錢(qián)愛(ài)軍

(江陰市人民醫(yī)院，江蘇 江陰 214400)

浙貝母為常用中藥材，又稱(chēng)象貝母，為百合科貝母屬植物浙貝母(FritillariathunbergiiMiq.)的干燥鱗莖，為《中華人民共和國(guó)藥典》收載品種[1]。貝母始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列入中品，浙貝母載于清《本草綱目拾遺》，被列為“浙八味”之首[2]，其性寒、味苦，功效主要是清熱散結(jié)、化痰止咳，臨床上多用于痰火咳嗽、乳癰、風(fēng)熱咳嗽、肺癰等病癥的治療[3-4]。

浙貝母的傳統(tǒng)用法是以水煎煮后取汁，但常規(guī)煎煮過(guò)程中，廢棄的浙貝母藥渣時(shí)?？梢?jiàn)白心(干心)，即便煎煮時(shí)間延長(zhǎng)至4 h，仍可存在35%～40%的干心，說(shuō)明常規(guī)藥材飲片的有效成分難以溶出，進(jìn)而也會(huì)嚴(yán)重影響藥效發(fā)揮。有研究表明，粒徑對(duì)浙貝母粉體有效成分溶出度和藥效學(xué)的影響較大[5]，超微粉碎可促進(jìn)浙貝母藥效成分的溶出，也可明顯增強(qiáng)祛痰和鎮(zhèn)咳的藥理作用[6]。

中藥超微粉碎技術(shù)近年來(lái)應(yīng)用較為廣泛，其利用先進(jìn)的超微粉碎技術(shù)將中藥材微粉化，可有效促進(jìn)有效成分的溶出，提升中藥利用率[7]?；诖?，本研究以浙貝母超微粉、飲片和粗粉為研究對(duì)象，采用HPLC-ELSD法測(cè)定其3種生物堿成份(貝母素甲、貝母素乙、貝母辛)在人工胃液中的溶出度，以期為解決傳統(tǒng)煎煮工藝造成浙貝母藥效成分溶出度偏低問(wèn)題提供參考[8]。

1 儀器與試藥

1.1儀器 賽多利斯BSA124S型電子天平(十萬(wàn)分之一，德國(guó)賽多利斯公司)；梅特勒托利多XP6微量天平(德國(guó)賽多利斯公司)；Agilent1260-Infinity Ⅱ高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫科技公司生產(chǎn))；Agilent1260-Infinity Ⅱ蒸發(fā)光散射檢測(cè)器(美國(guó)安捷倫科技公司生產(chǎn))；智能溶出度儀(日本富山產(chǎn)業(yè)株式會(huì)社)。

1.2試藥 貝母辛、貝母素甲、貝母素乙對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110750-201211，110750-201110，110751-200709)(純度>97%)。浙貝母藥材飲片、粗粉(24目)和超微粉(200目)(康美藥業(yè)股份有限公司)。甲醇、乙腈為色譜純；氨水、二乙胺、鹽酸、乙醇、氯仿等其他試劑均為分析純；水為超純水；人工胃液均為實(shí)驗(yàn)室自制(16.4 mL稀鹽酸+10.0 g胃蛋白酶+800 mL水，加水定容至1000 mL)，水為超純水，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1含量測(cè)定

2.1.1色譜條件 Agilent Extend C18色譜柱(250 mmnt Ext，550)；流動(dòng)相：0.01%二乙胺(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～10 min，70%A；10～15 min，70%～60% A；15～35 min，60%～45%A；35～50 min，45%～35% A：50～70 min，35%～15% A)；流速：1.0 mL·min-1；ELSD檢測(cè)漂移管溫度：60℃；柱溫：35℃；載氣體積流量：3.0 L·min-1；進(jìn)樣量：20 μL。

2.1.2對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取貝母辛、貝母素甲、貝母素乙對(duì)照品適量，置于10 mL容量瓶，加甲醇溶液稀釋成每1 mL含貝母辛0.123 mg、貝母素甲0.253 mg、貝母素乙0.152 mg的混合對(duì)照品溶液，搖勻，即得對(duì)照品溶液，于冰箱內(nèi)冷藏保存，備用。

