黃詩雯 曾美惠

作者單位：363000 福建漳州 聯(lián)勤保障部隊(duì)第九〇九醫(yī)院(廈門大學(xué)附屬東南醫(yī)院)超聲科

HCC起病隱匿，早期臨床表征并不顯著，中晚期會(huì)伴有肝區(qū)疼痛、黃疸、發(fā)熱、乏力、納差、進(jìn)行性消瘦及自發(fā)性低血糖和紅細(xì)胞增多等表現(xiàn)[1-2]。與多數(shù)癌癥相似，其發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但可以明確的是惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程均離不開基因和蛋白的調(diào)控作用[3]。隨著醫(yī)療科技的發(fā)展，個(gè)體化藥物和靶向藥物治療已逐漸成為治療腫瘤患者的新方向。目前有與結(jié)腸癌相關(guān)的研究顯示，KRAS基因突變可致使其自身磷酸化，并長期處于激活狀態(tài)，導(dǎo)致KRAS基因突變患者對于抗表皮生長因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)藥物應(yīng)答不佳，且BRAF V600E突變的患者可能無法從EGFR藥物治療中取得較好的臨床效果[4-6]。美國國家綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(NCCN)明確提出，KRAS基因狀態(tài)對EGFR單抗靶向藥物的臨床療效預(yù)測價(jià)值較高，建議行常規(guī)檢測。索拉非尼是可有效延長肝癌患者生存時(shí)間的小分子多靶點(diǎn)藥物，可直接作用于CRAF和BRAF，延緩腫瘤進(jìn)展，但其總體治療有效率仍不十分理想[7]。

資料與方法

一、一般資料

納入2018年3月至2021年3月聯(lián)勤保障部隊(duì)第909醫(yī)院收治的原發(fā)性肝癌患者168例，根據(jù)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況將其分為肝癌伴肝外轉(zhuǎn)移患者組(n=63)和無肝外轉(zhuǎn)移組(n=105)。肝癌伴肝外轉(zhuǎn)移組年齡38～74歲，無肝外轉(zhuǎn)移組患者年齡35～73歲。兩組患者年齡、性別、AFP水平及有無手術(shù)和介入治療等資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。所有患者及其法定代理人均知曉該研究方案且簽署同意書，該方案通過醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

二、納排標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①原發(fā)性肝癌診斷參照《原發(fā)性肝癌的分層篩查與監(jiān)測指南(2020版)》[8]相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)；②入院前未接受過任何抗腫瘤治療；③均經(jīng)病理學(xué)明確診斷為原發(fā)性肝癌；④未合并其他惡性腫瘤。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)性肝癌；②合并其他惡性腫瘤；③合并重要臟器嚴(yán)重疾病者；④臨床資料不全者。

三、方法

KRAS基因突變檢測：分別采集兩組患者的外周血各10 mL，通過TAKARA基因提取試劑盒提取血液中的DNA，測量基因組DNA在260 nm波長時(shí)的A值。雙鏈DNA濃度=A260×樣品稀釋倍數(shù)×(50/1000)。應(yīng)用人類KRAS/NRAS基因突變聯(lián)合檢測試劑盒對KRAS基因突變情況進(jìn)行檢測。免疫組化檢測KRAS蛋白表達(dá)：將切片置于65℃烤箱中烘烤3 h，脫蠟、水化；PBS沖洗3次，3 min/次。抗原修復(fù)：加入氧化酶阻斷溶液(試劑A)，于室溫下孵育10 min；除去PBS，加入正常非免疫動(dòng)物血清(試劑B)，在室溫下孵育10min后，去除血清，滴加一抗，4℃過夜或室溫下孵育60 min。PBS沖洗3次，3 min/次；將PBS除去后，滴加二抗，室溫孵育10 min；PBS沖洗3次，每次3 min；將PBS除去后，滴加鏈霉菌抗生物素、過氧化酶溶液(試劑D)，孵育10 min，PBS沖洗3次，每次3 min；加入新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～10 min；經(jīng)自來水沖洗后，蘇木素復(fù)染10 min，PBS沖洗反藍(lán)20 min；梯度酒精脫水干燥，以中性樹膠封固，并分析結(jié)果。肝臟的彩色多普勒成像：使用彩超儀3.5 M探頭對整個(gè)肝臟及其周圍臟器的回聲進(jìn)行探測，記錄肝臟腫瘤直徑、結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)，并進(jìn)行血流分級。Ⅰ級：瘤體及周邊可見血流信號，血流信號呈稀疏星點(diǎn)狀；Ⅱ級：腫瘤體內(nèi)及其周邊線狀血流信號≥3條；Ⅲ級：瘤體內(nèi)及其周邊可見秘技彩色血流信號。并記錄肝臟血管內(nèi)侵襲情況和彩色血流特點(diǎn)，測定體內(nèi)血流阻力指數(shù)(RI)。

表1 兩組患者的一般資料對比

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、兩組患者的KRAS突變情況

168例肝癌患者中，36例患者發(fā)生KRAS基因突變，均為肝外轉(zhuǎn)移組患者，基因突變率為57.14%(36/63)，無肝外轉(zhuǎn)移組患者KRAS基因突變率為0，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=76.364，P<0.05)。

二、KRAS蛋白高表達(dá)與低表達(dá)患者的超聲特征比較

將36例KRAS基因突變的原發(fā)性肝癌患者根據(jù)KRAS蛋白表達(dá)水平再次分組，結(jié)果顯示，KRAS高表達(dá)組與KRAS低表達(dá)組對比，除腫瘤大小差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)外，腫瘤結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)、腫瘤包膜、血流分級Ⅲ級及血管侵襲等，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。見表2。

