史 杰,李炳梅,王永梅,高素敏
1 新鄉(xiāng)市畜產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗中心,河南新鄉(xiāng) 453003
2 利津縣現(xiàn)代畜牧業(yè)發(fā)展服務中心,山東東營 257000
霉菌是廣泛存在于自然界中的真菌,種類繁多。一些真菌,如曲霉菌、鐮刀菌和青霉菌等絲狀真菌在生長繁殖過程中遇到外界環(huán)境適宜的溫濕度條件,通過代謝產(chǎn)生霉菌毒素。霉菌毒素是一類低分子質(zhì)量次級代謝產(chǎn)物,具有致癌性、致毒性、致畸性。目前所知,有大約300 種真菌能夠產(chǎn)生有毒害的代謝產(chǎn)物,其中,黃曲霉菌素(Aflatoxin,AF)、伏馬菌素(Fumonisins,F(xiàn)B)、玉米赤霉烯酮菌素(Zearalenone,ZEN)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(Trichothecenes,DON)、T-2毒素、赭曲霉菌素A(Ochratoxin A,OTA)等是畜牧養(yǎng)殖業(yè)中危害最嚴重、最常見的霉菌毒素[1]。
飼料霉菌毒素污染是一個全球性的安全問題,全球每年約有25%的谷物受到已知霉菌毒素的污染,約有2%的農(nóng)作物因污染嚴重而失去營養(yǎng)及經(jīng)濟價值[2]。我國畜牧養(yǎng)殖業(yè)中霉菌毒素污染飼料程度也比較嚴重,新修訂的《GB13078—2017 飼料衛(wèi)生標準》將上述6 種霉菌毒素列入飼料和飼料原料監(jiān)測指標,作為判斷飼料衛(wèi)生標準。雷元培等[3]2020年,對國內(nèi)各省區(qū)域的玉米、玉米副產(chǎn)物、小麥及麩皮、雜粕和全價飼料樣品進行檢測,AFB1檢出率在87.05%~100.00%,ZEN的檢出率在82.79%~100%,DON的檢出率在87.44%~100%;玉米中AFB1污染最嚴重,玉米副產(chǎn)物中ZEN污染最為嚴重。與單胃動物相比,反芻動物的飼料及其原料種類多、來源廣泛。農(nóng)作物秸稈、籽粒玉米、小麥、高粱、稻谷、大麥等植物性飼料原料是奶牛的常規(guī)飼料原料,在種植、生長、收獲、加工和儲藏等過程中容易接觸多種霉菌和受到多種霉菌毒素的污染。奶牛采食霉變飼料后,肝腎器官、生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等均會受到霉菌毒素的損傷,奶牛的生產(chǎn)性能和乳品質(zhì)量也會下降。應用霉菌毒素脫毒技術(shù)解決霉菌毒素污染,降低其毒性是非常必要的。
AF是由黃曲霉菌、煙曲霉菌和寄生曲霉菌等菌株產(chǎn)生的一類理化特性和化學結(jié)構(gòu)相似的次級代謝產(chǎn)物。其化學結(jié)構(gòu)含一個氧雜萘鄰酮(香豆素)和一個雙呋喃環(huán),易溶于丙酮和甲醇、氯仿等有機溶劑,不溶于水,遇強堿溶液(pH值9~10)很快分解,但在中性和酸性溶液中比較穩(wěn)定;無嗅、無色、無味。AF主要有B1、B2、G1、G2、M1、M2和毒醇等20 多種類型[4]。不同的AF在紫外線下發(fā)出顏色不同的熒光,其中,AFB1和AFB2(B族AF)呈現(xiàn)藍色光,AFG1和AFG2(G族AF)呈現(xiàn)綠色光,AFM1和AFM2(M族AF)呈現(xiàn)藍紫色。在己發(fā)現(xiàn)的霉菌毒素中,AF的致癌性、致毒性、致突變性、致畸性均居首位[5]。1993年,AF被世界衛(wèi)生組織(WHO)癌癥研究機構(gòu)劃定為一類致癌物。其中,以AFB1的致癌性和毒性最強,對敏感動物的半致死量(LD50)為0. 294 mg/kg[6],因此,通常把AFB1作為檢測動物飼料和食品的主要指標。《GB13078—2017 飼料衛(wèi)生標準》規(guī)定:AFB1在“玉米加紅產(chǎn)品、花生餅”中的最高限量為≤50μg/kg,“其他植物性飼料原料”的最高限量≤30 μg/kg。高溫潮濕的環(huán)境下,AF主要污染玉米及其秸稈、花生秧、花生餅、豆類等飼料原料。
