顧晟琳，夏亞文，徐 瓊

上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 200233

0 引言

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）屬于葡萄球菌屬，是革蘭氏陽(yáng)性菌，為一種常見的食源性致病微生物，可引發(fā)任何動(dòng)物的中毒和感染。據(jù)2017—2019年福建省預(yù)包裝食品中致病菌污染調(diào)查結(jié)果顯示，金黃色葡萄球菌在多種食品中被廣泛檢出，包括肉制品、調(diào)味品、速凍米面等[1]。此外，乳制品也是金黃色葡萄球菌常檢出的一大類食品類別[2～4]。

目前對(duì)于金黃色葡萄球菌的檢測(cè)有諸多新技術(shù)。如利用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Multiplex Polymerase chain Reaction，Multiplex PCR）方法，可同時(shí)檢測(cè)嬰幼兒配方奶粉中的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和克羅諾桿菌[5]；應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)可實(shí)現(xiàn)不同乳制品中金黃色葡萄球菌的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)[6]；基于流式細(xì)胞術(shù)（Flow Cytometry，F(xiàn)CM）可以建立快速檢測(cè)牛奶及奶粉中金黃色葡萄球菌的方法[7]；金納米粒子也可實(shí)現(xiàn)食源性金黃色葡萄球菌的檢測(cè)[8]。雖然上述的檢測(cè)方法比常規(guī)檢測(cè)方法更簡(jiǎn)便、快速，但是在國(guó)際能力驗(yàn)證和國(guó)內(nèi)盲樣考核工作中，依然主要采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)樣品中的金黃色葡萄球菌進(jìn)行定量驗(yàn)證[9，10]。

但目前已有多種因素，如稀釋液溫度[11]、試劑耗材、操作過(guò)程、儀器設(shè)備、人員及環(huán)境[12]、檢測(cè)使用的培養(yǎng)基[13]等均會(huì)對(duì)最終的傳統(tǒng)平板計(jì)數(shù)法的結(jié)果產(chǎn)生影響。因此對(duì)于金黃色葡萄球菌的平板計(jì)數(shù)法的不確定度研究，對(duì)于樣品中微生物數(shù)量的估算準(zhǔn)確性具有重要的意義。本文主要參考《GB 4789.10—2016食品微生物學(xué)檢測(cè) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》和《JJF 1059.1—2012測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》，探討了乳粉中金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)測(cè)定不確定度評(píng)定方法，以便為評(píng)價(jià)測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

氯化鈉（分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Baird-Parker平板，廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；血瓊脂平板、腦心浸出液肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、凍干血漿，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

MS6001S十分之一電子天平，梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司；SMI12生化培養(yǎng)箱，美國(guó)SHELLAB公司；LA2-6A1-E生物安全柜，新加坡ESCO公司；SX700高壓蒸汽滅菌鍋，日本TOMY公司。

1.3 試驗(yàn)方法

依據(jù)GB 4789.10—2016[14]第二法對(duì)質(zhì)控樣品進(jìn)行測(cè)定。主要流程簡(jiǎn)述如下：稱取質(zhì)控乳粉25.0 g，加入225 mL無(wú)菌生理鹽水中，混勻?yàn)?∶10樣品均液。對(duì)此樣品均液進(jìn)行10倍梯度稀釋，每次用移液管吸取1 mL上一個(gè)稀釋度的樣品均液，注入9 mL無(wú)菌生理鹽水中，振勻，選擇其中2～3 個(gè)連續(xù)適宜稀釋度的均液進(jìn)行后續(xù)加樣涂布操作。加樣時(shí)每個(gè)稀釋度的樣品勻液分別以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL（共計(jì)1 mL）接種3 塊Baird-Parker平板，然后均勻涂布整個(gè)平板。涂布后，將平板于生物安全柜中靜置10 min后翻轉(zhuǎn)，于（36±1）℃倒置培養(yǎng)24～48 h。選擇3 塊菌落總數(shù)合計(jì)在20～200 CFU之間的一個(gè)稀釋度的平板進(jìn)行典型的金黃色葡萄球菌菌落計(jì)數(shù)。由一位人員對(duì)同一質(zhì)控奶粉樣品進(jìn)行6 次重復(fù)定量試驗(yàn)。

