曾婉嘉 吳昱 陳香梅 魯鳳民

作者單位：100191 北京大學基礎醫(yī)學院病原生物學系暨感染病中心(曾婉嘉，吳昱，陳香梅，魯鳳民)；北京大學人民醫(yī)院肝病研究所

肝臟是重要的代謝器官，不僅在碳水化合物、脂質及蛋白質代謝中起關鍵作用，同時可以將各類營養(yǎng)物質轉化為身體必需物質，并承擔血液的過濾、凈化及解毒等重要功能。肝功能障礙會導致肝臟特異性和全身性疾病，其中遺傳性代謝病多為單基因突變引起的常染色體隱性遺傳病，部分可采用酶替代療法，但其應用范圍較小，容易產(chǎn)生中和抗體。而某些疾病只能通過肝移植進行治療，存在肝臟來源少且需要術后長期監(jiān)護等問題；病毒性肝炎引起的肝纖維化、肝硬化及肝細胞癌等也是重要的肝臟相關死亡原因，其中慢性乙型肝炎(CHB)尚缺乏有效的治愈藥物，且患者發(fā)展為終末期肝病的風險較高。因此，亟需新型的靶向肝臟的治療方式予患者更多選擇。

由于肝臟具有大量分泌蛋白的功能和運輸潛力，同時也是遺傳載體在體內遞送時主要富集的場所之一，因此成為當前基因治療技術的理想靶器官。傳統(tǒng)的基因治療多采用腺病毒載體(AAV)進行基因補充，但存在循環(huán)中和抗體等潛在問題。近年來，治療性RNA及基因編輯技術已成為一類新的治療手段，在很多臨床試驗中都獲得了令人鼓舞的結果，同時也在肝臟疾病中開展了相關研究，但還有很多問題函待解決[1]。本文主要探討了近期包括信使RNA(mRNA)遞送、小分子干擾RNA(siRNA)和反義寡核苷酸(ASO)在內的RNA療法，以及不同基因編輯策略的臨床研究最新進展，這些研究為發(fā)病率高且選擇有限的罕見遺傳代謝病和難以治愈的慢性肝病的治療提供了新的方向。

一、RNA治療

RNA除了具有攜帶肽鏈編碼信息的作用以外，在調節(jié)基因表達、剪接其他RNA和運送氨基酸構建蛋白質等方面也發(fā)揮著重要功能?，F(xiàn)有的RNA治療方案基于其生物特性研發(fā)，大致可分為三類：遞送mRNA表達目的蛋白、RNA干擾(RNAi)技術靶向沉默mRNA和RNA適配體靶向調節(jié)目的蛋白，現(xiàn)主要介紹mRNA遞送及RNAi療法的基本原理及臨床應用現(xiàn)狀。

(一)mRNA遞送 mRNA作為帶有負電荷的大分子無法自由穿過細胞膜，而真核細胞內吞的mRNA通常積累在溶酶體中無法進行翻譯。因此，為了避免mRNA被內環(huán)境中的核糖核酸酶降解，并促進其進入靶細胞的胞漿進行翻譯，形成具有治愈功能的目的蛋白，具有保護作用和定向運送功能的遞送載體不可或缺[1]，如脂質納米顆粒(LNPs)及細胞外囊泡等。 LNPs是目前發(fā)展最成熟的遞送手段之一，可用于遞送mRNA、siRNA、DNA及基因編輯復合物等，通常由四部分構成：可電離陽離子脂類、磷脂(多為磷脂酰膽堿)、膽固醇和聚乙二醇脂[2]?？呻婋x陽離子的脂類具有在酸性條件下質子化而在中性條件下呈電中性的特點，有利于在體外酸性條件下包裝核酸，并促進LNPs與肝細胞的酸性內體膜融合從而釋放內容物。此外，電中性的狀態(tài)可以防止靜脈給藥時誘發(fā)免疫反應，同時也能提高向肝細胞遞送的效率[3]。磷脂是LNPs結構的基本骨架，與膽固醇一同被稱為輔助脂，具有穩(wěn)定LNPs結構的作用，也有研究證明，輔助脂成分的修飾能起到增加遞送效率或改變細胞靶向的作用[4]。聚乙二醇脂在避免LNPs早期被吞噬細胞捕獲方面發(fā)揮了重要作用，故被稱為隱形脂，同時還與LNPs的大小和體內循環(huán)的半衰期相關[5]。除LNPs外，細胞外囊泡也可遞送核酸、氨基酸以及蛋白質等，其作為天然囊泡相對于LNPs具有更好的生物相容性和更低的免疫原性。此外，不同細胞來源的細胞外囊泡具有異質性，并展現(xiàn)出獨特的功能，如來自血細胞的細胞外囊泡具有穿越血腦屏障的功能，而來自骨髓間充質干細胞的細胞外囊泡呈現(xiàn)出抗炎和旁分泌特性。細胞外囊泡的這些特點使其具有靶向運輸和重復給藥的潛力，但目前在細胞外囊泡的分離提純和裝載效率方面還需要進一步優(yōu)化[6]。

