周燕 周萌 彭軍 段瓊紅 陳軍 周美蘭 張云俠 梁軍

2021年我國肺結(jié)核發(fā)病率位居全球第三，為耐多藥結(jié)核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)患者數(shù)最多的7個國家之一，這7個國家的耐多藥/耐藥結(jié)核病患者數(shù)占全球的2/3[1]。MDR-TB治療需藥物種類多、周期長、費用昂貴，已成為我國持續(xù)危害人群健康的重大公共衛(wèi)生問題，闡明其人群傳播機(jī)制對于MDR-TB的防治至關(guān)重要。接觸者調(diào)查是結(jié)核病防控的一項重要措施，家庭接觸是密切接觸中很重要的一種接觸方式。國外文獻(xiàn)報道，MDR-TB患者的家庭密切接觸者傳播MDR-TB的風(fēng)險較高[2]，但國內(nèi)關(guān)于MDR-TB患者家庭密切接觸者傳播的相關(guān)報道較少，武漢市也缺乏MDR-TB在家庭內(nèi)傳播特征的研究，故筆者對武漢市肺結(jié)核定點醫(yī)院登記的耐多藥肺結(jié)核(multidrug-resistant pulmonary tuberculosis， MDR-PTB)患者的家庭密切接觸者進(jìn)行感染、發(fā)病和菌株同源性的檢測，分析MDR-PTB家庭傳播模式，為武漢MDR-PTB精準(zhǔn)防控提供依據(jù)。

對象和方法

一、研究對象

選取2018年7月至2020年6月武漢市肺科醫(yī)院(武漢市肺結(jié)核定點醫(yī)院)登記的全部166例MDR-PTB患者的282名家庭密切接觸者作為研究對象。其中，166例MDR-PTB患者作為本研究中一代病例，282名家庭密切接觸者中發(fā)現(xiàn)的MDR-PTB患者作為二代病例。

二、研究方法

1.密切接觸者：指在一代病例確診前3個月內(nèi)與其居住在同一住宅累計至少7 d的人員，既包括共同使用同一臥室者，也包括僅使用共同的起居室而未使用同一臥室者[3]。

2.二代病例發(fā)現(xiàn)方式：MDR-PTB患者診療信息由專人錄入到中國疾病預(yù)防控制中心“結(jié)核病管理信息系統(tǒng)”。武漢市肺科醫(yī)院專門設(shè)置耐多藥結(jié)核病門診，一醫(yī)一護(hù)專職負(fù)責(zé)建立MDR-PTB患者病案信息。一代病例確診后的1周內(nèi)對家庭密切接觸者進(jìn)行1次面對面的癥狀問診(即在MDR-PTB患者治療隨訪的2年中，家庭密切接觸者有無咳嗽、咳痰及發(fā)熱、盜汗等癥狀)、結(jié)核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test，TST)、胸部X線攝片(簡稱“胸片”)檢查，對有咳嗽咳痰癥狀或TST強(qiáng)陽性或胸片異常者收集痰標(biāo)本，行痰結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌學(xué)檢測(包含抗酸桿菌痰涂片、分枝桿菌培養(yǎng)+菌種鑒定+表型藥物敏感性試驗)，以發(fā)現(xiàn)家庭二代MDR-PTB 病例。其中，TST試驗硬結(jié)平均直徑<5 mm或無反應(yīng)者為陰性，≥5 mm為陽性，≥10 mm即可確定為結(jié)核感染；陽性又分為一般陽性(5 mm≤硬結(jié)平均直徑<10 mm)、中度陽性(10 mm≤硬結(jié)平均直徑<15 mm)和強(qiáng)陽性(硬結(jié)平均直徑≥15 mm或<15 mm但局部出現(xiàn)遷延癥狀)[4-5]。

3.基因分型方法：為了解菌株間同源性，按照達(dá)安基因生物有限公司提供的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的步驟，提取結(jié)核分枝桿菌DNA。采用Khosravi等[6]描述的DTM-PCR分型法進(jìn)行菌株分型；采用MIRU分型方法選取國際標(biāo)準(zhǔn)24位點(MIRU02、Mtub04、ETRC等)，經(jīng)PCR及凝膠電泳[7]后計算基因各位點重復(fù)序列的拷貝數(shù)，獲得一、二代病例所有分離菌株基因分型。

4.其他指標(biāo)：計算家庭密切接觸者結(jié)核分枝桿菌感染率、MDR-PTB發(fā)病例數(shù)和一、二代病例的耐藥表型。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用Excel 2013和SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理和分析。計數(shù)資料以“例(構(gòu)成比/百分率，%)”描述，組間差異的比較采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。將MIRU分型結(jié)果的各位點重復(fù)序列拷貝數(shù)導(dǎo)入MIRU-VNTR在線分析平臺(https://www.miru-vntrplus.org/MIRU/index.faces)，采用非加權(quán)配對算術(shù)平均法(UPMGA)構(gòu)建分離菌株MIRU最小生成樹。

