黃旭波，秦玉川，劉本同，王麗玲，童曉青，方茹，王衍彬

（浙江省林業(yè)科學研究院，浙江 杭州 310023）

藤茶，又被稱為莓茶、葉茅茶、雪茶、山甜茶等，是由葡萄科Vitaceae 蛇葡萄屬Ampelopsis植物顯齒蛇葡萄Ampelopsis grossedentata的嫩葉加工而成的茶飲。顯齒蛇葡萄主要分布于我國的廣西、貴州、湖南等省[1]，在瑤族、壯族、土家族等少數(shù)民族地區(qū)有著廣泛的食用和藥用歷史[2]，其味甘性涼，具有清熱解毒，祛風濕，強筋骨等功效，常被用于治療感冒發(fā)燒以及咽喉腫痛等癥狀[3-4]。顯齒蛇葡萄葉富含黃酮、多酚、多糖、維生素等成分，其中以黃酮類，特別是二氫楊梅素（Dihydromyricetin）含量最高，其提取物具有抗氧化、增強免疫、抗炎抑菌、降三高、護肝和抗腫瘤等功效[5-9]。二氫楊梅素是一種雙氫黃酮醇類化合物，又被稱為雙氫楊梅素、雙氫楊梅皮素等，廣泛存在于葡萄科植物中，在楊梅科Myricaceae、杜鵑花科Ericaceae、橄欖科Burseraceae、豆科Fabaceae 等植物中也有發(fā)現(xiàn)。二氫楊梅素在顯齒蛇葡萄葉片中的含量非常高，可以達到干質(zhì)量的20%以上[10]。研究表明，二氫楊梅素具有抗氧化、抗腫瘤、降血壓、降血糖和抑制血栓形成等功效[11-12]。

近年來，隨著《浙江省林下經(jīng)濟“十四五”發(fā)展規(guī)劃綱要（2021—2025）》[13]的推進，藤茶被引種到浙江省木本糧油（油茶Camellia oleifera、香榧Torreya grandis‘Merrillii’等）經(jīng)濟林下作為林下經(jīng)濟資源進行種植。隨著浙江省木本糧油基地建設的不斷興起，藤茶的種植面積不斷增加，不僅解決了山地林下土壤裸露、水土流失和林地水分蒸發(fā)的問題，而且有助于林農(nóng)增收和經(jīng)濟林產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。但是鑒于浙江省境內(nèi)尚未發(fā)現(xiàn)有顯齒蛇葡萄的野生分布，而藤茶評價研究多以異地或本地收集樣品為研究對象，未發(fā)現(xiàn)異地野生資源本地栽種評價的相關研究。

自2015 年起，我們將廣西、湖北和貴州三地的野生顯齒蛇葡萄引種至浙江進行栽培試驗，并以藤茶中重要的特征性成分二氫楊梅素含量為指標對資源進行評價，避免了先評價產(chǎn)品后引進資源最終不適宜本地推廣栽種的弊端，為藤茶的引種、栽培與產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗原料

研究材料為廣西、貴州、湖北的野生顯齒蛇葡萄葉片，以及這3 種野生顯齒蛇葡萄引種浙江后第5 年的實生葉片（2015 年3 月在廣西、貴州、湖北三地進行采樣的同時，從3 地引種采樣的4 個種質(zhì)實生種源，引種在浙江省杭州市午潮山林場），樣品與采樣地點情況見表1。除采自湖北省恩施市來鳳縣三湖鄉(xiāng)的大葉（長6～ 9 cm，寬4～ 5 cm）樣品外，其余均為小葉（長3～ 5 cm，寬2～ 3 cm）樣品。

表1 采樣地點與時間Tab.1 Sampling location and time

1.2 設備與試劑

GZX-9140MBE 鼓風干燥箱，上海博迅實業(yè)有限公司；DFT-150 粉碎機，溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司；SY-1000E 恒溫超聲提取器，北京弘祥隆生物技術股份有限公司；RE-5205 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；AL204-IC 電子天平，梅特勒托利多集團；U3000 高效液相色譜儀，賽默飛世爾科技有限公司；明澈-D 高純水機，默克有限公司。