2.1.3供試品溶液制備 取不同規(guī)格浙貝母樣品(超微粉，粗粉和飲片)粉末約1.0 g，精密稱(chēng)定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入濃氨試液5 mL，浸潤(rùn)1 h，精密加入三氯甲烷-甲醇(4∶1)至50 mL，稱(chēng)重，超聲(功率240 W，頻率40 kHz)處理60 min，放冷至室溫后，再次稱(chēng)量，用三氯甲烷-甲醇(4∶1)補(bǔ)足減失的重量，搖勻，15000 r·min-1離心10 min，精密均勻量取其中的上清液10 mL，加熱蒸干，殘?jiān)眉状汲浞秩芙猓D(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾后，濾液即為供試品溶液[9]。

2.1.4線性關(guān)系考察 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶適量，分別置于6個(gè)10 mL容量瓶中，以甲醇梯度稀釋至1、10、20、30、40、50倍，制成系列不同質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。以峰面積對(duì)數(shù)值(Y)為縱坐標(biāo)，以對(duì)照品質(zhì)量濃度(X，mg·mL-1)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，建立貝母辛、貝母素甲、貝母素乙回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 貝母辛、貝母素甲、貝母素乙的回歸方程和線性范圍

2.1.5精密度實(shí)驗(yàn) 精密吸取2.1.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液20 μL，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件不間斷連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄貝母辛、貝母素甲、貝母素乙峰面積，計(jì)算RSD分別為2.21%、1.88%、2.41%，表明儀器精密度良好。

2.1.6重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取浙貝母超微粉樣本粉末6份，每份約1.0 g，精密稱(chēng)定，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品樣本溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定貝母辛、貝母素甲、貝母素乙峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，3種生物堿峰面積RSD分別為2.79%、2.62%、2.31%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取浙貝母超微粉樣本制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，分別于不同時(shí)間點(diǎn)(0、2、4、8、12、24、36 h)進(jìn)樣測(cè)定貝母辛、貝母素甲、貝母素乙峰面積，計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，3種生物堿峰面積RSD分別為1.75%、1.53%、1.92%，表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.8加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取浙貝母超微粉樣本粉末6份，每份約1.0 g，精密稱(chēng)定，置50 mL具塞錐形瓶中，加入貝母辛、貝母素甲、貝母素乙混合對(duì)照品適量，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品樣本溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定貝母辛、貝母素甲、貝母素乙含量，并根據(jù)外標(biāo)法計(jì)算回收率及RSD。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 貝母超微粉中貝母辛、貝母素甲、貝母素回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.1.9樣品含量測(cè)定 取不同規(guī)格浙貝母樣品(超微粉，粗粉和飲片)粉末，按“不同規(guī)格浙貝項(xiàng)下的方法制備供試品，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定貝母辛、貝母素甲、貝母素乙含量。3種生物堿含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 不同規(guī)格浙貝母中貝母辛、貝母素甲、貝母素乙含量測(cè)定結(jié)果

2.2體外溶出度測(cè)定 分別取不同規(guī)格浙貝母樣品(超微粉，粗粉和飲片)粉末2 g，精密稱(chēng)定，投入溶出度儀中，采用2020年版《中國(guó)藥典》(四部)通則中的槳法測(cè)定，以人工胃液為溶出介質(zhì)，轉(zhuǎn)速100 r·min-1，溫度(37±0.5)℃，分別于0，5，10，15，20，30，45，60 min取樣 5 mL，并向溶出杯中補(bǔ)充同溫度同體積的新鮮溶出介質(zhì)，取出樣品溶液用氨試液調(diào)pH至10.0，10 mL氯仿萃取3次，合并萃取液，減壓回收溶劑至干， 殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜? mL，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，HPLC法測(cè)定含量，并計(jì)算溶出量，按照下式計(jì)算體外溶出度。體外溶出度=[(樣品質(zhì)量×樣品溶出量)/(樣品質(zhì)量×樣品測(cè)得量)]樣品測(cè)得量%。

