曲蕓墨 丁鑫園 閆玫漪 郭曉鵬 孫義成

近年來，感染耐藥結(jié)核分枝桿菌甚至耐多藥結(jié)核分枝桿菌的患者例數(shù)逐漸增加，這使得結(jié)核病的防治遭遇重大挑戰(zhàn)。為了應(yīng)對此挑戰(zhàn)，有必要研發(fā)新型抗結(jié)核疫苗及抗結(jié)核藥物，這需要系統(tǒng)揭示結(jié)核分枝桿菌的基因功能并闡明其致病機(jī)制。分枝桿菌尤其是結(jié)核分枝桿菌的遺傳操作十分困難，傳統(tǒng)的基因組編輯方法如利用穿梭質(zhì)粒[1]、自殺質(zhì)粒[2]和噬菌體轉(zhuǎn)導(dǎo)[3]等工具費(fèi)時(shí)費(fèi)力且效率不高，極大地限制了對結(jié)核分枝桿菌的生物學(xué)研究。

CRISPR-Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats and CRISPR associated protein)即成簇的規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列和 CRISPR 相關(guān)蛋白，是細(xì)菌和古細(xì)菌抵抗病毒等外源遺傳物質(zhì)入侵的一種獲得性免疫系統(tǒng)[4]。CRISPR 簇由眾多短而保守的重復(fù)序列和間隔序列組成。Cas基因一般位于CRISPR序列兩側(cè)，是一類較大的多態(tài)性家族基因。在成熟的單一間隔序列 的crRNA(CRISPR RNA)形成之后, 其會(huì)與Cas蛋白組成一個(gè)復(fù)合物, 基因組上的原間隔序列(protospacer adjacent motif，PAM)可以幫助 crRNA/Cas 復(fù)合物在基因組上精準(zhǔn)定位，而后通過 crRNA 上的間隔序列與靶標(biāo)序列進(jìn)行堿基配對,并引導(dǎo)Cas蛋白或蛋白復(fù)合物對基因片段進(jìn)行剪切，造成DNA雙鏈斷裂(double strands break, DSB)[5]。

近年來，基于CRISPR-Cas開發(fā)的基因工程工具被廣泛應(yīng)用到真核生物和原核生物中，極大地推動(dòng)了功能基因組學(xué)的研究。在分枝桿菌中，CRISPR-Cas相關(guān)的基因工程技術(shù)也得到了快速發(fā)展[6]，包括CRISPR輔助的同源重組基因組編輯、CRISPR輔助的非同源末端連接基因敲除、單堿基編輯技術(shù)和CRISPRi等在內(nèi)的幾種方法的開發(fā)實(shí)現(xiàn)了高效的分枝桿菌基因組編輯和轉(zhuǎn)錄調(diào)控。筆者總結(jié)了近年來幾種CRISPR-Cas輔助的基因組編輯技術(shù)在分枝桿菌中，特別是在結(jié)核分枝桿菌中的發(fā)展過程、應(yīng)用及其優(yōu)缺點(diǎn)(表1)，并對新策略的發(fā)展進(jìn)行了展望。

表1 結(jié)核分枝桿菌中的CRISPR基因組編輯技術(shù)

一、CRISPR-Cas輔助的同源重組基因組編輯技術(shù)

傳統(tǒng)的同源重組(homologous recombination，HR)技術(shù)依賴細(xì)菌本身的 RecA蛋白介導(dǎo)的重組系統(tǒng)，將基因組序列與具有同源序列的外源DNA模板進(jìn)行交換，實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合。但是該方法通常需要很長的同源臂并且重組效率低。針對這一缺陷，van Kessel 等[7]在2007年開發(fā)了一種噬菌體重組蛋白輔助的重組策略，通過在細(xì)菌中高表達(dá)分枝桿菌噬菌體Che9c的gp60蛋白和gp61蛋白來提高重組效率。其中g(shù)p60具有5′～3′雙鏈DNA外切酶活性，而gp61作為單鏈DNA退火蛋白，可以促進(jìn)互補(bǔ)鏈 DNA 的退火、交換和重組。在乙酰胺誘導(dǎo)下同時(shí)表達(dá)這兩個(gè)噬菌體蛋白，可以在恥垢分枝桿菌中實(shí)現(xiàn)高效率基因重組。雖然該方法效率很高，但必須使用抗生素抗性基因來篩選，而抗性基因的去除涉及多個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟，包括利用位點(diǎn)特異性重組酶等，會(huì)使突變株構(gòu)建的工作量增加。

