薛勇 吳雪瓊

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染，機體免疫力抵抗不過MTB的毒力，從而發(fā)病。傳統(tǒng)意義上，我們一直認為結(jié)核病是一種MTB感染引起的感染性疾病。隨著近些年對結(jié)核病患者的相關(guān)免疫指標(biāo)的監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病患者存在不同程度上的免疫功能受損，例如結(jié)核病患者的外周血CD4+T淋巴細胞的計數(shù)較健康對照組下降等。這些發(fā)現(xiàn)讓我們認識到結(jié)核病也是一種免疫性疾病。在對這些免疫功能的監(jiān)測中，逐步發(fā)現(xiàn)，對于這些免疫功能指標(biāo)的解讀存在一定的差異，這些差異一定程度上影響到臨床醫(yī)師對結(jié)核病患者進行免疫治療的決策。為此，中國人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心、《中國防癆雜志》編輯委員會、中國醫(yī)療保健國際交流促進會結(jié)核病防治分會基礎(chǔ)和臨床學(xué)部聯(lián)合組織專家擬定《活動性結(jié)核病患者免疫功能狀態(tài)評估和免疫治療專家共識(2021年版)》(以下簡稱《共識》)[1]。本《共識》主要由結(jié)核病患者進行免疫監(jiān)測和免疫治療相關(guān)的有較高可信度的證據(jù)達成，對一些研究較少，可信度一般或較低的相關(guān)信息沒有納入。筆者本次對《共識》進行解讀，希望可以在《共識》的基礎(chǔ)上為讀者帶來更多研究成果，豐富讀者對結(jié)核病患者的免疫功能評估和免疫治療的認識，同時，希望未來可以得到更多的研究與應(yīng)用，提供更多的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，以供未來《共識》修訂時使用。

一、免疫功能評價方法的新進展

《共識》中推薦的結(jié)核病患者免疫功能狀態(tài)評估方法主要是目前臨床常用的結(jié)核病免疫檢測方法，一方面可輔助結(jié)核病診斷，另一方面可了解結(jié)核病患者的免疫細胞數(shù)量和免疫功能的變化。近年來，免疫功能評價研究取得的新進展將為臨床患者提供更多可用的評估指標(biāo)。

1.血常規(guī)：血常規(guī)是每例患者就診時必查的項目，《共識》中推薦從血常規(guī)中可了解結(jié)核病患者外周血淋巴細胞和單核細胞計數(shù)和百分比，可了解適應(yīng)性免疫和固有免疫細胞的數(shù)量，初步判斷患者是否存在免疫細胞減少。結(jié)核病患者淋巴細胞計數(shù)和百分比通?？赡艿陀趨⒖挤秶孪?；而結(jié)核病會使骨髓中單核細胞的產(chǎn)生和釋放增加，導(dǎo)致單核細胞計數(shù)升高，在免疫細胞耗竭時才會低于參考范圍下限。此外，近年研究發(fā)現(xiàn)，外周血中性粒細胞/淋巴細胞的比值可能反映結(jié)核病患者肺部的空洞情況[2]。Jeon等[3]報道結(jié)核病患者中性粒細胞/(淋巴細胞+單核細胞)比值、單核細胞/淋巴細胞比值、血小板/淋巴細胞比值較非結(jié)核肺部疾病組明顯降低。這些新的指標(biāo)在臨床診斷和鑒別診斷中的應(yīng)用價值仍待探索，但一定程度上可以輔助了解患者的免疫功能。

2.淋巴細胞亞群及其細胞因子：國內(nèi)已經(jīng)對淋巴細胞亞群檢測達成了一定共識，詳見《結(jié)核病患者外周血淋巴細胞亞群檢測及臨床應(yīng)用專家共識》[4]。目前，國內(nèi)部分實驗室仍只檢測淋巴細胞亞群的百分比，不檢測絕對計數(shù)，容易對部分淋巴細胞亞群計數(shù)減少造成漏檢，從而影響臨床醫(yī)生對患者免疫狀態(tài)的評估。此外，目前絕大多數(shù)實驗室只檢測外周血T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、自然殺傷(NK)細胞、NKT細胞、B細胞百分比及絕對計數(shù)，缺乏對它們的精細分型檢測。

外周血中單核細胞可通過CD14和CD16分為經(jīng)典單核細胞(CD14++CD16-)、中間單核細胞(CD14+CD16+)和非經(jīng)典單核細胞(CD14-CD16++)。經(jīng)典單核細胞有助于宿主的促炎防御機制，中間單核細胞與抗原遞呈相關(guān)，非經(jīng)典單核細胞在血管巡邏和監(jiān)視中發(fā)揮作用[5]。結(jié)核病患者外周血中經(jīng)典單核細胞比例減少，而中間和非經(jīng)典單核細胞比例較健康組增高[6]。