結(jié) 果

一、家庭密切接觸者人口學(xué)特征與結(jié)核感染情況

166例MDR-PTB患者共有282名家庭密切接觸者，平均每例患者家庭密接者1.7名，其中女性居多，占56.74%。年齡分布在3～71歲，平均年齡為(39.3±18.4)歲。282名家庭密接者的TST檢測陰性率、一般陽性率、中度陽性率和強(qiáng)陽性率分別為53.90%、8.51%、10.64%和26.95%；結(jié)核感染率為37.59%(106/282)。家庭密切接觸者人口學(xué)特征及TST檢查結(jié)果見表1。

表1 家庭密切接觸者人口學(xué)特征及結(jié)核菌素皮膚試驗結(jié)果

二、不同性別、年齡家庭密切接觸者感染情況

不同性別、年齡家庭密切接觸者感染率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，具體見表2。

表2 不同特征家庭密切接觸者結(jié)核菌素皮膚試驗情況

三、家庭密切接觸者肺結(jié)核診斷情況

282名家庭密切接觸者中有疑似癥狀者9例(3.19%)；行胸片檢查者274名，胸片異常者8例(2.92%)；對有咳嗽咳痰癥狀或TST強(qiáng)陽性或胸片異常的106例行痰結(jié)核分枝桿菌細(xì)菌學(xué)檢查，其中病原學(xué)陽性者4例(3.77%)，均為MDR-PTB患者，發(fā)病率為1.42%。

四、家庭密切接觸者感染結(jié)核分枝桿菌表型耐藥譜分析

4例二代MDR-PTB患者分布于3個家庭(共計8名密切接觸者)，其中，可能的傳播鏈為父母→子女2對、夫→妻1對、姐→妹1對。比較家庭二代病例與一代病例表型耐藥譜發(fā)現(xiàn)，3例表型耐藥譜相同，1例不同。具體見表3。

表3 家庭一代病例與二代病例基本情況及表型耐藥譜比較

五、家庭二代病例與一代病例基因分型

3個家庭共有3例一代病例和4例二代病例，對收集到的6株結(jié)核分枝桿菌(1株二代病例菌株丟失)進(jìn)行24位點MIRU-VNTR基因分型，結(jié)果顯示，2個家庭4例病例的基因分型結(jié)果完全一致，1個家庭2例病例僅1個位點有差異(圖1)。同時，對3個家庭的6株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行DTM-PCR分型，結(jié)果均為北京株。

圖1 3個家庭的6株結(jié)核分枝桿菌MIRU基因分型結(jié)果

討 論

結(jié)核病的傳播方式主要是近距離飛沫傳播，家庭密切接觸者發(fā)生結(jié)核病的風(fēng)險較大。國內(nèi)關(guān)于涂陽肺結(jié)核患者家庭密切接觸者傳播模式報道較多[8-9]，但關(guān)于MDR-TB家庭密切接觸者傳播機(jī)制的相關(guān)報道較少。本研究對武漢市MDR-PTB患者的家庭密切接觸者進(jìn)行感染、發(fā)病和菌株同源性的觀察，探討MDR-PTB家庭傳播機(jī)制。

本研究中282名家庭密切接觸者的結(jié)核感染率為37.59%，高于Lu等[4]對中國東南部6個城市的研究(28.0%)和韓志英等[10]采用結(jié)核感染T細(xì)胞斑點試驗檢測的21.95%，也高于2000年全國第四次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查人群28.3%的TST陽性率(硬結(jié)平均直徑≥10 mm)[11]。由此可見，本研究MDR-PTB患者家庭密切接觸者的結(jié)核感染率高于普通人群，呈現(xiàn)高感染狀況。國外文獻(xiàn)大多是MDR-TB接觸者結(jié)核病發(fā)病的橫斷面調(diào)查，隨訪的報道比較少[2,12]。MDR-TB患者的家庭密切接觸者中MDR-TB的發(fā)病率較高，Javaid等[2]在對610名家庭密切接觸者的研究中發(fā)現(xiàn)了41例(17.4%)MDR-TB患者，遠(yuǎn)高于本研究中家庭密切接觸者M(jìn)DR-PTB發(fā)病率(1.42%)，這可能與該人群國家為HIV高發(fā)國有關(guān)，而Vella等[12]在對793名密切接觸者的研究中發(fā)現(xiàn)了14例(1.8%)MDR-TB患者，這一結(jié)果與本研究相似，但均遠(yuǎn)高于一般人群的MDR-TB發(fā)病率。