CRISPR-Cas系統(tǒng)可以很好地解決這個(gè)問題，該系統(tǒng)利用人工合成的sgRNA將Cas蛋白引導(dǎo)到靶基因附近，并切割DNA造成雙鏈斷裂。由于Cas蛋白可以持續(xù)切割未發(fā)生編輯的細(xì)菌并使其死亡，直接起到了篩選作用，這樣一來就可以避免抗生素抗性基因的使用，摒棄了去除抗性篩選基因的繁瑣過程，因此，基于CRISPR和重組聯(lián)用技術(shù)的開發(fā)可以成為細(xì)菌基因組編輯的優(yōu)良工具，但是長期以來都沒有成功應(yīng)用于分枝桿菌。Yan等[8]于2017年利用來自弗朗西斯菌(Francisbacteria)的CRISPR-Cas12a系統(tǒng)，結(jié)合噬菌體蛋白gp60和gp61介導(dǎo)的同源重組系統(tǒng)，在恥垢分枝桿菌中實(shí)現(xiàn)了無標(biāo)記的基因組高效編輯，包括基因插入、替換、刪除及連續(xù)刪除等常用基因操作。CRISPR-Cas12a是CRISPR系統(tǒng)中Ⅴ型效應(yīng)蛋白，能夠識(shí)別富含胸腺嘧啶核苷的 PAM 區(qū)(5′-YTN-3′)，并且形成的 CRISPR-Cas12a 復(fù)合物不需要tracrRNA的參與。將Cas12a編碼基因克隆在pJV53質(zhì)粒上，由Pmyc1tetO啟動(dòng)子誘導(dǎo)表達(dá)，靶向目標(biāo)序列的crRNA元件單獨(dú)表達(dá)在一個(gè)溫度敏感型質(zhì)粒上，與帶有同源臂的模板序列同時(shí)轉(zhuǎn)入含有質(zhì)粒pJV53-Cas12a并用乙酰胺提前誘導(dǎo)的恥垢分枝桿菌的感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行基因組編輯。當(dāng)使用59-79nt的單鏈DNA作為修復(fù)模板時(shí)，可以高效的實(shí)現(xiàn)點(diǎn)突變，并可以有效進(jìn)行 1000 bp 以下片段的刪除；當(dāng)使用帶有500 bp雙鏈DNA同源臂作為模板時(shí)，可以進(jìn)行大片段的插入、刪除及替換。此外，傳統(tǒng)重組的方法需要每一步去除抗性篩選基因后再進(jìn)行下一個(gè)基因的敲除，而CRISPR-Cas12a 輔助的重組系統(tǒng)由于輔助質(zhì)粒很容易丟掉，通過交替使用含有不同抗性標(biāo)簽的 crRNA 質(zhì)粒能夠方便快捷地進(jìn)行連續(xù)敲除，因此可以更方便地構(gòu)建多個(gè)基因敲除的菌株。然而由于重組效率等方面的限制，目前該技術(shù)尚無法應(yīng)用于包括結(jié)核分枝桿菌在內(nèi)的其他分枝桿菌的基因組編輯。

二、CRISPR-Cas輔助的非同源末端連接基因組編輯技術(shù)