表2 KRAS高表達(dá)與低表達(dá)組超聲特征比較[例(%)]

三、KRAS蛋白表達(dá)和腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)與RI的關(guān)系

KRAS蛋白高表達(dá)組RI為1.36±0.14，高于KRAS蛋白低表達(dá)組的0.58±0.07，腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)≥2的14例患者RI為1.08±0.09，腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)為1個(gè)患者的RI為0.57±0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.725、21.897，P<0.05)。

四、 超聲特征參數(shù)與肝癌組織中KRAS蛋白表達(dá)水平的相關(guān)性分析

logstic二元回歸分析結(jié)果顯示，肝癌組織中KRAS蛋白的表達(dá)水平與腫瘤結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)、腫瘤包膜、血流分級、血管侵襲情況及RI等超聲參數(shù)均顯著相關(guān)。KRAS蛋白的表達(dá)水平越高，腫瘤的包膜形成減少，腫瘤結(jié)節(jié)個(gè)數(shù)越多，血管侵襲情況越嚴(yán)重，血流分級和RI值越高。見表3。

表3 超聲特征參數(shù)與肝癌組織中KRAS蛋白的表達(dá)水平的相關(guān)性分析

討 論

RAS基因是一種細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)蛋白類原癌基因，其表達(dá)蛋白位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，是一種GTP/GDP結(jié)合蛋白，在EGFR信號通路中具有重要的調(diào)控作用[9-11]。RAS蛋白可作為分子開關(guān)調(diào)控信號傳遞至細(xì)胞內(nèi)。目前已知與人類腫瘤相關(guān)的特征性RAS基因包含HRAS、NRAS和KRAS 3種。一旦基因發(fā)生突變，RAS會(huì)相應(yīng)的出現(xiàn)異?；罨?，繼而對細(xì)胞生長和生化過程起到促進(jìn)作用，引發(fā)腫瘤[12]。突變的RAS癌基因種類與腫瘤類型存在一定的聯(lián)系，如HRAS基因突變多見于泌尿系統(tǒng)腫瘤，NRAS基因突變在造血系統(tǒng)腫瘤中更為常見，KRAS基因突變則在結(jié)直腸癌、肺癌、胰腺癌及呼吸道腫瘤中更為常見。KRAS的肝臟特異性突變可直接引發(fā)肝細(xì)胞癌和肝內(nèi)膽管癌[13, 14]。且NCCN也明確指出，KRAS基因狀態(tài)可作為預(yù)測EGFR單抗靶向藥療效的良好指標(biāo)。KRAS基因突變雖可使抗EGFR藥物治療失去效果，但KRAS基因突變患者卻仍有從索拉非尼治療中取得臨床獲益的可能，因此，評估肝癌患者KRAS基因突變情況具有重要的意義。本研究168例肝癌患者中共檢出36例患者KRAS基因突變，伴肝外轉(zhuǎn)移組患者KRAS基因突變率高于無肝外轉(zhuǎn)移組患者，表明KRAS基因突變與肝癌伴肝外轉(zhuǎn)移顯著相關(guān)，與尹小蘭等[15]研究結(jié)論基本一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)，KRAS蛋白在腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)≥2個(gè)、腫瘤包膜(-)、血流分級Ⅲ級及血管侵襲情況(+)的患者中表達(dá)水平較腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)1個(gè)、腫瘤包膜(+)、血管侵襲情況(-)及血流分級Ⅰ、Ⅱ級的患者明顯偏高。有研究顯示，瘤體的超聲血流系數(shù)可能與腫瘤的部分基本生物學(xué)特征存在相關(guān)性[16]。研究發(fā)現(xiàn)肝癌組織中KRAS蛋白的表達(dá)水平與腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)、腫瘤包膜、血流分級、血管侵襲情況均顯著相關(guān)。KRAS蛋白的表達(dá)水平越高，腫瘤的包膜形成減少，腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)越多，血管侵襲情況越嚴(yán)重。表明KRAS基因可能參與了肝癌瘤體血管形成過程。

RI可用于評價(jià)動(dòng)脈血流阻力，不會(huì)受到測量方位及測量角度的影響，因此，其測量值可有效反映真實(shí)情況。本研究結(jié)果提示，肝腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)量越多，RI值也越高。分析其原因在于腫瘤的肝內(nèi)轉(zhuǎn)移增加，導(dǎo)致血供需求增加，進(jìn)而使得肝動(dòng)脈的血管直徑和最大流速也隨之升高，血管分支數(shù)量增加，走向異常，動(dòng)脈血流收縮和波動(dòng)性增強(qiáng)。由于腫瘤瘤體內(nèi)的供應(yīng)血管管壁無平滑肌，且彈性不佳，再加上腫瘤假包膜的破壞、門靜脈癌栓及動(dòng)靜脈瘺生成，導(dǎo)致腫瘤內(nèi)血管形成竇腔，舒張末期血流速度減慢，致使RI升高。本研究還發(fā)現(xiàn)RI值與KRAS基因表達(dá)顯著相關(guān)，KRAS基因表達(dá)水平隨RI值升高而增加。

綜上所述，發(fā)生KRAS基因突變的肝癌患者KRAS基因表達(dá)與其淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和多普勒超聲影像特征顯著相關(guān)，分析肝癌患者的KRAS基因突變情況聯(lián)合術(shù)前超聲多普勒超聲可有效提高臨床對肝癌的診斷效率，指導(dǎo)臨床選擇更為合理的治療方案。本研究仍存在一定的不足之處，如納入的患者樣本量較小，未在肝癌疾病治療前檢測KRAS基因突變情況，對其靶向治療的臨床價(jià)值加以明確，今后仍需進(jìn)一步擴(kuò)大化的中心試驗(yàn)深入探索。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。