2 結(jié)果和分析

2.1 不確定度的主要來(lái)源分析

根據(jù)GB 4789.10—2016中第二法平板計(jì)數(shù)法，分析不確定度來(lái)源有樣品的均勻性以及穩(wěn)定性、取樣體積以及重復(fù)性、稀釋體積、培養(yǎng)時(shí)間以及溫度、測(cè)試環(huán)境的條件、人員的操作過(guò)程以及計(jì)數(shù)差異等因素，主要分析樣液制備、稀釋、加樣體積以及重復(fù)性試驗(yàn)的不確定度，其他因素在此忽略。

2.1.1 樣液制備引入的不確定度（B類[15]）

檢測(cè)過(guò)程中使用的250 mL量筒、電子天平及檢測(cè)環(huán)境溫度變化的影響引入的不確定度，由檢驗(yàn)證書數(shù)據(jù)計(jì)算可得。

2.1.2 稀釋引入的不確定度（B類）

檢測(cè)過(guò)程中使用的1 mL和10 mL刻度移液管及檢測(cè)環(huán)境溫度變化的影響引入的不確定度，由檢驗(yàn)證書數(shù)據(jù)計(jì)算可得。

2.1.3 加樣體積引入的不確定度（B類）

檢測(cè)過(guò)程中使用的1 mL刻度移液管及檢測(cè)環(huán)境溫度變化的影響引入的不確定度，由檢驗(yàn)證書數(shù)據(jù)計(jì)算可得。

2.1.4 重復(fù)性試驗(yàn)引入的不確定度（A類）

主要是由樣品的重復(fù)測(cè)定造成的結(jié)果波動(dòng)所引入。

2.2 數(shù)學(xué)模型

依據(jù)GB 4789.10—2016中第二法，檢測(cè)金黃色葡萄球菌菌落數(shù)T值為式（1）

T-樣品中金黃色葡萄球菌菌落數(shù)；

A-某一稀釋度典型菌落的總數(shù)；

B-某一稀釋度血漿凝固酶陽(yáng)性的菌落數(shù)；

C-某一稀釋度用于血漿凝固酶試驗(yàn)的菌落數(shù)；

d-稀釋因子。

2.3 測(cè)量不確定度計(jì)算

2.3.1 樣液制備引起的不確定度Urel（制備）

（1）電子天平稱量值m稱的不確定度

在稱量25 g樣品，制備樣品勻液時(shí)使用電子天平引入的不確定度，來(lái)源為：①天平示值誤差：由檢定證書給出的允差為±0.5 g，按均勻分布考慮，②重復(fù)性：由檢定證書給出的允差為±0.5g，按均勻分布考慮，因此，

（2）250 mL量筒體積V量的不確定度

在量取225 mL生理鹽水，制備樣品勻液時(shí)使用量筒引入的不確定度，來(lái)源為：①體積：由檢定證書給出的允差為±0.25 mL，按均勻分布考慮：②溫度：溫度變化的范圍為±4 ℃，按均勻分布考慮：

（3）合成Urel（制備）

2.3.2 連續(xù)稀釋引起的不確定度Urel（稀釋）

在對(duì)樣品勻液進(jìn)行梯度稀釋時(shí)，一般是用無(wú)菌吸管吸取上級(jí)樣品均液1 mL，注入9 mL無(wú)菌生理鹽水的試管中，因此對(duì)于連續(xù)稀釋引起的不確定度Urel（稀釋）主要涉及1.0 mL刻度移液管體積V1和10 mL刻度移液管體積V2兩個(gè)方面。

（1）1.0 mL刻度移液管體積V1的不確定度

①體積：檢定證書提供的數(shù)值（1±0.01 mL）；

②溫度：溫度變化的范圍為±4 ℃；

近似于矩形分布

由1.0 mL刻度移液管體積V1引入的相對(duì)不確定度為：

（2）10 mL刻度移液管體積V2的不確定度

①體積：由檢定證書給出的允差為±0.014 mL；

按均勻分布考慮：

由10 mL刻度移液管體積V2引入的相對(duì)不確定度為

（3） 一次稀釋產(chǎn)生的相對(duì)不確定度Urel（一次稀釋），運(yùn)用泊松關(guān)于微生物培養(yǎng)產(chǎn)生的不確定度定量測(cè)定理論中的公式進(jìn)行計(jì)算：