ZEN最早在赤霉病的玉米作物上發(fā)現(xiàn),是由木賊鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、雪腐鐮刀菌、燕麥鐮刀菌等產(chǎn)生的甾體霉菌毒素,是一種二羥基苯酸的內(nèi)脂結(jié)構(gòu),化學結(jié)構(gòu)式為C18H22O5,難溶于水,易溶于堿性溶液,耐120 ℃高溫。由于ZEN通過與雌激素受體(ER)競爭性的結(jié)合,使ER發(fā)生二聚化,進而激活雌激素反應元件產(chǎn)生擬雌激素效應,具有雌激素活性,可引起雌性畜禽發(fā)生雌性激素綜合征,因此,ZEN也是一種主要損害奶牛生殖系統(tǒng)的雌激素霉菌毒素。此外,ZEN還具有DNA損傷毒性、細胞凋亡毒性、免疫抑制毒性和氧化損害毒性等[7]。鐮刀菌主要存在于霉變的高粱、玉米、小麥和小米等谷物,在適宜的溫濕度下滋生?!禛B13078—2017飼料衛(wèi)生標準》中規(guī)定“玉米及其加工產(chǎn)品”最高限量為≤0.5 mg/kg,其他植物性飼料原料最高限量為≤1 mg/kg。
OTA是曲霉屬和青霉屬等產(chǎn)毒真菌的次生代謝產(chǎn)物,無色結(jié)晶化合物,其化學分子式為C20H18O6NCl,OTA不易降解,穩(wěn)定性強,難溶于水,易溶于有機溶劑,廣泛存在于飼料和飼料原料中,對畜禽肝腎、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)均有毒性、致癌、致畸和致突變等危害。異香豆素部分是OTA的主要毒性基團,苯丙氨酸部分的羧基和氯基是其毒性的主要原因[8]?!禛B13078—2017 飼料衛(wèi)生標準》中規(guī)定“谷物及其加工產(chǎn)品”和“配合飼料”的最高限量均為≤100 μg/kg。
DON化學名為3A,7A,15-三羥基-12,13-環(huán)氧單端孢霉-9-烯-8-酮,分子式為C15H20O6,屬單端孢霉烯族化合物,是黃色鐮刀菌、禾谷鐮刀菌、燕麥鐮刀菌等產(chǎn)毒真菌的次級代謝產(chǎn)物。DON是一種霉菌毒素,通常由鐮刀菌屬產(chǎn)生,并經(jīng)常在谷物中檢測到。該化合物在高濃度時表現(xiàn)出免疫抑制特性,在低濃度時表現(xiàn)出免疫刺激作用。這種霉菌毒素的其他作用包括下調(diào)參與蛋白質(zhì)合成、增殖、核糖體蛋白質(zhì)和線粒體的基因。《GB13078—2017 飼料衛(wèi)生標準》中規(guī)定DON“植物性飼料原料”最高限量為≤5 mg/kg和“其他精料補充料、配合飼料”的最高限量均為≤3 mg/kg。
T-2毒素是單端孢霉烯族毒素之一,主要由鐮孢菌屬等多種真菌,為白色針狀結(jié)晶物,易溶于甲醇、乙醇、丙醇等極性溶劑。T-2毒素具有強的細胞毒性,是A類單端孢霉烯族化合物中毒性最強的一種[9]?!禛B13078—2017 飼料衛(wèi)生標準》中規(guī)定T-2毒素在“植物性飼料原料”最高限量為≤0.5 mg/kg。
FB由輪狀鐮孢菌、串珠鐮刀菌、多譽鐮刀菌等其他鐮孢菌種產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,是一類由不同的多氫醇和丙三羧酸組成結(jié)構(gòu)類似的雙酯化合物[10]。已發(fā)現(xiàn)有11 種伏馬毒素,其中,F(xiàn)B1、FB2是污染玉米、小麥和高粱等農(nóng)作物最常見的兩種毒素,在天然污染的玉米中以FB1量最多,約占FB總量的70%[11]?!禛B13078—2017 飼料衛(wèi)生標準》中規(guī)定F(B1+B2)“玉米及其加工產(chǎn)品、青貯飼料等飼料原料”最高限量為≤60 mg/kg,反芻動物精料補充料最高限量為≤50 mg/kg。