除了HR以外，非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)修復(fù)也是細(xì)胞內(nèi)DSB的主要修復(fù)途徑之一[9]。相比于同源重組，NHEJ更易于在DSB位點(diǎn)發(fā)生插入和(或)刪除突變，并產(chǎn)生破壞目標(biāo)基因的移碼突變。但與真核生物的修復(fù)途徑相比，大多數(shù)細(xì)菌缺乏內(nèi)源 NHEJ 修復(fù)系統(tǒng)，主要通過 HR 途徑對 DSB 修復(fù)[10]。目前發(fā)現(xiàn)少數(shù)細(xì)菌如分枝桿菌、銅綠假單胞菌和枯草芽孢桿菌等具有NHEJ修復(fù)通路。在2017年以前尚不能利用HR或NHEJ系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)高效的結(jié)核分枝桿菌基因組編輯，因此當(dāng)HR編輯暫時(shí)無法實(shí)現(xiàn)時(shí)，NHEJ系統(tǒng)的優(yōu)化應(yīng)用以實(shí)現(xiàn)高效基因敲除一直是研究人員重點(diǎn)關(guān)注的方向。Sun等[11]發(fā)現(xiàn)在恥垢分枝桿菌中利用Cas12a進(jìn)行基因組剪切可以被 NHEJ系統(tǒng)修復(fù)，由此實(shí)現(xiàn)基因組編輯。但是該方法只能在恥垢分枝桿菌中發(fā)揮作用，而且效率較低。Yan等[12]發(fā)現(xiàn)Cas12a剪切引起的DSB在海分枝桿菌中也可以被NHEJ修復(fù)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，海分枝桿菌中除kuC基因和ligD基因外，位于這兩個(gè)基因之間的nrgA基因也可能參與了NHEJ修復(fù)。當(dāng)將海分枝桿菌的NHEJ系統(tǒng)在恥垢分枝桿菌中異源高表達(dá)，聯(lián)合CRISPR-Cas12a系統(tǒng)可以在恥垢分枝桿菌中發(fā)生基因組編輯，然而效率比較低。有研究顯示，通過抑制RecA介導(dǎo)的同源重組途徑，可以增加NHEJ修復(fù)的效率[13]。因此，通過在恥垢分枝桿菌中高表達(dá)RecA的抑制蛋白R(shí)ecX或者其顯性負(fù)性突變體RecAR60C抑制RecA介導(dǎo)的同源重組，同時(shí)高表達(dá)海分枝桿菌NHEJ系統(tǒng)，結(jié)合 CRISPR-Cas12a或者CRISPR-Cas9sth1(StreptococcusthermophilusCas9)系統(tǒng)可以在恥垢分枝桿菌實(shí)現(xiàn)高效的基因組編輯。進(jìn)一步將該優(yōu)化后的CRISPR-NHEJ系統(tǒng)應(yīng)用到結(jié)核分枝桿菌中，通過高表達(dá)海分枝桿菌NHEJ系統(tǒng)、抑制RecA依賴的的同源重組修復(fù)途徑，以及在穩(wěn)定期產(chǎn)生DSB等方面的優(yōu)化改進(jìn)增強(qiáng)NHEJ的修復(fù)效率，利用CRISPR-Cas9sth1實(shí)現(xiàn)高效的基因組編輯。同時(shí)，進(jìn)一步通過使用成對的sgRNA還在結(jié)核分枝桿菌中實(shí)現(xiàn)了大片段刪除和雙基因的同時(shí)敲除，可以在N+ 2個(gè)月內(nèi)產(chǎn)生N個(gè)突變，而傳統(tǒng)方法通常需要4N個(gè)月或更長時(shí)間，該方法為在這種緩慢生長的結(jié)核分枝桿菌中研究多個(gè)基因的功能提供了便利。

