金佳佳，嚴家俊＊，綦 艷，姚麗鋒，張 娟，黃翠莉，吳思敏，莊藝協(xié)

1 廣東產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗研究院，廣東佛山 528300

2 拱北海關(guān)技術(shù)中心，廣東珠海 519015

0 引言

乳品中存在豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，可以為微生物生長提供有利的環(huán)境，在貯存、運輸、加工、銷售等各個環(huán)節(jié)都極易發(fā)生腐敗和污染，是乳品在供應(yīng)保障中的關(guān)注焦點[1]。微生物中的腐敗菌，如變質(zhì)奶油甜品中的蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、凝固酶陰性葡萄球菌（Coagulase negative Staphylococcus）、腸球菌（Enterococcus）和明串珠菌屬（Leuconostocspp）等，會引起乳品發(fā)生化學(xué)、物理變化，直接或間接產(chǎn)生有害物質(zhì)，造成乳品失去原有的功能活性和營養(yǎng)價值，是乳品腐敗變質(zhì)的重要因素，其不僅對食用者的健康和生命安全造成一定的威脅，同時也給乳品行業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失[2]。微生物中的致病菌由于不會改變?nèi)槠返母泄偬匦?，污染乳品不易被察覺，且除了致病菌自身及其代謝產(chǎn)物會損害機體健康，其代謝過程也會對機體造成一定程度的損害[3]，因而相對于腐敗菌危害更大。常見的致病菌包括沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌O157、單核細胞增生李斯特菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌等[4]。

1 乳品微生物分析技術(shù)的概述

乳品中微生物分析涉及定量和定性分析，也是對乳品質(zhì)量進行判斷衡量的重要技術(shù)手段[5]。傳統(tǒng)微生物法主要通過表型鑒定技術(shù)進行分析，例如觀察培養(yǎng)基中微生物的生長形態(tài)、革蘭氏染色試驗和生理生化反應(yīng)試驗等。該方法存在步驟復(fù)雜，具有一定的主觀性，且檢測時間長等缺陷[6]。

現(xiàn)如今，乳品中微生物的分析方法隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展有了很大的進步，如免疫學(xué)檢測方法和分子信息學(xué)檢測方法。免疫檢測方法包括酶聯(lián)免疫法、免疫磁珠法、單克隆抗體法和熒光免疫分析法等。分子生物學(xué)檢測方包括PCR-DGGE指紋技術(shù)、實時PCR（定量PCR、qPCR）技術(shù)、ARISA指紋圖譜技術(shù)、限制性內(nèi)切酶分析（REA）、16SrDNA序列分析技術(shù)和聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）等。上述方法在微生物的分析上具有較高的準確性。然而，檢測過程仍然耗時耗力，對實驗室條件、檢驗人員專業(yè)知識要求高，且需要較高的成本，難以滿足大批量樣品的檢測需求。蛋白組學(xué)分析技術(shù)是應(yīng)用于微生物快速分析的一種新型技術(shù)，該技術(shù)相對于上述方法具有快速、穩(wěn)定、準確、靈敏以及成本低等特點[7～9]。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)

蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)是一種可以在特定環(huán)境和時間條件下對細胞、組織或生物體中蛋白質(zhì)進行分析的技術(shù)手段[10]，主要涉及樣品的制備、蛋白質(zhì)的分離、蛋白質(zhì)的鑒定和生物信息學(xué)分析[11]。目前最常用的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方法是質(zhì)譜（MS）方法，該方法通過分析經(jīng)特異性蛋白酶（如胰酶）水解后得到的肽段混合物來鑒定蛋白質(zhì)。其中基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF MS）和電噴霧離子化質(zhì)譜（ES）使用頻率較高[12]。

3 MALDI-TOF MS 概述

MALDI-TOF MS是近幾年來逐漸發(fā)展起來的一種新型蛋白質(zhì)組學(xué)分析技術(shù)?，F(xiàn)如今，已用于革蘭氏陰性菌和革蘭氏陽性菌、創(chuàng)傷弧菌、分歧桿菌、霉菌和酵母的常規(guī)鑒定和分型。該技術(shù)在細菌鑒定中的應(yīng)用已將十分成熟，還可用于細菌同源性分析和耐藥性檢測等，具有操作便捷、成本低、耗時短、高通量、對檢驗人員要求不高等優(yōu)點，因此，該技術(shù)在臨床實驗室逐漸得到認可和推廣[13]。