二氫楊梅素標樣，純度98%，購自北京世紀奧科生物技術有限公司。甲醇、乙醇、丙酮均為分析純；磷酸、甲醇、乙醇、乙腈均為色譜純。

1.3 樣品采集與處理

嫩葉指春季采摘葉齡15 d 左右的顯齒蛇葡萄葉片；老葉指春季發(fā)芽，秋季采摘的顯齒蛇葡萄葉片。

2015 年3 月，采摘廣西、貴州、湖北三地野生顯齒蛇葡萄嫩葉，在采樣地晾干，然后于實驗室烘箱中35℃烘干。2020 年3 月和10 月分兩次采摘引種栽培的3 個種源4 個種質(zhì)顯齒蛇葡萄嫩葉和老葉，與野生樣品同樣處理。干燥后的樣品于粉碎機中粉碎至60 目，備用。

1.4 二氫楊梅素提取方法

根據(jù)二氫楊梅素的特性和陳玉瓊的研究結(jié)果[14]，采用水和乙醇的混合溶液作為提取溶劑，并分別考察了提取溫度、水醇比例和超聲時間對顯齒蛇葡萄葉中二氫楊梅素提取率的影響，根據(jù)預試驗結(jié)果，選擇75%（體積分數(shù)）乙醇水溶液和40 ℃作為超聲提取的萃取溶劑和萃取溫度條件。

精確稱取粉碎好的顯齒蛇葡萄葉樣品1.000 0 g，加入20 mL 75%乙醇水溶液，20 kHz 頻率，500 W 功率超聲萃取25 min，過濾，濾渣重復提取3 次，收集濾液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮，再用乙醇定容至100 mL 容量瓶中，0.22 μm 膜過濾，進行HPLC 分析。

1.5 色譜分析方法

1.5.1 色譜條件 Agilent Extend-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫35℃，紫外波長292 nm，流動相比例A（甲醇）∶B（0.1%磷酸水溶液）=25∶75（體積比），進樣量10 μL，流速1.0 mL·min-1，等度洗脫。

1.5.2 標準曲線繪制 精確稱取二氫楊梅素100.0 mg，用色譜純乙醇溶解，定容至25 mL 容量瓶中，配制成濃度4.0 mg·mL-1標準溶液，并以此為母液，用乙醇梯度稀釋配制成0.2 mg·mL-1、0.4 mg·mL-1、0.8 mg·mL-1、1.6 mg·mL-1、3.2 mg·mL-1和4.0 mg·mL-1濃度的標準溶液，0.22 μm 膜過濾，進行HPLC 分析。以進樣的質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。

1.5.3 精密度試驗 取0.8 mg·mL-1標準樣品溶液，按照1.5.1 方法進行進樣分析6 次，根據(jù)二氫楊梅素的吸收峰面積計算精密度。

1.5.4 穩(wěn)定性試驗 取顯齒蛇葡萄葉萃取液樣品1 份，分別在0、4、8、16、24、48 h 時進行分析，測定二氫楊梅素含量，以峰面積計算穩(wěn)定性。

1.5.5 重復性試驗 稱取同一樣品6 份，按照1.4 方法制備樣品，按1.5.1 方法進行液相色譜分析，進行重復性試驗，按照峰面積計算重復性。

1.5.6 回收率試驗 取已測定的樣品6 份，按照樣品中二氫楊梅素含量的0.8 倍、1.0 倍和1.2 倍加入對照品，按照1.4 方法制備樣品，按照1.5.1 方法進行液相色譜分析，根據(jù)公式（1）計算加標回收率。

式中，P為加標回收率；m1為試樣中的二氫楊梅素含量，單位mg；m2為加標試樣中的二氫楊梅素含量，單位mg；m為加標量，單位mg。

1.5.7 二氫楊梅素含量計算 獲得樣品中二氫楊梅素HPLC 檢測峰面積，根據(jù)1.5.2 中獲得的二氫楊梅素標準樣品濃度與峰面積回歸方程，獲得樣品濃度，根據(jù)下式（2）計算樣品中的二氫楊梅素含量。