CRISPR-NHEJ技術(shù)在結(jié)核分枝桿菌中成功實(shí)現(xiàn)高效的基因組編輯，使得結(jié)核分枝桿菌突變文庫的構(gòu)建及應(yīng)用成為可能。基于這項(xiàng)技術(shù)，我們利用該系統(tǒng)構(gòu)建了一個(gè)針對結(jié)核分枝桿菌毒素-抗毒素系統(tǒng)的小型突變體庫[12]。選擇了44個(gè)毒素基因，共設(shè)計(jì)88個(gè)sgRNA，隨后將其轉(zhuǎn)到含有RecX輔助質(zhì)粒和NHEJ相關(guān)元件的結(jié)核分枝桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，最終一次轉(zhuǎn)化可以得到3×104個(gè)轉(zhuǎn)化子，其中大約85%的轉(zhuǎn)化子發(fā)生基因組編輯?？梢?，可以利用此技術(shù)構(gòu)建結(jié)核分枝桿菌的全基因組CRISPR突變文庫，用于結(jié)核分枝桿菌的功能基因組學(xué)研究。

三、基于CRISPR系統(tǒng)的單堿基編輯技術(shù)

基于CRISPR-Cas系統(tǒng)輔助的重組的方法可以在恥垢分枝桿菌中實(shí)現(xiàn)基因的點(diǎn)突變[8]，但是該系統(tǒng)尚無法在結(jié)核分枝桿菌中應(yīng)用。近年來，另一種基于CRISPR的基因組編輯方法——單堿基編輯技術(shù)的開發(fā)為精確的基因操作提供了一種不需要引入DSB或供體DNA模板的新策略[14-15]。單堿基編輯系統(tǒng)主要包括胞嘧啶堿基編輯器和腺嘌呤堿基編輯器。胞嘧啶堿基編輯器由一個(gè)催化活性受損的Cas核酸酶、胞苷脫氨酶和尿嘧啶DNA糖基化酶抑制劑組成。核酸酶活性缺陷的Cas蛋白不能對DNA造成雙鏈斷裂，但能夠?qū)⒚摪泵付ㄎ坏桨袠?biāo)基因，脫氨酶隨后在 PAM 位點(diǎn)附近的一個(gè)小編輯窗口區(qū)內(nèi)將胞嘧啶轉(zhuǎn)化為尿嘧啶，由此產(chǎn)生的錯(cuò)配雙鏈DNA可以通過修復(fù)機(jī)制進(jìn)行修復(fù)，從而實(shí)現(xiàn)胞嘧啶到胸腺嘧啶的精確單堿基替換[16]。此外，通過催化特殊密碼子(CAA、CAG、CGA 或 TGG)的轉(zhuǎn)換，CBE可用于通過生成提前終止密碼子來破壞目標(biāo)基因。

Ding等[17]將胞嘧啶堿基編輯技術(shù)應(yīng)用于恥垢分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌中，可以實(shí)現(xiàn)對結(jié)核分枝桿菌的基因進(jìn)行定點(diǎn)突變。首先構(gòu)建一個(gè)堿基編輯器質(zhì)粒pCBE，該質(zhì)粒主要表達(dá)來自嗜熱鏈球菌的核酸酶活性受損的nCas9sth1、胞苷脫氨酶APOBEC1和UGI形成的融合蛋白以及sgRNA作用元件。將pCBE單獨(dú)轉(zhuǎn)進(jìn)恥垢分枝桿菌中進(jìn)行基因組編輯時(shí)，僅有約10%的基因組編輯效率，并且在結(jié)核分枝桿菌中無法實(shí)現(xiàn)基因組編輯。作者推測細(xì)菌DNA修復(fù)通路，如同源重組和錯(cuò)配修復(fù)等可能干擾了單堿基編輯系統(tǒng)的作用。為此，通過高表達(dá)RecX抑制RecA介導(dǎo)的同源重組修復(fù)途徑，在恥垢分枝桿菌中可以取得90%以上的單堿基編輯的效率。在結(jié)核分枝桿菌中，作者通過高表達(dá)RecX抑制同源重組修復(fù)途徑，并進(jìn)一步通過高表達(dá)錯(cuò)配修復(fù)蛋白NucS的顯性負(fù)性突變體抑制錯(cuò)配修復(fù)途徑，應(yīng)用胞嘧啶堿基編輯系統(tǒng)，成功實(shí)現(xiàn)了在結(jié)核分枝桿菌基因組中進(jìn)行胞嘧啶到胸腺嘧啶的堿基替換，效率為12.5%～75%。進(jìn)一步利用該方法構(gòu)建的katG突變株在異煙肼藥物敏感性試驗(yàn)中表現(xiàn)出相比于野生型更高的耐藥性，驗(yàn)證了單堿基編輯技術(shù)在探究細(xì)菌耐藥方面的作用。

