6b可知，PBS、PDA/Pt NPs組的腫瘤體積隨著時(shí)間延長快速增大，而PDA NPs+L、PDA/Pt NPs+L組的腫瘤體積前期略有增大，后期逐漸減小，表明在808 nm激光照射下，PDA NPs+L、PDA/Pt NPs+L組的腫瘤細(xì)胞生長明顯受到了抑制，且在實(shí)驗(yàn)期間沒有明顯再增大。由圖6c可知，PDA NPs+L、PDA/Pt NPs+L組的腫瘤體積明顯減小，甚至有腫瘤完全消融。表明在808 nm激光照射下，PDA/Pt NPs具有較好的體內(nèi)抗腫瘤性能。

腫瘤組織切片的H & E染色照片見圖7。

圖7 腫瘤組織切片的H & E染色照片

由圖7可知，PDA NPs+L、PDA/Pt NPs+L組的腫瘤細(xì)胞明顯破碎，顯示出良好的光動(dòng)力學(xué)治療腫瘤效果。另外，PDA NPs+L組的H & E切片看到很多深色小點(diǎn)，這是發(fā)生了炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致了免疫細(xì)胞在腫瘤處富集；而PDA/Pt NPs+L組的H & E切片只有少量的深色小點(diǎn)，說明沒有發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，PDA/Pt NPs的抗氧化性能減少了過高熱引起的炎癥反應(yīng)，有利于良好的腫瘤預(yù)后。表明，PDA/Pt NPs在近紅外光照射下有良好的光動(dòng)力學(xué)治療腫瘤效果，且沒有引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。

3 結(jié)論

通過原位還原氯鉑酸制備鉑點(diǎn)綴的聚多巴胺納米粒子(PDA/Pt NPs)，PDA/Pt NPs為單分散的球形結(jié)構(gòu)，直徑約為150 nm，粒徑均勻，具有光熱性能和抗氧化性能。PDA/Pt NPs在808 nm激光照射下，對(duì)小鼠乳腺癌細(xì)胞(4T1)具有明顯的抑制作用，實(shí)現(xiàn)了腫瘤的光熱治療，并減少了過高熱引起的炎癥反應(yīng)，有利于良好的腫瘤預(yù)后。該研究巧妙地結(jié)合了PDA/Pt NPs的抗氧化和抗腫瘤性能，為納米材料用于腫瘤的光熱治療提供了新的思路。