式中，C為樣品中的二氫楊梅素含量，單位mg·g-1；ω為測試樣品中的二氫楊梅素濃度，單位mg·mL-1；v為測試樣品定容體積，單位mL；m為樣品質(zhì)量，單位g。

1.6 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)整理、平均數(shù)、標準差等計算采用WPS 2019，顯著性分析和制圖采用Origin 2019。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學結(jié)果

圖1 為液相色譜測定二氫楊梅素的標準曲線，其擬合方程為：y=218.74x，R2＝0.999 7，表明在0.20～ 4.0 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關系良好。圖2 為二氫楊梅素標樣和顯齒蛇葡萄葉萃取樣品的HPLC 色譜圖。根據(jù)1.5.3～ 1.5.5 方法進行精密度、穩(wěn)定性和重復性試驗，儀器分析精密度RSD=0.17%，重復性試驗RSD=0.83%，穩(wěn)定性試驗RSD=1.15%，表明本儀器分析方法的精度可以滿足試驗的要求，且供試樣品溶液在48 h 內(nèi)是穩(wěn)定的。

圖1 HPLC 測定二氫楊梅素標準曲線Fig.1 Standard curve of Dihydromyricetin by HPLC

圖2 二氫楊梅素標樣（上）和藤茶樣品（下）HPLC 檢測圖Fig.2 Standard Dihydromyricetin curve (top) and that of samples by HPLC(bottom)

表2 為本方法加樣回收率試驗結(jié)果。從表中可以看出，加樣回收率為97.71%～ 101.34%，平均加樣回收率為98.88%，RSD=1.42%。由方法學結(jié)果表明，本研究建立的提取與分析方法可以滿足顯齒蛇葡萄葉中二氫楊梅素定量分析的要求。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果Tab.2 The results of standard recovery rate

2.2 萃取方法的研究結(jié)果

2.2.1 乙醇濃度對二氫楊梅素萃取得率的影響 二氫楊梅素，分子式為C15H12O8，相對分子質(zhì)量為320.25，其化學結(jié)構(gòu)式如圖3，微溶于冷水和乙酸乙酯，易溶于甲醇、乙醇和丙酮，不溶于氯仿和石油醚。根據(jù)二氫楊梅素的溶解特性，摒棄毒性較大的甲醇和丙酮，分別用不同濃度的水醇混合溶液作為提取溶劑，考察其提取得率。

圖3 二氫楊梅素化學結(jié)構(gòu)式Fig.3 Structural formula of Dihydromyricetin

圖4 為不同乙醇濃度萃取顯齒蛇葡萄葉中二氫楊梅素的結(jié)果圖。其萃取條件為：溫度50 ℃，液料比20∶1，萃取時間25 min，振蕩浸提。從圖中可以看出，二氫楊梅素提取率先隨乙醇濃度的增加而增加，達最高點后降低，萃取效果最優(yōu)的比例是水∶乙醇＝25∶75，在此條件下二氫楊梅素的提取得率可以達到16.21%。

圖4 乙醇濃度對二氫楊梅素萃取得率的影響(n=3)Fig.4 Effect of ethanol concentration on extraction yield of Dihydromyricetin（n=3）

2.2.2 萃取溫度和超聲次數(shù)對二氫楊梅素得率的影響 采用液料比20∶1，萃取溶劑水∶乙醇＝25∶75，以25 min 為一個萃取時間段，超聲條件為：頻率20 kHz，功率500 W，考察不同溫度和超聲次數(shù)對顯齒蛇葡萄葉中二氫楊梅素萃取得率的影響。從圖5 可看出，在不施加超聲的情況下，溫度對提取得率的影響較大，提取得率隨著溫度的上升而提高，在70～ 80 ℃時達到最大，達19.42%。但有研究表明[16]，提取溫度超過90℃以后，二氫楊梅素的萃取得率反而降低，這可能是因為熱敏性的二氫楊梅素受高溫破壞而造成的。超聲波輔助萃取顯齒蛇葡萄葉中二氫楊梅素效果好于普通萃取，3 次超聲萃取效果好于1 次超聲萃取，在1次超聲萃取時，隨著溫度的升高，萃取得率也隨之提高，而在3 次超聲萃取時，溫度升高對萃取得率的影響較小，說明3 次萃取已經(jīng)基本上可以將顯齒蛇葡萄葉中的二氫楊梅素萃取干凈，其最高萃取得率達30.66%。因考慮到溫度可能會對二氫楊梅素的穩(wěn)定性造成影響，所以本試驗選擇最適的萃取條件為：液料比20∶1，萃取溶劑水∶乙醇＝25∶75，萃取溫度40 ℃，頻率20 kHz、功率500 W 條件下超聲萃取3 次，每次25 min。