四、基于CRISPRi的基因表達(dá)調(diào)控

CRISPR-Cas輔助的同源重組和非同源末端連接技術(shù)可以對分枝桿菌實(shí)現(xiàn)高效的基因組編輯，但是這些方法不適合用于研究必需基因。CRISPR interference (CRISPRi)提供了一種簡單且高效的基因表達(dá)調(diào)控策略。在CRISPRi中，Cas9 的2個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域RuvC和 HNH的突變(即dCas9)破壞了該酶的催化活性，但保留了其 RNA 引導(dǎo)的 DNA 靶向能力。dCas9-sgRNA復(fù)合物通過結(jié)合到目標(biāo)基因上干擾其轉(zhuǎn)錄的延伸，從而導(dǎo)致序列特異性基因表達(dá)沉默[18]。

最開始用于分枝桿菌基因表達(dá)調(diào)控的CRISPRi系統(tǒng)使用的是來自化膿性鏈球菌的dCas9(dCas9spy)[19-21]。當(dāng)將誘導(dǎo)表達(dá)dCas9spy的質(zhì)粒和誘導(dǎo)表達(dá)靶向目標(biāo)序列的sgRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)進(jìn)恥垢分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌后，檢測結(jié)果顯示最高可以抑制目標(biāo)基因表達(dá)的效率較低，而一些分枝桿菌基因需要高水平的抑制才能展現(xiàn)出相應(yīng)表型，而且高表達(dá)Cas9spy對分枝桿菌生長有抑制作用。因此，為了開發(fā)更高效的CRISPRi系統(tǒng)，2017年Rock等[22]通過篩選來自不同種類細(xì)菌的CRISPR-dCas系統(tǒng)，并將密碼子優(yōu)化的dCas9-sgRNA和其他元件表達(dá)在一個(gè)質(zhì)粒上，轉(zhuǎn)進(jìn)分枝桿菌中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄抑制實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示來自嗜熱鏈球菌的CRISPR-dCas9(dCas9sth)展現(xiàn)了強(qiáng)大的基因沉默能力，通?？梢詫?shí)現(xiàn)內(nèi)源性基因表達(dá)20～100倍的抑制，且蛋白毒性較小。這項(xiàng)發(fā)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了在恥垢分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌中的大范圍應(yīng)用[23-25]。McNeil等[23]利用該系統(tǒng)，研究了分枝桿菌葉酸生物合成途徑基因的協(xié)同作用，并結(jié)合靶標(biāo)兩個(gè)相關(guān)基因的小分子藥物，表明CRISPRi系統(tǒng)可以用于化學(xué)-遺傳的相互作用研究。Adolph等[24]在2022年也利用CRISPRi分別抑制了sdhA1、sdhA2和frdA的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)基因的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)sdhA1和sdhA2在琥珀酸氧化中功能冗余，只有同時(shí)抑制sdhA1和sdhA2的表達(dá)才能抑制結(jié)核分枝桿菌中的琥珀酸氧化。這些結(jié)果表明CRISPRi不僅可以方便研究結(jié)核分枝桿菌中的單個(gè)基因，而且可以用于研究多個(gè)基因的協(xié)同作用，為結(jié)核分枝桿菌生物學(xué)功能的研究提供了便利。