MDR-TB可導(dǎo)致家庭災(zāi)難性支出患者的比例達(dá)到80%，當(dāng)一個家庭出現(xiàn)2例及以上二代MDR-TB病例時會給患者心理及家庭經(jīng)濟(jì)造成巨大傷害[13-14]。本研究中282名家庭密切接觸者發(fā)生MDR-PTB患者4例，分布于3個家庭，其中1個家庭出現(xiàn)3例MDR-PTB患者，且以父母子女間傳播比例最高，其次為夫妻間和兄弟姐妹間傳播，提示家庭接觸是MDR-PTB傳播的高危因素，與姚芳等[8]報道的初治涂陽肺結(jié)核患者家庭接觸者中父母肺結(jié)核檢出率最高一致，但與杜雨華等[9]報道的夫妻間傳播率較高有所差異，但由于樣本量太少，這一傳播機(jī)制還有待大樣本進(jìn)一步證實。對于家庭密切接觸者的發(fā)病風(fēng)險時間，有文獻(xiàn)報道，MDR-TB感染2年內(nèi)發(fā)病的風(fēng)險最高[15]，這與本研究發(fā)現(xiàn)的二代病例與一代病例發(fā)病時間間隔為15 d至12個月，全部二代病例在1年內(nèi)發(fā)病有所不同。故筆者認(rèn)為，對MDR-PTB患者的家庭密切接觸者應(yīng)至少追蹤隨訪1年，以早期發(fā)現(xiàn)家庭二代病例并及時治療。

通過表型藥物敏感性試驗結(jié)合基因分型技術(shù)可確定家庭病例間的傳播鏈。本研究顯示，3例二代病例的表型耐藥譜與一代病例一致，1例不一致。不一致的可能原因為：一是二代病例從其他途徑感染，非家庭內(nèi)傳播；二是雖然是家庭內(nèi)傳播，但也會發(fā)生不同抗結(jié)核藥品藥物敏感性試驗穩(wěn)定性不一致的情況，比如，異煙肼和利福平的穩(wěn)定性最高，其他抗結(jié)核藥品穩(wěn)定性較差，可重復(fù)性也較差，這就可能導(dǎo)致家庭病例之間利福平和異煙肼的耐藥檢測結(jié)果一致，而乙胺丁醇、鏈霉素、卡拉霉素和左氧氟沙星等的表型耐藥譜不一致。本研究中，僅有1例二代病例比一代病例增加了鏈霉素耐藥，認(rèn)為可能是不同的抗結(jié)核藥品藥物敏感性試驗穩(wěn)定性不一致所致。

進(jìn)一步對結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行基因分型，以確定家庭病例分離菌株之間是否有同源性，探索病例之間是否存在傳播鏈。MIRU-VNTR分型方法是一種簡便快速的結(jié)核分枝桿菌基因分型方法，是結(jié)核病分子流行病學(xué)研究中的重要工具，可用于探索結(jié)核病傳播機(jī)制、接觸者調(diào)查和同源性調(diào)查[16]。雖然目前全基因組測序的費用進(jìn)一步降低，使其越來越多地應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌的基因分型，但MIRU-VNTR分型仍然不失為一種低成本且快速的分型方法。MDR-TB家庭內(nèi)傳播基因分型的報道較少，且多為個例或少數(shù)報道。本研究采用國際標(biāo)準(zhǔn)24位點MIRU-VNTR分型，發(fā)現(xiàn)6例MDR-PTB患者中有4例的基因型完全相同，另2例也僅1個位點不同。如果以1個位點以內(nèi)為成簇定義，則可認(rèn)為6例MDR-PTB患者全部為成簇病例，這與Cavany等[17]在配對的結(jié)核病密切接觸者中發(fā)現(xiàn)基因分型成簇率為79%的結(jié)果相似，提示結(jié)核分枝桿菌家庭內(nèi)傳播的可能性極高。

綜上所述，武漢市MDR-PTB患者家庭密切接觸者存在較高的家庭內(nèi)傳播風(fēng)險，應(yīng)當(dāng)對MDR-PTB患者家庭密切接觸者做好宣傳教育、篩查及隨訪，減少MDR-PTB的家庭內(nèi)傳播。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)周燕和周萌：實施研究、數(shù)據(jù)收集、整理及統(tǒng)計分析、撰寫及修改文章；彭軍: 實施研究、數(shù)據(jù)整理及統(tǒng)計分析、撰寫及修改文章：段瓊紅: 查閱文獻(xiàn)、修改文章；陳軍：匹配標(biāo)本，實施細(xì)菌學(xué)、分子生物學(xué)檢測，整理部分?jǐn)?shù)據(jù)；周美蘭：整理部分?jǐn)?shù)據(jù)、查閱文獻(xiàn)、修改文章；張云俠和梁軍：醞釀和設(shè)計實驗、篩選研究對象、查閱文獻(xiàn)、修改文章