圖5 溫度和超聲萃取次數(shù)對顯齒蛇葡萄葉中二氫楊梅素萃取得率的影響 (n=3)Fig.5 Effect of temperature and ultrasonic times on extraction yield of dihydromyricetin from Ampelopsis grossedentata leaves（n=3）

2.3 引種顯齒蛇葡萄葉中二氫楊梅素含量比較

圖6 為廣西、貴州、湖北3 個地區(qū)4 種顯齒蛇葡萄葉野生嫩葉樣品及浙江引種栽培5 年后的實生顯齒蛇葡萄嫩葉樣品中二氫楊梅素的含量比較。從圖中可以看出，3 個地區(qū)的普通野生顯齒蛇葡萄葉樣品及引種至浙江的樣品中，二氫楊梅素含量都比較高，均超過200 mg·g-1，其中二氫楊梅素含量最高的是采自湖北省恩施市來鳳縣三胡鄉(xiāng)的引種樣品，含量高達291.87 mg·g-1。來自湖北的大葉顯齒蛇葡萄，葉片大，產(chǎn)量高，但葉片中的二氫楊梅素含量最低，野生樣品與栽培樣品中的含量均未超過70 mg·g-1。

從圖6 中可以得出，引種的4 個種質(zhì)顯齒蛇葡萄嫩葉樣品中，栽培樣品與野生樣品中的二氫楊梅素含量相近。其中，從廣西、貴州兩地引種的樣品中，野生樣品二氫楊梅素含量略高于與引種栽培樣品，從湖北恩施引種的普通樣品與大葉樣品中，野生樣品中的二氫楊梅素含量略低于引種栽培樣品，但均無顯著性差異（P＞0.1）。

圖6 引種與野生嫩葉樣品二氫楊梅素含量比較 (n=5)Fig.6 Dihydromyricetin content from local wild and introduced young leaves(n=5)

3 個種源的小葉樣品中，湖北樣品的二氫楊梅素含量最高，其次為貴州樣品和廣西樣品，但湖北樣品與貴州樣品、貴州樣品與廣西樣品的二氫楊梅素含量，并無顯著性差異（P＞0.1），湖北種源的栽培樣品與廣西種源的栽培樣品二氫楊梅素含量存在顯著性差異（P＜0.05）。從圖中6 可以明顯看出，采自湖北的大葉樣品，其二氫楊梅素含量遠低于其它3 個小葉種源樣品，并存在極顯著性差異（P＜0.01），引種至浙江栽培的湖北大葉樣品，亦存在同樣規(guī)律。

2.4 顯齒蛇葡萄葉中二氫楊梅素含量的比較

圖7 為3 個種源4 份種質(zhì)的顯齒蛇葡萄老葉與嫩葉中二氫楊梅素含量比較圖。從圖中可以明顯看出，顯齒蛇葡萄老葉和嫩葉中的二氫楊梅素含量存在極顯著差異，嫩葉中的二氫楊梅素含量均高于老葉，且差異極顯著（P＜0.01），其中貴州引種樣品老葉與嫩葉中的含量差異最大，嫩葉中的二氫楊梅素含量是老葉的2.07 倍，其次是廣西種源、湖北大葉種源和湖北種源，嫩葉中的二氫楊梅素含量分別為老葉的1.58 倍、1.53 倍和1.25 倍。陳玉瓊[15]研究也表明，顯齒蛇葡萄在生長過程中，隨著葉片的老化，其二氫楊梅素的含量隨之降低。上述研究表明，顯齒蛇葡萄在葉片采摘加工成藤茶時，應該盡量采摘嫩葉，以保證產(chǎn)品中二氫楊梅素的含量。

