沈昕草， 朱孝仁， 劉媛媛， 吳曉陽

(1. 江蘇大學醫(yī)學院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013； 2. 江蘇大學附屬昆山醫(yī)院臨床實驗研究中心，江蘇 蘇州 215300； 3. 江蘇大學附屬昆山醫(yī)院胃腸外科，江蘇 蘇州 215300)

在全球惡性腫瘤中，胃癌發(fā)病率占第5位，病死率占第2位[1]。我國胃癌發(fā)病率逐年上升，已成為全球胃癌高發(fā)地區(qū)[2]。胃癌轉(zhuǎn)移患者生存預后較差，無化療的中位生存時間為3～5個月[3]。胃癌的發(fā)生和進展過程復雜，與多種基因的突變和表觀遺傳學改變相關[4]。

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate carboxykinase，PCK)是一種多功能酶，在物種間高度保守，是調(diào)節(jié)糖異生的關鍵酶[5]。脊椎動物均含有兩種PCK亞型，胞質(zhì)型PCK1和線粒體型PCK2，二者由不同的基因編碼[6]。PCK1位于染色體20q13.31，生理狀態(tài)下PCK1蛋白主要位于細胞質(zhì)中，激活時可轉(zhuǎn)運至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。PCK1在糖異生、甘油異生和氨基酸合成等生物學過程中發(fā)揮重要作用[7]，其高表達易引起高血糖癥和胰島素抵抗，既往研究多探究PCK1在2型糖尿病中的發(fā)病機制與治療方案[8-9]。近年來，Montal等[10]研究發(fā)現(xiàn)，PCK1在結(jié)腸源性腫瘤中呈高表達，抑制其表達可顯著降低三羧酸循環(huán)活性并抑制細胞周期。但是，PCK1對胃癌細胞增殖和遷移的影響尚不清楚。本研究擬檢測PCK1在胃癌細胞中的表達及其調(diào)控網(wǎng)絡并結(jié)合相關功能學實驗等，探討PCK1在胃癌中潛在的生物學作用。

1 材料與方法

1.1 細胞系及試劑

人胃癌HGC-27、AGS細胞由中科院上海生命科學研究院細胞庫提供。RPMI 1640、F-12K培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶均為美國Gibco公司產(chǎn)品；敲低與過表達PCK1慢病毒和空載體購自上海吉凱基因科技有限公司(GENE)；5-乙炔基-2′脫氧尿嘧啶核苷(EdU)細胞增殖檢測試劑盒為廣州銳博生物技術有限公司產(chǎn)品；Transwell細胞遷移板為美國Corning公司產(chǎn)品；一抗兔抗人PCK1、一抗小鼠抗人β-肌動蛋白均為英國Abcam公司產(chǎn)品；兔抗人蛋白激酶B(AKT)、p-mTOR(Ser2448)、p-Akt(Ser473)、核糖體蛋白S6(S6)、p-S6、真核翻譯起始因子-4E結(jié)合蛋白1(4EBP1)、p-4EBP1均為美國Cell公司產(chǎn)品；一抗β-微管蛋白、二抗均為中國ABclonal公司產(chǎn)品；BCA蛋白定量試劑盒為美國Thermo Fisher公司產(chǎn)品。

1.2 生物信息學分析

1.2.1 基于數(shù)據(jù)庫分析PCK1表達水平 在R軟件(3.3.3版本，用于可視化)中利用ggplot2軟件包整合TCGA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku/index.html)以及GTEx數(shù)據(jù)庫(https://www.genome.gov/Funded-Programs-Projects/Genotype-Tissue-Expression-Project)樣本，分析PCK1在胃癌及癌旁組織中的表達水平，其中胃癌414例，癌旁組織210例。在Oncomine 4.5數(shù)據(jù)庫(https://www.oncomine.org)中查找Cho Gastric Statistics數(shù)據(jù)集和TCGA Gastric Statistics數(shù)據(jù)集，Cho Gastric Statistics數(shù)據(jù)集中有19例胃癌樣本和4例癌旁組織樣本，TCGA Gastric Statistics數(shù)據(jù)集中有236例血液、94例胃癌和173例胃癌旁組織樣本。生成PCK1轉(zhuǎn)錄差異表達圖后，分析在胃癌及癌旁組織中PCK1mRNA表達和DNA拷貝數(shù)。在人類蛋白質(zhì)圖譜(Human Protein Atlas，HPA)數(shù)據(jù)庫(https://www.proteinatlas.org/)中在線查找胃癌樣本的免疫組織化學圖，通過比較該數(shù)據(jù)庫中胃癌組織與癌旁組織的PCK1免疫組織化學染色，分析PCK1在胃癌中的表達水平。