3.1 MALDI-TOF MS 的原理

MALDI-TOF MS主要由基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源（MALDI）和飛行時間質(zhì)量分析器（TOF）兩部分組成。在進行MALDI-TOF MS分析時，首先將樣品均勻涂抹于金屬靶板上，加入基質(zhì)混合后形成含蛋白質(zhì)分子和其他細胞化合物的基質(zhì)共結(jié)晶薄膜。然后將處理好的樣品放入分析室，在激光束的作用下，解吸和電離樣品中微生物的基質(zhì)分子和蛋白質(zhì)。經(jīng)此過程產(chǎn)生的電離分子在電場作用下加速飛過飛行管道，由于它們的質(zhì)荷比（m/z）不同而相互分離。MALDI-TOF MS系統(tǒng)根據(jù)不同質(zhì)量離子到達檢測器的飛行時間生成肽質(zhì)量指紋（PMF）的特征光譜。再通過各種算法分析圖譜峰型數(shù)據(jù)，并與數(shù)據(jù)庫中的已知微生物蛋白指紋圖譜進行比對，從而確定該未知微生物的種類[14]。該方法可以在屬、種甚至菌株的水平上識別微生物。

3.2 MALDI-TOF MS 的優(yōu)缺點 [15-17]

隨著國內(nèi)外學(xué)者對MALDI-TOF MS的研究越來越多，MALDI-TOF MS分析技術(shù)得到了不斷的完善。與傳統(tǒng)方法依據(jù)微生物的表型鑒定方法不同，MALDI-TOF MS分析技術(shù)主要是依據(jù)微生物的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)進行鑒定。因而，相對而言該技術(shù)有以下優(yōu)點：（1）操作簡單，實驗人員只需經(jīng)過簡單的培訓(xùn)就能進行操作；（2）效率高。單個樣品分析只需不到1 min，（3）高通量，一次可同時進行384 個樣本的分析；（4）成本低，單個樣本分析只需1～2 元，遠低于其他方法。（5）準確度高，可以分析結(jié)構(gòu)復(fù)雜的蛋白質(zhì)混合物，同時實現(xiàn)單樣本中多種微生物的鑒定。分析精度可達到種水平和某些亞種水平；（6）樣品需求量少，微量樣品（1 個菌落，105 個細胞）即可進行分析實驗，對于某些難以培養(yǎng)的微生物，只需單個克隆就可以進行鑒定；（7）發(fā)展?jié)摿Υ螅⑸飻?shù)據(jù)庫決定了方法的分析范圍，因而隨著數(shù)據(jù)庫的不斷擴充，MALDI-TOF MS可根據(jù)數(shù)據(jù)庫分析越來越多罕見的微生物。

目前，質(zhì)譜仍有一定的局限性：（1）對于系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性高的微生物難以區(qū)分，如大腸埃希氏菌和志賀氏菌；（2）受數(shù)據(jù)庫更新的影響，對于一些少見、罕見微生物的鑒定方面效果較差，或無法檢測；（3）設(shè)備成本高。這些仍有待進一步的研究及改進。

4 MALDI-TOF MS在乳品微生物鑒定和分型中的應(yīng)用

乳酸菌在食品工業(yè)中的經(jīng)濟價值十分重要。宋丹靚敏等[18]使用MALDI-TOF MS法與16S rDNA序列分析法，對于乳酸菌鑒定的準確性以及微生物系統(tǒng)分類學(xué)相關(guān)分析結(jié)果進行比較，結(jié)果表明，15 株乳酸菌，只有2 株存在種水平差異，其余鑒定結(jié)果一致；MALDI-TOF MS分析所得的聚類分析圖和16S rDNA分析所得的系統(tǒng)發(fā)育樹，在科水平上一致，但在屬中水平上存在一定差異；MALDI-TOF MS法在乳酸菌鑒定方面有著快速、準確的優(yōu)勢，但仍需要通過優(yōu)化算法和擴充數(shù)據(jù)庫才能建立準確的系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)性。

乳酸菌食品中污染菌計數(shù)的難點在于對計數(shù)瓊脂上菌落的鑒定，并快速準確的區(qū)分。采用傳統(tǒng)的生物化學(xué)方法鑒定乳酸菌，操作繁瑣且準確性低。因此，凌莉等[19]采用MALDI-TOF MS鑒定技術(shù)對平板計數(shù)瓊脂、不含糖的計數(shù)瓊脂上菌落進行鑒定，通過比較發(fā)現(xiàn)，PCA上的菌落既有乳酸菌，又有非乳酸菌，在CASF平板上生長的菌落屬于乳酸菌食品中的污染菌；MALDI-TOF MS與不含糖計數(shù)瓊脂結(jié)合，可準確快速的對乳酸菌食品中污染菌進行計數(shù)和鑒定。

周千渝等[20]以標準菌株為模式菌，優(yōu)化了對鑒定結(jié)果存在影響的菌株培養(yǎng)條件、基質(zhì)溶液配比、點樣方式以及溶劑處理方法等條件，建立了MALDI-TOF MS快速測定5 種致病菌的方法，并考察了方法的穩(wěn)定性、重復(fù)性和檢測限，結(jié)果表明，所優(yōu)化的方法穩(wěn)定性良好，檢測限為106～109 CFU/mL，與16S rDNA測序法鑒定結(jié)果進行比較，83%在種水平一致，94%在屬水平一致。