圖7 3個種源4份種質(zhì)顯齒蛇葡萄老嫩葉二氫楊梅素含量比較（n=5）Fig.7 Dihydromyricet in content from introduced A.grossedentata leaves collected in March and October（n=5）

3 討論與結(jié)論

天然植物應用于人類的保健與醫(yī)療已有幾千年的歷史，植物體內(nèi)存在的天然活性成分，包括黃酮、多酚、多糖、生物堿等，具有多種生理功能[16-17]，是天然植物體在生長過程中所產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，也是中藥學發(fā)展的物質(zhì)基礎[18]，是現(xiàn)代保健食品和藥物開發(fā)的重要目標之一。由顯齒蛇葡萄嫩葉制成的藤茶，因其次生代謝產(chǎn)物二氫楊梅素含量高，并具有多種生理活性功能而備受關注，國內(nèi)外進行了許多萃取、純化和生理功能方面的研究[19-20]，市場需求也在急劇擴大。

由于浙江省并無顯齒蛇葡萄的天然分布[21]，2015 年將其從廣西、湖北和貴州三地引種至浙江省杭州市西湖區(qū)、金華市武義縣、紹興市嵊州市、衢州市衢江區(qū)、麗水市青田縣等地栽培研究，以豐富省內(nèi)經(jīng)濟作物種類，選育適合浙江生長的顯齒蛇葡萄品種。為探索浙江省外野生資源與省內(nèi)引種資源葉片中二氫楊梅素含量的差異，以及引種資源老葉和嫩葉中二氫楊梅素含量的差異，進行了顯齒蛇葡萄葉片中二氫楊梅素提取方法、HPLC 檢測方法的研究，獲得顯齒蛇葡萄葉片中二氫楊梅素的最佳萃取條件——液料比20∶1，萃取溶劑水∶乙醇＝25∶75，萃取溫度40 ℃，頻率20 kHz、功率500 W 條件下超聲萃取3 次，每次25 min；二氫楊梅素的HPLC 檢測方法的標樣擬合方程為：y=218.74x，R2=0.999 7，平均加標回收率為98.88%，能較好滿足研究的需求。

有研究表明，由于引種地與原產(chǎn)地環(huán)境差異和栽培技術的不同，引種后植物體內(nèi)黃酮等活性成分可能低于原產(chǎn)地[22]。采用上述研究方法對種源地野生資源與引種5 年后栽培資源葉片中二氫楊梅素含量進行分析，發(fā)現(xiàn)湖北種源引種普通顯齒蛇葡萄樣品中二氫楊梅素含量最高，達（291.87±13.10）mg·g-1，湖北野生大葉顯齒蛇葡萄樣品中二氫楊梅素含量最低，為（61.43±11.17）mg·g-1。4 個種源引種的樣品中二氫楊梅素含量與野生樣品并無顯著性差異，說明浙江杭州是顯齒蛇葡萄的適生地，環(huán)境的細微變化并未對二氫楊梅素這一次生代謝產(chǎn)物的積累造成不利影響。

植物體內(nèi)活性成分的產(chǎn)生、積累與生長季節(jié)密切相關，有研究表明，隨著生長時間的增加，茶Camellia sinensis中茶多酚含量會隨之增加[23-24]，秋季含量最高，而北京地區(qū)鐵皮石斛Dendrobium officinale中多糖含量在8—9 月最高，生物堿含量在4—5 月最高[25]。植物體內(nèi)二氫楊梅素的含量與季節(jié)應該也存在類似相關性，本研究針對茶葉加工的春秋兩季，對顯齒蛇葡萄老葉（10 月）與嫩葉（3 月）中的二氫楊梅素含量進行了分析對比，結(jié)果表明，嫩葉中的二氫楊梅素含量遠高于老葉，差異最大的是貴州引種顯齒蛇葡萄，嫩葉中二氫楊梅素含量是老葉中的2.07 倍，說明在實際生產(chǎn)中，應該盡量在春季進行采摘加工。