奶牛飼料原料中的玉米、小麥、稻谷、作物秸稈、苜蓿等植物性飼料,從田間生長、收割到儲藏、加工各環(huán)節(jié)都存在AF的污染風險,并可以感染多種真菌菌株,產(chǎn)生多種霉菌毒素。而多種霉菌毒素通常會產(chǎn)生協(xié)同效應,從而對動物的免疫和健康造成更嚴重的毒性影響。一般來說,溫度、干旱、潮濕、蟲害、疾病等可以對植物造成物理損害或干擾植物生長的因素,都可能使作物更易受到AF污染。在氣候方面,干燥和高溫條件有利于AF污染的生長,而溫暖和潮濕條件有利于成熟后的污染。FB、ZEN、T-2、DON容易在田間侵入作物莖葉和籽實;大部分霉菌在溫度20~30 ℃、相對濕度70%~80%環(huán)境中生長滋生,如果儲藏環(huán)境高溫、潮濕和飼料含水量較高,飼料就會發(fā)生霉變。
霉菌毒素破壞飼料營養(yǎng)物質(zhì),降低其適口性,導致奶牛采食量下降以及出現(xiàn)消化機能和繁殖障礙,影響奶牛泌乳量和乳品質(zhì)。霉菌毒素對動物身體的毒性程度主要取決于毒素的類型、數(shù)量、暴露時間以及動物的健康狀況、性別、年齡、品種和其他因素。長期飼喂低濃度霉變飼料會導致奶牛慢性中毒,造成肝臟損傷,肝臟出血、病變,破壞免疫系統(tǒng),形成免疫抑制,而飼喂高濃度霉菌毒素則引起急性中毒甚至死亡。奶牛中毒早期的癥狀主要表現(xiàn)為食欲不振、嗜睡、消瘦、血尿、嘔吐、腹瀉。筆者曾解剖數(shù)例中毒死亡的奶牛,發(fā)現(xiàn)多處器官病變,肝臟腫大,外觀色澤發(fā)暗,表面布滿出血點;消化道糜爛出血,真胃內(nèi)淤血、水腫,黏膜大面積潰瘍糜爛,小腸黏膜腫大出血、粘連嚴重,與車玉媛等[12]的文獻報道一致。
當反芻動物攝入AF時,體內(nèi)細胞DNA和RNA合成并與酶相互作用的能力受到抑制[13]。AF通過破壞瘤胃微生物的生長和功能,降低了奶牛的生產(chǎn)性能[14]。AFB1具有基因毒性、免疫毒性、致畸、致癌、致突變等毒性作用。其毒性機制包括誘導氧化應激、細胞毒性和DNA損傷。ZEN是一種雌激素性鐮刀菌毒素,被歸類為植物雌激素或真菌雌激素。其化學結(jié)構(gòu)類似于天然雌激素,允許其與雌激素受體位點結(jié)合,導致雌激素性增強,因此,奶牛ZEN中毒最常導致生殖系統(tǒng)紊亂[15]。Coppock[16]研究發(fā)現(xiàn),小母牛采食含有1.5 mg /kg ZEN及1.0 mg /kg DON的玉米后,會在2~5 d內(nèi)頻繁發(fā)情,與卵巢周期不同步,母牛在懷孕的第2~3個月也會有行為發(fā)情,即特發(fā)性陰道炎。AF對公牛精子、受精能力和植入前胚胎發(fā)育也有負面影響。Komsky-Elbaz等[17]報道,AFB1降低了公牛的精子活力,降低質(zhì)膜完整性,同時也降低了精子的線粒體膜電位和DNA完整性。10 μM AFB1可能導致精子中345 個基因的差異表達,這些基因參與細胞途徑,如胚胎和胎盤發(fā)育、細胞周期、DNA修復、組蛋白修飾和信號通路;也可通過誘導活性氧(ROS)的過量產(chǎn)生,損害卵母細胞和胚胎的著床前發(fā)育[18]。AFM1是AFB1的羥基化代謝產(chǎn)物,可在奶牛食用污染飼料后在牛奶中檢出。由于AFM1的毒性作用,即使在低濃度下,AFM1也會導致致癌性、致突變性、遺傳毒性、致畸性和免疫抑制。哺乳期奶牛攝入受污染的飼料后,AFB1在肝臟中被部分代謝和生物轉(zhuǎn)化為AFM1,然后被排泄到牛奶中。由于其熱穩(wěn)定性,AFM1不能被普通食品加工程序降解或破壞。因此,牛奶及其乳制品中的AFM1殘留被視為嚴重的公共衛(wèi)生問題[19]。