鄭秋月等[21]應(yīng)用MALDI-TOF MS對不同宿主、不同地區(qū)來源及不同血清型的74 株沙門氏菌進行肽指紋圖譜數(shù)據(jù)的相似性和差異性分析，結(jié)果表明，MALDI-TOF-M S對沙門氏菌具有很好的溯源能力，但溯源結(jié)果可能受血清型的影響。應(yīng)結(jié)合血清型進一步完善MALDI-TOF-MS溯源分析方法。

Wenjing等[22]利用MALDI-TOF MS和主成分分析建立了一種用于致病菌鑒定的全細胞方法，研究發(fā)現(xiàn)，直接應(yīng)用MALDI - TOF MS分析全細胞細菌，無需提取蛋白質(zhì)，具有豐富的峰含量和較高的重現(xiàn)性。MALDI-TOF MS 與 PCA 相結(jié)合是一種有前途的快速鑒定食品中病原體的方法。這項研究在快速識別食品中的病原體方面具有巨大的應(yīng)用潛力。

孟令緣等[23]選取210 株沙門氏菌和18 株金黃色葡萄球菌，使用MALDI-TOF-MS、16S rDNA測序和VITEK全自動細菌鑒定系統(tǒng)進行鑒定，比較3 種方法的鑒定水平和效率，結(jié)構(gòu)表明，3 種方法鑒定210株沙門氏菌屬水平一致性均為100.0%；16S rDNA測序鑒定18株金黃色葡萄球菌屬水平為100.0%，其中15株（83.3%）菌可到鑒定種水平；MALDI-TOFMS和 VITEK可將18 株（100.0%）金黃色葡萄球菌鑒定到種水平；MALDI-TOF-MS鑒定耗時最短、效率最高。

雖然單增李斯特氏菌的發(fā)病率不高，但其致死率高達20%～50%。20世紀90年代，世界衛(wèi)生組織（WHO）已將其列為食品四大致病菌之一[24]。王耀等[25]使用MALDI-TOF-MS技術(shù)快速鑒別單增李斯特氏菌，基于實驗收集的37 株單增李斯特氏菌分離株獨特的蛋白質(zhì)指紋圖譜，創(chuàng)建了一個數(shù)據(jù)庫。該數(shù)據(jù)庫鑒定結(jié)果的可信度很高。他們還提出MALDI-TOF-MS可作為脈沖場電泳分型方法的補充方法，二者結(jié)合使用可擴大基因型對亞種水平的分型能力。

Boultifat等[26]認為，食品工業(yè)中任何微生物鑒定技術(shù)的首選條件是準確性，其次是操作簡單、快速且成本低，才能確保產(chǎn)品安全并識別其微生物污染。他們在乳品公司生產(chǎn)線的不同步驟收集的巴氏殺菌牛奶樣品中分離出了5 種細菌。用MALDI-TOF MS 方法進行分析，并將結(jié)果與16S rDNA 測序結(jié)果進行比較，以此確認鑒定的有效性。這項研究表明，與16S rDNA 基因測序相比，MALDI-TOF MS是一種高度靈敏、快速的方法，可用于鑒定乳制品行業(yè)的病原體。

相對于細菌和酵母，MALDI-TOF MS鑒定絲狀真菌的傳統(tǒng)預(yù)處理方法更加復(fù)雜，需加入乙醇、甲酸、乙腈以及離心提取蛋白質(zhì)，這是MALDI-TOF MS無法廣泛應(yīng)用于絲狀真菌鑒定的主要原因。Peng等[27]使用甲酸夾心法將中國湖北省三家大型綜合醫(yī)院收集的148 株臨床絲狀真菌分離株處理后，使用Vitek MS和Autof MS兩種MALDI- TOF MS數(shù)據(jù)庫進行鑒定。通過比較FA夾心法與傳統(tǒng)提取法的難易程度可知，甲酸夾心法是一種更方便、省時、省試劑、靈敏的前處理方法，適用于絲狀真菌的預(yù)處理和MALDI - TOF MS鑒定。

5 結(jié)論

MALDI - TOF MS是一種操作簡單、準確、經(jīng)濟、高通量且高效的微生物分析技術(shù)。其鑒別能力高于16S rDNA 測序等其他分子生物學(xué)方法，分析精度可達到種水平和某些亞種水平，因此越來越多的應(yīng)用于乳品中細菌、絲狀真菌和酵母菌等微生物進行鑒定和分型。各種微生物在乳品工業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛，使用MALDI-TOF MS對這些微生物菌株的全面分析將有助于乳品發(fā)酵過程中菌株的快速鑒定或?qū)ξ⑸锞甑馁|(zhì)量進行有效控制，此外還可以快速識別可能導(dǎo)致乳品變質(zhì)或食物中毒的微生物，保證食品質(zhì)量與安全?，F(xiàn)階段，MALDI-TOF MS數(shù)據(jù)庫的數(shù)量和大小還無法滿足一些少見、罕見微生物的鑒定或分型需求。隨著研究的深入和數(shù)據(jù)庫的不斷擴充，MALDI-TOF MS可識別的微生物將會越來越廣泛，MALDI-TOF MS在乳品微生物鑒定中的作用必然會越來越重要。