許多遺傳性肝臟代謝病均源于基因突變導致的蛋白質功能異常，如人線粒體甲基丙二酰輔酶A變位酶(hMUT)缺乏或功能缺陷可引起甲基丙二酸血癥(MMA)，而葡萄糖6-磷酸酶(G6Pase-α)缺乏則會導致糖原貯積癥1a(GSD1a)。有研究在MMA小鼠模型中遞送hMUT mRNA進行治療，成功地在小鼠肝臟內檢測到了具有酶活性的hMUT蛋白，顯著改善了重癥MMA小鼠的生存和生長情況，同時血清中甲基丙二酸含量降低，但仍高于野生對照組[7]。另一項利用裝載人G6PC mRNA的LNPs治療G6Pase-α基因敲除小鼠的實驗也觀察到了類似結果，即治療組小鼠在禁食后血糖相較未治療組顯著升高，但仍未完全達到野生小鼠水平[8]。目前利用mRNA治療MMA(NCT04899310)的 I/II期臨床實驗已在進行中，治療GSD1a的項目(NCT05095727，尚未招募)也計劃評估成年患者靜脈注射MTX-LNP-hG6Pase mRNA的安全性、耐受性和有效性。

(二)RNAi治療 RNAi技術的策略是靶向沉默致病基因或病毒基因組來實現(xiàn)治療目的，包括siRNA及ASO等療法。siRNA源自秀麗隱桿線蟲，是一種含有20～25個核苷酸的雙鏈非編碼RNA，其在細胞質中可與RNase III 核酸內切酶、Argonaute蛋白和RNA結合蛋白相互作用并去除過客鏈，隨后產(chǎn)生成熟的RNA誘導沉默復合體(RISC)。而RISC可結合與siRNA引導鏈互補的靶mRNA，并通過Argonaute蛋白誘導mRNA降解、mRNA polyA尾去腺苷酸化直接抑制翻譯等多種機制實現(xiàn)基因沉默。將siRNA靶向遞送至肝細胞最常用的修飾手段是耦聯(lián)N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)，其高度特異性能最大限度地減少全身性siRNA暴露，減少輸注反應并延長給藥間隔[9]，目前已有多種siRNA藥物進入臨床試驗階段。近期，Vir Biotechnology公司宣布了VIR-2218的最新試驗結果，在接受最高劑量組合療法48周后，有30.8%的CHB患者體內檢測不到乙型肝炎表面抗原(HBsAg)，并伴有抗-HBs血清轉換，提示宿主長期暴露于高水平病毒抗原時的免疫抑制微環(huán)境可被siRNA部分逆轉。至于該系統(tǒng)的療效是否持久，停藥后是否會反彈等問題還有待后續(xù)的臨床試驗進行探究[10]。