在飼料中添加黏土礦物或礦物吸附劑是養(yǎng)殖場和飼料工業(yè)廣泛采用的處理霉變飼料的方法。礦物吸附劑作為一種非營養(yǎng)添加劑添加到動物飼料中,可以防止結(jié)塊形成(抗結(jié)塊劑和凝固劑),結(jié)合或減少霉菌毒素,提高動物的生產(chǎn)性能。礦物吸附劑包括膨潤土、沸石、蒙脫土和水合鋁硅酸鈉鈣鹽,由于其帶負電荷(比如沸石一種微孔鋁硅酸鹽,是帶負電荷的礦物質(zhì)之一,能像磁鐵一樣吸吸附帶正電荷的毒物,包括自由基、突變的細胞、重金屬及其他毒素)和表面積孔隙體積大、較強的膨脹能力和離子交換能力,且可以通過化學修飾進一步提高霉菌毒素的吸附能力,能夠結(jié)合或吸附霉菌毒素到它們的結(jié)構(gòu)空間、外表面和邊緣,以降低接觸霉菌毒素的風險,因此在畜牧生產(chǎn)中廣泛使用。然而,這些吸附劑也可能對動物造成不良影響,如飼糧中添加2.5%和5.0%蒙脫石的豬出現(xiàn)了肝臟組織學變化,包括腫脹、空泡和囊泡變性,且與對照組相比,抗氧化能力、谷胱甘肽過氧化物酶和平均日采食量均受到嚴重影響[20]。
酵母細胞壁(YCW)主要成分是碳水化合物,屬于一組低聚糖,主要包括β-葡聚糖和甘露寡糖(MOS)。據(jù)估計,YCW含有85%~90%的寡糖,相當于1,3-β-葡聚糖(30%~50%)、1,6-β-葡聚糖的分子(5%~10%)、甘露糖蛋白(30%~40%)和甲殼素(1.5%~6.0%),能夠與特定霉菌毒素(如AF、OTA和ZEN)發(fā)生吸附反應,改善畜禽腸道健康,提高生產(chǎn)性能[21]。
生物降解霉菌毒素是一種非??尚械娘暳蟽艋椒?。物理方法和化學方法在去除霉菌毒素的同時,也可以去除或破壞營養(yǎng)物質(zhì)。近年來,微生物降解技術(shù)因具有高效、低毒、特異性強、不損傷營養(yǎng)物質(zhì)的處理潛力,被廣泛應用于食品和飼料行業(yè)。Chen等[22]從自然發(fā)酵泡菜中分離篩選出的淀粉芽孢桿菌(WF2020)在37~45 ℃,pH為8.0環(huán)境下能有效降解1~8μg /mL的AFB1,由于淀粉芽孢桿菌(WF2020)具有合成活性化合物、缺乏毒力基因、對多種抗生素敏感等優(yōu)點,被認為是一種潛在的益生菌。Imade等[23]研究了山東玉米地分離的肺炎克雷伯菌GS7-1菌株在ZEN上的降解能力,發(fā)現(xiàn)ZEN去除率隨pH值的增加而增加;當pH值從5增加到8時,ZEN去除率從61.3%增加到100%;隨著培養(yǎng)時間的增加,ZEN在96 h時被完全降解,降解效果增加。肺炎克雷伯菌GS7-1降解ZEN的最低和最高溫度分別為28 ℃和60 ℃。此外,菌株GS7-1的發(fā)酵物上清液可以使ZEN含量降低100%。Zheng[24]從驢腸食糜中分離到一株具有較強OTA 解毒能力的糞產(chǎn)堿菌ANSA176,在37 ℃條件下,12 h內(nèi)可將97.43%的1 mg/mL OTA降解為赭曲霉毒素α(OTα),而OTα毒性僅為OTA的1/500。
化學脫毒方法主要有堿處理法、酸處理法、氨處理法及有機溶劑(如95%乙醇、90%乙酮等)處理法等,是在飼料中添加強酸、強堿或氧化劑使霉菌毒素轉(zhuǎn)化為無毒的物質(zhì)。例如,在室溫下用3~5 mol/L的鹽酸處理AF,可使其減少78.0%和99.6%,在氫氧化鈉溶液中則可以迅速水解生成溶于水的鄰位香豆素鈉鹽,進而水洗去除[25]?;瘜W脫毒方法效果比較明顯,但是其對飼料有腐蝕性,破壞營養(yǎng)成分,降低畜禽的適口性,因此,在實踐中應用較少,一般用于嚴重霉變難以脫毒的飼料。
霉菌毒素是奶牛養(yǎng)殖中威脅飼料安全、奶牛健康和乳品質(zhì)量的重要風險因子。目前我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)存在霉菌毒素污染飼料的情況比較嚴重,應重視這方面的綜合防控工作,在飼料及飼料原料生產(chǎn)、加工、飼喂等各環(huán)節(jié)預防霉變發(fā)生,應用脫霉技術(shù)最大程度減少霉菌毒素的危害。物理吸附法和生物脫毒法具有獨特的脫毒技術(shù)優(yōu)勢,前景廣闊,值得技術(shù)研究開發(fā)和推廣。