表4 不同規(guī)格浙貝母中3種生物堿成分在人工胃液中溶出量測(cè)定結(jié)果

表3結(jié)果顯示，浙貝母飲片在0 min時(shí)濃度基本會(huì)達(dá)到平衡，其體外溶出度在0 min時(shí)也會(huì)最高，超微粉次之，粗粉最低；在0～5 min內(nèi)，飲片的溶出速度最慢，粗粉次之，超微粉最快；在5 min時(shí)超微粉達(dá)到平衡濃度，而粗粉則需要15 min；在5～60 min內(nèi)超微粉3種生物堿的累計(jì)體外溶出度達(dá)90.25%，而粗粉為82.29%，飲片僅為33.65%，進(jìn)而提示，浙貝母體外溶出度與粒徑的大小關(guān)系密切，相對(duì)于飲片和粗粉，其超微粉溶出速度最快，與文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)容相符[10]。

3 討 論

貝母素甲、貝母素乙是《中國(guó)藥典》(2020年版)[11]中規(guī)定的浙貝母含量測(cè)定質(zhì)量控制指標(biāo)，但新近研究發(fā)現(xiàn)，浙貝母平喘藥理作用的主要藥效成分還包括貝母辛[12-14]?；诖耍狙芯恳哉阖惸钢?種生物堿(貝母辛、貝母素甲和貝母素乙)為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)其三種藥材形式(飲片、超微粉、粗粉)水提物和人工胃液中的體外溶出度進(jìn)行分析與比較，為該藥材最佳臨床用藥形式提供了理論依據(jù)，以期最大程度發(fā)揮藥效[15]。

有研究表明，浙貝母的飲片厚度、粒徑大小和浸泡時(shí)長(zhǎng)均可明顯影響其藥效成分的體外溶出度，《中國(guó)藥典》(2020年版)明確規(guī)定，浙貝母飲片厚度宜為2～4 mm；《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》[16-17]規(guī)定，浙貝母飲片煎煮前，浸泡時(shí)長(zhǎng)>45 min。本研究中發(fā)現(xiàn)，浙貝母飲片浸泡35 min后煎煮時(shí)，常見(jiàn)白心或干心現(xiàn)象，主要因其質(zhì)地致密、飲片厚度大，短時(shí)間內(nèi)水分難以滲透到藥物內(nèi)部，且含有大量的淀粉類(lèi)物質(zhì)，煎煮時(shí)淀粉糊化于表面而形成較為明顯致密層，妨礙水分子進(jìn)入藥材內(nèi)部，導(dǎo)致藥材內(nèi)部藥效成分不易溶出[18-19]。本研究結(jié)果顯示，超微粉在人工胃液中體外溶出達(dá)到平衡濃度僅需5 min，其3種生物堿的累計(jì)體外溶出度高達(dá)90.25%，顯著高于飲片和粗粉。但部分中藥材超微粉也存在一些弊端，例如：含有大量淀粉成分，如直接煎煮容易糊化成凝膠形態(tài)，且難以過(guò)濾藥液[20-21]，不易于服用；如將其作散劑直接入藥，臨床用藥量偏大，故應(yīng)綜合分析超微粉的利弊，合理使用，使其臨床藥用價(jià)值得到最大限度的發(fā)揮。

超微粉碎后的浙貝母，其粉體狀態(tài)主要表現(xiàn)為其粉體表面積明顯增大、溶解性的提高更為明顯、分布更加均勻、粒徑尺寸明顯變小、吸附性更加明顯、孔隙率增加更為顯著、親和力上升幅度加大突出，對(duì)其藥效有效成分的溶出明顯有利[22-23]。更有相關(guān)大量文獻(xiàn)報(bào)道顯示，粒徑對(duì)其中藥活性成分溶出和含量的測(cè)定均有明顯變化，本研究及大量相關(guān)文獻(xiàn)也表明，粒徑尺寸越小，浙貝母中各種生物堿的溶出量也會(huì)明顯越高[24-25]。因此，臨床上將浙貝母制成超微粉后能顯著提高貝母辛、貝母素甲、貝母素乙等生物堿的溶出，從而減少用藥量，以達(dá)到高效利用中藥材資源的目的，值得臨床推廣應(yīng)用。