ASO是長度為15～25個核苷酸的單鏈核酸聚合物，可以不依賴遞送系統(tǒng)而是通過受體介導的途徑進入肝細胞，它不需形成復合體即可單獨通過互補核苷酸與目標mRNA結合，經(jīng)由RNAse-H介導剪切目標mRNA或抑制5’帽形成并阻斷核糖體亞基附著來發(fā)揮沉默功能。由于ASO在細胞質中積累，其相對于積累在細胞內體中的siRNA需要更頻繁且大劑量地給藥。另外，盡管遞送載體對ASO并非必需，但結合GalNAc后可增強肝細胞靶向性，并減少全身性暴露[9]。Bepirovisen是一種用于治療CHB的ASO類藥物，其靶向位點為HBV X蛋白開放閱讀框的中段，因此具有靶向所有HBV RNA的能力。近期公布的一項包含了457例樣本的IIb期臨床研究結果表明，持續(xù)使用Bepirovisen治療24周后，9%～10%的CHB患者在接下來長達24周的時間內HBsAg和HBV DNA均低于檢測下限[11]。此前的研究顯示，接受Bepirovisen治療的CHB患者出現(xiàn)了血清ALT的一過性升高，提示可能存在免疫激活并清除感染肝細胞的過程[12]。

二、基因編輯技術

基因組編輯技術依賴于基因組序列的靶向和特異性修飾，可分為無核酸酶和核酸酶引導兩類。前者的原理是基于與靶標區(qū)同源的長DNA序列，通過同源重組引入所需的編輯，特異性和安全性均較好，但是編輯效率通常較低；后者則是利用核酸酶在靶標區(qū)誘導DNA雙鏈或單鏈斷裂，與前者相比編輯效率大大增加，但也可能出現(xiàn)在靶標外的基因組區(qū)域發(fā)生脫靶編輯的風險。轉錄激活物樣效應核酸酶(TALEN)、鋅指核酸酶(ZFN)及CRISPR/Cas系統(tǒng)等都是經(jīng)過了深入研究的基因編輯技術，可構建用于臨床前實驗的體外模型和動物模型，也可用于開發(fā)各種疾病的治療方法，目前應用最廣泛的是CRISPR/Cas9系統(tǒng)。

(一)基因插入及校正 現(xiàn)有的基因編輯技術可以通過治療基因的插入、基因校正及基因敲除等手段靶向治療肝臟疾病。將治療基因靶向插入白蛋白的基因座后，可利用肝臟中白蛋白啟動子的強大轉錄活性來治療因分泌型蛋白缺乏引起的遺傳性疾病，如血友病A、血友病B及黏多醣貯積癥。其中，GeneRide系統(tǒng)的原理是遞送攜帶治療性轉基因且側翼序列與白蛋白基因座3’端同源的重組AAV載體，從而誘導基因精準整合到白蛋白終止密碼子上游，并通過一個具有自切割功能的蛋白酶序列使得兩種蛋白分別產(chǎn)生。該方法可以避免核酸酶的非靶向修飾及AAV基因組的隨機整合，但是低編輯效率也限制了其應用范圍[13]?；诤怂崦傅幕蚓庉嬒到y(tǒng)具有靶向特定的DNA序列并發(fā)揮切割活性的功能，為了提高同源定向修復(HDR)率并改善治療效果，研究者將GeneRide系統(tǒng)與靶向插入位點的CRISPR/Cas9系統(tǒng)聯(lián)合，在先天性葡萄糖醛酸轉移酶缺乏癥小鼠模型中將編輯效率提高了20～50倍，給藥后小鼠的肝臟組織學、炎癥標志物和血漿白蛋白水平均正常，且預測部位未觀察到脫靶效應，進一步增加了其臨床應用潛能[14]。盡管HDR介導基因座插入的效率較低，但通常足以實現(xiàn)治療水平的蛋白分泌，且該策略在校正后的肝細胞具有生長優(yōu)勢時可以發(fā)揮較大的價值。同時，HDR還可用于編輯肝細胞基因組，以糾正致病突變，理想情況下可以實現(xiàn)無痕編輯，即將突變序列恢復成野生型序列。例如，α1-抗胰蛋白酶缺乏癥(AATD)可通過HDR校正突變基因，防止突變型α1-抗胰蛋白酶的積累，且校正后的肝細胞具有存活優(yōu)勢[15]。但是，鑒于當前的HDR系統(tǒng)編輯效率普遍偏低，相關研究多為概念驗證。