五、CRISPR-Cas系統(tǒng)在分枝桿菌高通量篩選中的應(yīng)用

相比于其他高通量篩選技術(shù)，CRISPR文庫篩選具有方便、可靠、易分析等多種優(yōu)點(diǎn)，逐漸在生物學(xué)研究中得到廣泛應(yīng)用，而CRISPR文庫篩選最近也應(yīng)用于結(jié)核分枝桿菌研究。抑制必需基因的化合物，往往不能取得殺菌成效。其中一個(gè)重要原因?yàn)橛行┗衔镏荒懿糠忠种瓢袠?biāo)基因功能，而某些被抑制的靶標(biāo)基因其僅存的一點(diǎn)功能足以維持細(xì)菌生長。因此，好的藥物靶標(biāo)不僅是必需的基因，還應(yīng)該是“脆弱的”基因，即被部分抑制就能造成細(xì)菌適應(yīng)性明顯下降。為了量化分枝桿菌基因的“脆弱性”， Bosch等[19]在2021年基于dCas9sth的全基因組CRISPRi篩選方法，利用不同PAM序列和不同sgRNA長度產(chǎn)生的抑制效率的差異來調(diào)控基因表達(dá)水平，分析了殺死細(xì)菌每個(gè)基因需要被抑制的程度。利用該方法，Bosch等量化了結(jié)核分枝桿菌和恥垢分枝桿菌中必需基因的脆弱性，并使用這些結(jié)果來確定分枝桿菌生理學(xué)中的限速步驟和鑒定潛在的藥物靶點(diǎn)[19]，這為抗結(jié)核藥物的開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。此外，一些小型文庫也被構(gòu)建用于在各種條件下篩選與表型相關(guān)的基因。例如，McNeil等[23]在恥垢分枝桿菌中成功構(gòu)建了同時(shí)靶向參與細(xì)菌呼吸的基因的兩兩組合的CRISPRi文庫，用于確定呼吸復(fù)合物之間的合成致死和協(xié)同相互作用。與此同時(shí)，在感染模型中，Babunovic等[26]還利用CRISPRi技術(shù)篩選出了在全反式維A酸(ATRA)激活的巨噬細(xì)胞中，結(jié)核分枝桿菌生存所必需的基因。除了利用該系統(tǒng)進(jìn)行篩選，McNeil和Cook[27]還證明了在快速驗(yàn)證藥物靶點(diǎn)重要性上CRISPRi技術(shù)也有著很大優(yōu)勢。

目前，耐藥結(jié)核病患者例數(shù)的逐漸增加引起科學(xué)家的重點(diǎn)關(guān)注，為了找到更多的藥物及藥物靶點(diǎn)，Li等[28]在2022年將研究目標(biāo)鎖定在利用CRISPRi技術(shù)探究影響已有抗結(jié)核藥物的化學(xué)-基因相互作用。研究人員構(gòu)建了幾乎覆蓋所有結(jié)核分枝桿菌基因的CRISPRi文庫，并用9種藥物(包括7種抗結(jié)核臨床代表藥物和2種非結(jié)核藥物)通過化學(xué)-遺傳相互作用進(jìn)行篩選，測序分析sgRNA豐度進(jìn)而確定相關(guān)基因。首先發(fā)現(xiàn)利福平、萬古霉素和貝達(dá)喹啉的常見致敏靶點(diǎn)是結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞膜的主要成分分枝菌酸-阿拉伯半乳糖苷-肽聚糖(mAGP)復(fù)合物，mAGP可能會(huì)通過改變胞膜通透性來影響藥物殺菌作用。隨后篩選了靶向核糖體的藥物耐藥的相關(guān)性位點(diǎn)，結(jié)果提示核糖體甲基轉(zhuǎn)移酶TsnR很可能與利奈唑胺耐藥有關(guān)。該研究還發(fā)現(xiàn)ettA的突變會(huì)導(dǎo)致結(jié)核分枝桿菌對多種抗結(jié)核藥物低水平耐藥[28]，這可能是南美等多個(gè)國家多耐藥結(jié)核病暴發(fā)的原因之一。此外，還發(fā)現(xiàn)氨基糖苷類等多種藥物未知的潛在耐藥機(jī)制，甚至首次發(fā)現(xiàn)了一類針對大環(huán)內(nèi)酯類藥物獲得性敏感的結(jié)核分枝桿菌亞系，提出可以采用克拉霉素對這些菌株進(jìn)行抗結(jié)核治療。采取同樣的策略，Poulton等[29]也利用了CRISPRi篩選技術(shù)分析了PBTZ169的化學(xué)-遺傳相互作用。PBTZ169是一種具有較大應(yīng)用前景的苯并噻嗪酮類抗結(jié)核藥物，作用靶點(diǎn)是參與結(jié)核分枝桿菌阿拉伯半乳聚糖合成的酶亞基DprE1。篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)，負(fù)向調(diào)控編碼外排泵基因mmpS5-mmpL5的rv0678基因的抑制導(dǎo)致PBTZ169耐藥。Poulton等[29]進(jìn)一步利用rv0678突變株和mmpS5-mmpL5突變株進(jìn)行耐藥機(jī)制的驗(yàn)證，最終證明rv0678突變的確與PBTZ169和另一種苯并噻嗪酮類抗結(jié)核藥物BTZ043耐藥相關(guān)。這一結(jié)果提示，在PBTZ169和BTZ043臨床試驗(yàn)中監(jiān)測臨床rv0678突變菌株的感染率的重要性，也進(jìn)一步體現(xiàn)了利用CRISPRi系統(tǒng)高通量篩選的有效性及可靠性。