1.2.2 PCK1的基因本體論富集分析 在R軟件(3.6.3版本，用于統(tǒng)計分析與可視化)中，基于TCGA數(shù)據(jù)庫的胃癌樣本，以PCK1mRNA表達值的中位數(shù)為界，對低表達和高表達的差異基因進行基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA，https://www.gsea-msigdb.org/gsea/msigdb/index.jsp)，以識別胃癌中差異激活的信號通路。

1.3 細胞實驗

1.3.1 細胞分組及轉(zhuǎn)染 取處于對數(shù)期生長期的HGC-27、AGS細胞(5×104個/孔)接種于6孔板，于37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當匯合率達60%～70%時進行轉(zhuǎn)染。將敲低PCK1的細胞分為shPCK1-Seq1組、shPCK1-Seq2組和shC組，分別轉(zhuǎn)染LV-Pck1-RNAi(91486-1)慢病毒、LV-Pck1-RNAi(91488-1)慢病毒和CON313(Hu6-MCS-C8h-gcGFP-Ires-puromycin)陰性對照病毒；將過表達PCK1的細胞分為OE-PCK1組和Vec組，分別轉(zhuǎn)染LV-PFDN5(48826-1)慢病毒和CON335(Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcgfp-IRES-puromycin)陰性對照病毒；轉(zhuǎn)染24 h后，加入2.5 μg/mL嘌呤霉素篩選3 d。shPCK1 Seq1的序列為CCAAGATCTTCCATGTCAA，shPCK1 Seq2的序列為TGGCCAGGATCGAAAGCAA。

1.3.2 CCK-8增殖實驗檢測細胞生長能力 取“1.3.1”轉(zhuǎn)染后細胞(2×103個/孔)接種于96孔板，分別在培養(yǎng)箱中孵育24、48、72 h；棄培養(yǎng)基，PBS清洗3次；用完全培養(yǎng)基按1 ∶10稀釋CCK-8試劑，每孔加入100 μL；孵育1 h，測450 nm處光密度值，并繪制細胞增殖曲線。每組設5個復孔。

1.3.3 EdU細胞增殖實驗檢測胃癌細胞增殖能力 取“1.3.1”轉(zhuǎn)染后細胞(5×104個/孔)接種于24孔板，在37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當匯合率達70%～80%時，用完全培養(yǎng)基按1 ∶1 000稀釋EdU溶液，每孔加入300 μL EdU染色液，于培養(yǎng)箱中孵育2 h；加入Appolo染色液(按照說明書配制)避光孵育30 min；細胞核用1×Hoechst-33342染色30 min；于熒光顯微鏡(日本Olympus公司)下觀察。從3個隨機視野中選取至少200個細胞來計算每種細胞核內(nèi)EdU陽性比率。EdU陽性比率(%)=EdU細胞數(shù)目/Hoechst細胞數(shù)目(同一視野)×100%。

1.3.4 克隆形成實驗檢測胃癌HGC-27、AGS細胞克隆能力 取處于對數(shù)期生長期的HGC-27、AGS細胞(1×103個/孔)接種于6孔板，在37 ℃和5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10～14 d，直到形成肉眼可見的細胞集落；棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次；4%多聚甲醛固定30 min；PBS洗滌1次；加入“1.3.1”轉(zhuǎn)染后細胞用0.1%結(jié)晶紫染色30 min；洗去結(jié)晶紫待晾干后，拍照并計算克隆形成數(shù)。實驗重復3次。

1.3.5 Transwell實驗檢測胃癌HGC-27、AGS細胞遷移能力 Transwell小室放置在24孔板上，下室加入含有20%胎牛血清的600 μL F-12，上室加入約5×104個細胞重懸在無血清F-12培養(yǎng)基中，細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h；用2.5%結(jié)晶紫染色30 min；在相位對比顯微鏡(日本Olympus公司)下隨機選擇3張染色細胞的顯微鏡圖，并用軟件Image J計數(shù)細胞。

1.3.6 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測胃癌細胞中相關蛋白表達水平 取“1.3.1”轉(zhuǎn)染后細胞(5×104個/孔)接種于6孔板中，在37 ℃和5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當匯合率達80%～90%時，加入裂解緩沖液置于冰上裂解約30 min；4 ℃行12 000 r/min離心15 min；取上清液行BCA蛋白定量；95 ℃變性8 min；10% SDS-PAGE 80 V電泳30 min，110 V電泳直至蛋白按分子大小完全分離；330 mA轉(zhuǎn)膜120 min，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜；10%速溶脫脂奶粉封閉2 h；小鼠抗人β-肌動蛋白以1 ∶2 000稀釋，兔抗人PCK1、p-mTOR、mTOR、p-S6、S6、p-AKT、AKT、p-4EBP1、4EBP1及β-微管蛋白均以1 ∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜；TBST沖洗膜3次，每次10 min；二抗以1 ∶1 000稀釋，室溫孵育2～4 h；采用增強化學發(fā)光(ECL)檢測系統(tǒng)，用Image J密度分析法定量條帶灰度值。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 PCK1在胃癌中的表達情況