(二)基因敲除 基于核酸酶的基因編輯系統(tǒng)主要是通過在目標區(qū)域誘導DNA雙鏈斷裂，并在后續(xù)的非同源末端連接(NHEJ)修復過程中引入隨機的DNA插入或缺失(InDel)。這一機制可被用于引入編碼區(qū)的無義突變，編輯后的mRNA衰減最終會導致蛋白敲除。該系統(tǒng)已被用于底物還原療法，通過降低有毒代謝物的水平來治療因酶缺乏導致有毒代謝物積累的疾病，如抑制上游產(chǎn)生毒性代謝物的酶以治療原發(fā)性高草酸尿癥等代謝性疾病。有報道顯示，靶向草酸合成代謝途徑上游酶的AAV8-CRISPR/Cas9載體在小鼠體內給藥后可以有效抑制酶活性，防止草酸過度產(chǎn)生，使得肝臟中的草酸水平出現(xiàn)治療性降低，避免腎臟損傷[16]。除了靶向宿主基因，CRISPR/Cas9系統(tǒng)還可有效降解病毒基因組，如HBV的復制模板共價閉合環(huán)狀DNA(cccDNA)。有學者通過模擬微小RNA(miRNA)的生成過程，整合雙向導RNA(gRNA)介導的CRISPR/Cas9系統(tǒng)和RNAi技術，構建了gRNA-(miR-HBV)-gRNA三聯(lián)表達框架，不僅能高效破壞cccDNA，同時還可干擾病毒RNA的功能，從而促進HBV清除[17]。

(三)堿基編輯器 通過導入外源的修復模板，CRISPR/Cas9系統(tǒng)也可以實現(xiàn)HDR介導的精確編輯，但是由于編輯效率較低，其應用相對受限。Cas9蛋白的核酸酶切割活性來源于RuvC和HNH結構域，將這兩個保守的核酸內切酶結構域進行突變后可以得到無切割活性，但仍保留靶向功能的dCas9(dead Cas9)蛋白。DNA堿基編輯器就是利用CRISPR/dCas9系統(tǒng)聯(lián)合不同類型的脫氨酶實現(xiàn)堿基轉化，包括胞嘧啶堿基編輯器(CBE)和腺嘌呤堿基編輯器(ABE)，其中CBE可以完成胞嘧啶向胸腺嘧啶的轉換，而ABE則能實現(xiàn)腺嘌呤到鳥嘌呤的突變。 堿基編輯器在治療肝臟疾病中已有諸多應用，如編輯膽固醇相關基因及HBV基因組等。靶向編輯人前蛋白轉化酶枯草溶菌素9(hPCSK9)基因可以在肝臟特異性hPCSK9敲入小鼠中有效降低膽固醇水平，且與基因組編輯相比，堿基編輯更為精確，未發(fā)現(xiàn)脫靶編輯或染色體易位[18]。除了在肝臟代謝疾病中的應用，堿基編輯器同樣適用于靶向抑制病毒復制。此前，Beam Therapeutics公司在細胞水平利用胞嘧啶堿基編輯器在HBV基因組的多個位置引入終止密碼子，有效抑制了病毒復制的各項指標。近期，他們公布了最新的HBV感染小鼠體內實驗結果，利用LNP遞送的多重堿基器導致小鼠血清HBsAg水平下降超過2 log10 IU/mL，同時HBV DNA水平下降了3 log10拷貝/mL，且在停藥后沒有出現(xiàn)病毒學反彈，為CHB患者的功能性治愈帶來了希望[19]。

三、總結

基于mRNA和RNAi的療法以及各類基因編輯技術是近年來基因治療領域的重要突破，為不適用酶替代療法和無法接受肝移植的遺傳代謝病患者，以及缺乏有效治愈手段的慢性肝炎患者提供了更多可供選擇的治療方案。這些治療系統(tǒng)的有效性和安全性已在部分動物模型上得到驗證，但仍然需要更多的臨床試驗數(shù)據(jù)來進一步評估。如CRISPR/Cas9系統(tǒng)仍存在一些安全性問題，主要是脫靶編輯效應和針對Cas9蛋白的免疫反應[20]。未來通過采用經(jīng)改進后的高保真Cas9蛋白、優(yōu)化瞬時遞送系統(tǒng)如LNPs和細胞外囊泡等，將可以有效避免CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應和免疫原性[21-23]。相信隨著與基因編輯技術和RNA療法相關的研究不斷深入，這些技術未來一定會在臨床應用中發(fā)揮更大的價值。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。