2.3.3 加樣體積引入的不確定度Urel（加樣）

加樣時(shí)使用1 mL刻度移液管以0.3 mL、0.3 mL、0.4 mL接種3 塊Baird-Parker平板，1 mL刻度移液管均用了3 次，主要包括2 次移取0.3 mL樣品稀釋液和1 次0.4 mL樣品稀釋液，引入的不確定度主要涉及1.0 mL刻度移液管體積的U（V1）。則加樣時(shí)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

表1 同一質(zhì)控樣品6 次計(jì)數(shù)結(jié)果和計(jì)算值

2.3.4 同一樣品重復(fù)性試驗(yàn)引起的不確定度評(píng)定Urel（R）

由一位檢驗(yàn)人員對(duì)同一質(zhì)控樣品進(jìn)行6 次重復(fù)計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)，計(jì)數(shù)結(jié)果和計(jì)算值見表l。對(duì)6 次計(jì)數(shù)結(jié)果取對(duì)數(shù)，并對(duì)對(duì)數(shù)值進(jìn)行均值和殘差的計(jì)算，然后代入貝塞爾公式計(jì)算得出計(jì)數(shù)結(jié)果對(duì)數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)偏差的合成樣本標(biāo)準(zhǔn)差。

由于每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定6 次，總體合成不確定度：

2.3.5 金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)的合成不確定度Urel和擴(kuò)展不確定度U

本次試驗(yàn)重復(fù)6 次，則自由度V=n-1=5，選擇置信水平P=95%，根據(jù)t分布可知：k=t 95（5）=2.571

因此，擴(kuò)展不確定度為：

2.3.6 結(jié)果報(bào)告

由于本次試驗(yàn)將檢測(cè)結(jié)果取對(duì)數(shù)后進(jìn)行不確定度計(jì)算，因此擴(kuò)展不確定度針對(duì)的是測(cè)量結(jié)果的對(duì)數(shù)值，是以當(dāng)檢測(cè)結(jié)果以對(duì)數(shù)值的形式表示時(shí)，測(cè)試結(jié)果對(duì)數(shù)值的平均值為5.43，取值區(qū)間為5.43±0.108，即5.32～5.54；測(cè)試結(jié)果則以對(duì)數(shù)值的取值再取反對(duì)數(shù)所得，其取值區(qū)間為2.1×105～3.5×105CFU/g之間。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)按照GB 4789.10—2016中第二法平板計(jì)數(shù)法的操作規(guī)程進(jìn)行試驗(yàn)，探究的不確定度來(lái)源主要是樣液制備、稀釋、加樣體積3 個(gè)B類不確定度以及重復(fù)性試驗(yàn)1 個(gè)A類不確定度。其中，重復(fù)性試驗(yàn)由1 位檢驗(yàn)人員對(duì)同1 份奶粉質(zhì)控樣品進(jìn)行6 次重復(fù)試驗(yàn)，主要探究對(duì)于1 份奶粉樣品的檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于此次金黃色葡萄球菌重復(fù)性檢測(cè)結(jié)果具有較大的偏離，不適合直接按照貝塞爾公式計(jì)算，因此本試驗(yàn)在金黃色葡萄球菌計(jì)數(shù)的測(cè)量中采用取對(duì)數(shù)的方法對(duì)不確定度進(jìn)行評(píng)定[16]。

經(jīng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由同1 位檢驗(yàn)人員獨(dú)立操作整個(gè)金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)過(guò)程時(shí)，其加樣體積引入的不確定度較大，其次是重復(fù)性試驗(yàn)。因此，在試驗(yàn)時(shí)，尤其在日常的檢測(cè)過(guò)程中，樣品的測(cè)定必須嚴(yán)格控制試驗(yàn)條件，提高檢驗(yàn)人員操作技能。此外還應(yīng)多做平行試樣，以確保實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。同時(shí)也確認(rèn)了本研究建立的方法對(duì)于這類檢驗(yàn)條件下金黃色葡萄球菌不確定的評(píng)定可行性。