基于TCGA數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，PCK1mRNA在胃癌組織中的表達顯著高于癌旁組織(P<0.01,圖1)。ROC曲線顯示PCK1對胃癌患者預后具有良好的預測效能(圖2)。Oncomine 4.5數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示，胃癌組織中PCK1mRNA表達水平明顯高于癌旁組織，DNA拷貝數(shù)變異高于胃正常組織(P<0.05或P<0.01，圖3)。HPA數(shù)據(jù)庫中獲得的免疫組織化學染色結(jié)果顯示，PCK1蛋白表達在癌旁組織中為“+”，在胃癌組織中為“++”(圖4)。

圖1 胃癌與癌旁組織中PCK1 mRNA表達水平比較

A：在“Cho”數(shù)據(jù)子集中胃癌組織與癌旁組織中PCK1 mRNA表達水平比較；B：在TCGA數(shù)據(jù)庫中胃癌組織與胃癌旁組織及血液中DNA拷貝數(shù)變異比較；*:P<0.05，與癌旁組織相比；**:P<0.01，與胃正常組織相比

圖2 胃癌患者PCK1的診斷性ROC曲線

圖4 胃癌組織與癌旁組織中PCK1免疫組織化學染色結(jié)果(50×)

2.2 PCK1相關信號通路的富集分析

GSEA(條件：校正后P<0.05；容錯率<0.25)顯示了MSigDB集合富集(c2.cp.kegg.v6.2.symbols.gmt)的巨大差異。與原發(fā)性免疫缺陷、細胞黏附分子、趨化因子信號通路、全身性紅斑狼瘡、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡及RIGⅠ樣受體信號通路相關的基因集在PCK1基因低表達表型中差異富集(圖5)。

圖5 PCK1基因低表達表型中差異富集的基因集

2.3 敲低PCK1抑制人胃癌HGC-27、AGS細胞增殖和遷移

蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，與shC組比較，shPCK1-Seq1組和shPCK1-Seq2組HGC-27與AGS細胞PCK1蛋白相對表達水平顯著下降(P<0.05或P<0.01，圖6)。CCK8實驗結(jié)果顯示，與shC組相比，shPCK1-Seq1組和shPCK1-Seq2組HGC-27與AGS細胞生長能力明顯下降(P均<0.01，圖7)?？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果顯示，與shC組相比，shPCK1-Seq1組和shPCK1-Seq2組HGC-27與AGS細胞增殖能力明顯下降(P<0.05或P<0.01，圖8)。Transwell實驗結(jié)果顯示，與shC組相比，shPCK1-Seq1組和shPCK1-Seq2組HGC-27與AGS細胞遷移數(shù)顯著下降(P均<0.01，圖9)。由此表明，敲低PCK1抑制HGC-27與AGS細胞生長、增殖和遷移。

*：P<0.05，**：P<0.01，與shC組相比圖6 蛋白質(zhì)免疫印跡實驗檢測敲低PCK1后HGC-27與AGS細胞中PCK1蛋白表達水平

*:P<0.01，與shC組相比

*：P<0.05，**：P<0.01，與shC組相比

*：P<0.01，與shC組相比；標尺示100 μm

2.4 過表達PCK1增強人胃癌HGC-27、AGS細胞增殖和遷移

蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，與Vec組比較，OE-PCK1組HGC-27與AGS細胞中PCK1蛋白相對表達水平顯著增高(P均<0.01，圖10)。CCK8實驗結(jié)果顯示，與Vec組相比，OE-PCK1組HGC-27與AGS細胞生長能力明顯增強(P均<0.01，圖11)。EdU細胞增殖實驗結(jié)果顯示，與Vec對照組相比，OE-PCK1組HGC-27與AGS細胞增殖能力明顯增強(P均<0.05，圖12)。Transwell實驗結(jié)果顯示，與Vec對照組相比，OE-PCK1組HGC-27與AGS細胞遷移數(shù)量顯著增加(P均<0.01，圖13)。由此表明，過表達PCK1增強HGC-27與AGS細胞生長、增殖和遷移。