雖然CRISPR 敲除 (CRISPR-knockout, CRISPR-KO)在真核生物的高通量篩選中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，然而由于在細(xì)菌等原核生物中敲除效率較低，在細(xì)菌中尚未得到大范圍的應(yīng)用。Yan等[30]在前期研究中建立的CRISPR-NHEJ基因組編輯具有操作簡單、高效的特點(diǎn)，在2022年利用該技術(shù)成功構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌全基因組范圍內(nèi)的CRISPR-KO文庫。該文同時(shí)參考Rock等[22]的研究構(gòu)建了結(jié)核分枝桿菌的CRISPRi文庫，將這兩個(gè)文庫組合應(yīng)用，首先分析了結(jié)核分枝桿菌的必需基因。研究結(jié)果證實(shí)了CRISPR-KO文庫篩選的可靠性，同時(shí)發(fā)現(xiàn)CRISPR-KO和CRISPRi文庫篩選各自具有獨(dú)特的優(yōu)勢和不足。CRISPRi文庫篩選對于下游基因具有極性效應(yīng)，如果在某個(gè)必需基因的下游存在非必需基因，那么該非必需基因很有可能會(huì)被誤認(rèn)為是必需基因，而CRISPR-KO在篩選中則不會(huì)出現(xiàn)這個(gè)現(xiàn)象。利用CRISPRi抑制基因表達(dá)時(shí)具有靶向鏈的選擇性，只有當(dāng)靶向非模板鏈時(shí)才能表現(xiàn)出較好的抑制作用，而CRISPR-KO沒有這方面的限制。文庫的實(shí)際構(gòu)建中一般不能實(shí)現(xiàn)百分之百的全覆蓋，當(dāng)CRISPR文庫無法完全覆蓋時(shí)，CRISPRi可能會(huì)將缺失的必需基因識(shí)別為非必需基因，而CRISPR-KO可能將非必需基因識(shí)別為必需基因。所以，這些性質(zhì)表明兩者在篩選方面有著各自的優(yōu)勢和不足，將他們聯(lián)合應(yīng)用將得到更全面、可靠的篩選結(jié)果。該研究進(jìn)一步利用這兩個(gè)文庫進(jìn)行了抗結(jié)核藥物貝達(dá)喹啉的化學(xué)-遺傳相互作用的研究(圖1)。首先構(gòu)建了覆蓋全基因組的CRISPRi和CRISPR-KO的結(jié)核分枝桿菌文庫，抗結(jié)核藥物貝達(dá)喹啉處理后，通過二代測序分析文庫中sgRNA的豐度，分析確定影響貝達(dá)喹啉殺菌能力的基因，具體見圖1。測序結(jié)果發(fā)現(xiàn)數(shù)十個(gè)與貝達(dá)喹啉耐藥性或者是易感性相關(guān)的基因，包括已知的編碼外排泵的基因mmpS5-mmpL5和貝達(dá)喹啉靶標(biāo)的ATP合成相關(guān)通路的基因。整體分析結(jié)果表明，CRISPRi文庫在篩選能影響貝達(dá)喹啉殺菌的必需基因時(shí)更有優(yōu)勢，而CRISPR-KO文庫在篩選能影響貝達(dá)喹啉殺菌的非必需基因時(shí)更加靈敏。挑選具有小分子抑制劑的2個(gè)基因topA和lprG，通過突變株構(gòu)建，驗(yàn)證了2個(gè)篩選得到的基因topA、lprG影響貝達(dá)喹啉殺菌能力；通過藥物協(xié)同殺菌實(shí)驗(yàn)等，發(fā)現(xiàn)這2個(gè)基因的靶標(biāo)小分子AMSA、LB04-Ⅲ確實(shí)與貝達(dá)喹啉具有協(xié)同殺菌作用。根據(jù)研究結(jié)果初步揭示了這些影響貝達(dá)喹啉殺菌的相關(guān)基因作用機(jī)制。這項(xiàng)研究說明組合CRISPR文庫篩選，能夠互補(bǔ)各自的缺點(diǎn)，整合兩種篩選系統(tǒng)的優(yōu)勢，能更加全面地了解結(jié)核分枝桿菌內(nèi)部的生物學(xué)過程，并在未來應(yīng)用于更多細(xì)菌中的高通量研究。