*：P<0.01，與Vec組相比

*：P<0.01，與Vec組相比

*:P<0.05，與Vec組相比

*:P<0.01，與Vec組相比；標尺示100 μm

2.5 PCK1參與調(diào)控AKT-mTOR信號傳導

shRNA敲低PCK1后，蛋白免疫印跡檢測結(jié)果顯示，與shC組比較，shPCK1-Seq1組和shPCK1-Seq2組p-AKT、p-mTOR、p-S6和p-4EBP1相對表達水平顯著下降(P<0.05或P<0.01，圖14)。外源性過表達PCK1后，蛋白免疫印跡檢測結(jié)果顯示，與Vec組比較，OE-PCK1組p-AKT、p-mTOR、p-S6和p-4EBP1相對表達水平顯著升高(P<0.05或P<0.01，圖15)。由此提示，PCK1在胃癌中呈高表達，并可能以激酶形式調(diào)控AKT-mTOR通路的活化，從而參與調(diào)控胃癌細胞的惡性生物學行為。

*：P<0.05，**：P<0.01，與shC組相比

*：P<0.05，**：P<0.01，與Vec組相比

3 討論

本研究結(jié)果顯示，PCK1蛋白在胃癌中表達上調(diào)，但其高表達的調(diào)控機制和作用機制尚不明確，故進行GSEA以識別胃癌中差異激活可能的信號通路；結(jié)果顯示，原發(fā)性免疫缺陷、細胞黏附分子、趨化因子信號通路、全身性紅斑狼瘡、產(chǎn)生IgA的腸道免疫網(wǎng)絡及RIGⅠ樣受體信號通路相關的基因集在PCK1基因低表達表型中差異富集。Ma等[11]報道，PCK1能通過糖原代謝途徑調(diào)節(jié)CD8+免疫細胞形成和維持。Guo等[12]報道，孕烷X受體可能通過促進PCK1表達抑制趨化因子信號通路，進而對潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)揮保護作用。由此初步提示，PCK1可能通過免疫途徑調(diào)控胃癌的進展。此外，ROC曲線顯示PCK1對胃癌患者預后診斷具有良好的效能。

代謝重編程是腫瘤的典型特征之一[13]，PCK1作為糖異生的限速酶，在代謝重編程中起重要作用[14-15]。既往研究表明，在肝臟和腎臟中，PCK1表達量較高，其發(fā)揮糖異生酶的作用從而抑制腫瘤細胞生長[15-16]。有研究報道在自身PCK1表達量較低的肺和結(jié)直腸中，PCK1表達量增高可促進腫瘤細胞生長，其機制可能與葡萄糖和谷氨酰胺增多有關[10,17]。PCK1高表達可增加細胞中葡萄糖和氨基酸尤其是谷氨酰胺的合成[18]，谷氨酰胺可以衍生為谷氨酸，在蛋白質(zhì)合成、轉(zhuǎn)氨反應、營養(yǎng)物質(zhì)交換等方面發(fā)揮作用，從而促進腫瘤細胞的生長[19]。本研究相關數(shù)據(jù)庫結(jié)果提示，PCK1在胃正常細胞中相對表達較低，而在胃癌細胞中明顯升高；此外，體外細胞功能學實驗證實，在胃癌細胞中敲低PCK1可抑制胃癌細胞生長，反之則增強。Yamaguchi等[20]研究證實，在缺氧條件下PCK1可通過對核苷酸庫的維持，主要促進還原羧化作用產(chǎn)生嘧啶前體天冬氨酸，進而促進腫瘤細胞遷移。本研究通過Transwell實驗也證實，PCK1對胃癌細胞的遷移有促進作用。由此說明，PCK1可能是促進胃癌細胞生長與遷移的一個關鍵基因。

此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，PCK1可能通過參與誘導AKT-mTOR通路調(diào)控胃癌的惡性生物學行為。研究表明AKT-mTOR信號通路是正常生理細胞和癌細胞生長的主要調(diào)節(jié)通路之一，該通路在腫瘤中經(jīng)常被激活，目前已證實與胃癌、卵巢癌和乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生及不良預后相關[21-24]。Montal等[10]提出PCK1促進消化道腫瘤細胞的生長與增殖，并可能與AKT-mTOR通路激活有關。PCK1可以通過谷氨酰胺的分解與α-酮戊二酸的產(chǎn)生激活mTOR通路[25]，提高細胞氨基酸、葡萄糖、核苷酸和脂質(zhì)代謝[26]；這些代謝途徑可以為癌細胞的大分子合成提供原料[27]。本研究結(jié)果顯示，敲低PCK1后胃癌細胞中AKT、mTOR以及其下游蛋白包括S6和4EBP1磷酸化水平顯著降低；反之，過表達則升高。S6以及4EBP1對蛋白質(zhì)合成起重要作用，其磷酸化水平可用于評價mTOR通路的活化程度，磷酸化水平越高說明AKT-mTOR通路活性越高。由此說明，PCK1可以促進AKT-mTOR信號通路的活化。

綜上所述，PCK1在胃癌中呈高表達且與患者預后相關，其高表達可促進胃癌細胞生長、增殖與遷移，這可能與PCK1調(diào)控AKT-mTOR信號通路的活化有關，但具體分子機制有待進一步研究。