圖1 利用CRISPRi與CRISPR-KO組合文庫研究化學(xué)-基因相互作用研究

六、總結(jié)與展望

如今結(jié)核病對人類社會(huì)還存在著很大威脅，迫切需要進(jìn)一步加深對結(jié)核分枝桿菌生理、毒力和耐藥等相關(guān)基因的研究和認(rèn)識(shí)，開發(fā)新的抗結(jié)核藥物或疫苗。CRISPRi技術(shù)憑借著簡單、快速和低成本等優(yōu)點(diǎn)展現(xiàn)出很大應(yīng)用潛力和優(yōu)勢，使得必需基因的研究成為可能。CRISPR-NHEJ介導(dǎo)的基因組編輯技術(shù)使分枝桿菌突變體的構(gòu)建更加簡單、快捷，這進(jìn)一步方便了分枝桿菌相關(guān)基因的生物學(xué)功能研究?；贑RISPR的CRISPR-KO和CRISPRi突變文庫的高通量篩選的應(yīng)用將極大促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌功能基因組學(xué)的相關(guān)研究。

目前，CRISPR輔助的同源重組技術(shù)雖然可用于恥垢分枝桿菌基因組的基因組編輯，但是該系統(tǒng)尚無法成功應(yīng)用到結(jié)核分枝桿菌中，這在未來值得進(jìn)一步改進(jìn)和探究。此外，雖然目前單堿基編輯器在恥垢分枝桿菌中實(shí)現(xiàn)高效率的基因組編輯，但是其在結(jié)核分枝桿菌中的編輯效率較低，這項(xiàng)技術(shù)還有待于進(jìn)一步的優(yōu)化和改造。

綜上，基于CRISPR的結(jié)核分枝桿菌基因組編輯技術(shù)的開發(fā)及優(yōu)化研究，將極大促進(jìn)結(jié)核分枝桿菌的基礎(chǔ)研究，加深對結(jié)核分枝桿菌基本生物學(xué)功能的認(rèn)識(shí)，有助于抗結(jié)核藥物及疫苗的研發(fā)，由此為結(jié)核病的防治策略提供理論依據(jù)和重要技術(shù)支持。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)曲蕓墨和丁鑫園：查閱文獻(xiàn)、整理資料和撰寫文稿；閆玫漪和郭曉鵬：文稿修改和編輯；孫義成：文章概念提出、資金支持、文稿修訂和審核