CD4+T細胞通過其被抗原刺激后產(chǎn)生細胞因子的不同分為1型輔助性T細胞(helper T cell 1，Th1)、Th2、Th17、Th22等亞群；CD8+T細胞通過其被抗原刺激后產(chǎn)生細胞因子的不同分為1型細胞毒性T細胞(cytotoxic T lymphocyle 1，Tc1)、Tc2等亞群；Th1細胞主要分泌γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白細胞介素-2(interleukin-2，IL-2)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)，通過這些細胞因子增強細胞免疫，來抵抗胞內(nèi)病原體的感染。Th2細胞通過分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等，輔助B細胞活化發(fā)揮體液免疫，同時抑制Th1增殖[7]。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病患者的Th1/Th2比值較健康對照組明顯下降，說明結(jié)核病患者的Th1/Th2平衡被破壞，造成一種免疫抑制狀態(tài)[8]。Th17細胞主要分泌IL-17和IL-22，參與固有免疫和某些炎癥。調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)與Th17相反，主要發(fā)揮負向的免疫調(diào)控。在抗結(jié)核感染中，Th17可以通過趨化中性粒細胞，來促進肉芽腫的形成，Treg在結(jié)核感染初期可通過抑制T細胞激活來抑制適應(yīng)性免疫應(yīng)答的發(fā)揮。結(jié)核病患者的外周血中Th17和Treg比例均較健康組升高。在結(jié)核性胸膜炎患者的胸腔積液中也觀察到Th17/Treg的失衡。初治和復(fù)治結(jié)核病患者外周血中CD4+Foxp3+Treg細胞的比例較健康對照組升高，并且敏感結(jié)核病患者外周血中CD4+Foxp3+Treg細胞的比例較耐多藥結(jié)核病患者升高，痰涂片陽性結(jié)核病患者外周血中CD4+Foxp3+Treg細胞的比例較痰涂片陰性結(jié)核病患者升高[9]。這說明結(jié)核病患者處于免疫抑制狀態(tài)，這種狀態(tài)可能不利于抗結(jié)核免疫[6]。

近年來，越來越多的研究關(guān)注于結(jié)核病患者中協(xié)同產(chǎn)生TNF-α、IL-2和IFN-γ的多功能T細胞，它們可能在結(jié)核病發(fā)病機制中具有保護作用。活動性結(jié)核病患者TNF-α+IL-2+IFN-γ+多功能CD4+T細胞和多功能CD8+T細胞的頻率明顯高于結(jié)核分枝桿菌潛伏感染(latent tuberculosis infection，LTBI)人群，肺結(jié)核治愈后減少，有較高比例的IFN-γ單因子表達CD4+T細胞和IL2+IFN-γ+CD4+T細胞[10]。

根據(jù)CD45RA和CC趨化因子受體7(CC chemokine receptor 7，CCR7)的表達，可將T細胞分為下列4種類型：CD45RA-CCR7-效應(yīng)記憶T細胞、CD45RA-CCR7+中央記憶T細胞、CD45RA+CCR7-終末分化T細胞和CD45RA+CCR7+純真T細胞。效應(yīng)記憶T細胞比終末分化T細胞處于更高分化階段，在受到抗原刺激后，可以立即產(chǎn)生免疫效應(yīng)，快速釋放細胞因子并啟動效應(yīng)功能[11-12]。LTBI人群、治愈的肺結(jié)核和活動性肺結(jié)核患者的IFN-γ+CD4+T細胞主要為效應(yīng)記憶T細胞(CD45RA-CCR7-)，但LTBI人群和治愈的肺結(jié)核患者終末分化T細胞(CD45RA+CCR7-)數(shù)多于活動性肺結(jié)核患者，這表明效應(yīng)記憶T細胞可能為肺結(jié)核患者提供保護作用；在IFN-γ+CD8+T細胞中，活動性肺結(jié)核患者也主要由CD45RA-CCR7-組成，而LTBI人群主要為CD45RA+CCR7-細胞[10]，終末分化T細胞與疾病的嚴重程度呈負相關(guān)，具有肺歸巢和細胞毒性潛力，表明它具有抗結(jié)核作用。CD4+T細胞表面的人類白細胞DR抗原(human leukocyle antigen，HLA-DR)和CD38等標(biāo)志物可反映T細胞的活化狀態(tài)。菌陽肺結(jié)核患者經(jīng)過8周治療后，痰菌陰轉(zhuǎn)患者的外周血中HLA-DR+和CD38+細胞在結(jié)核菌素純蛋白衍生物(purified protein derivative，PPD)特異性CD4+T細胞的比例明顯下降，可能可以作為判斷患者治療有效性的指標(biāo)[13]?；顒有越Y(jié)核病患者外周血MTB特異性CD4+IFN-γ+T細胞上活化標(biāo)志物HLA-DR和CD38，以及增殖標(biāo)志物增殖細胞核抗原(nuclear associated antigen Ki-67，Ki-67)的表達較LTBI人群升高[14-15]。活動性結(jié)核病患者外周血T細胞上活化標(biāo)志物HLA-DR的表達和Treg的比例較LTBI 和健康人群升高[16]。耐多藥肺結(jié)核患者外周血T細胞上活化標(biāo)志物HLA-DR的表達較普通肺結(jié)核患者下降[17]。結(jié)核病患者CD4+T細胞和CD8+T細胞上CD28的表達較健康對照組下降[18]。這說明結(jié)核病患者處于一種免疫異常活化狀態(tài)。

CD27是一種跨膜糖蛋白，也是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，主要表達于淋巴細胞(包括各種類型T細胞、B細胞和NK細胞)。CD27通常作為T細胞激活和炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物，隨著T細胞從幼稚或記憶過渡到效應(yīng)細胞，其表達逐漸喪失。因此，CD27在中央記憶T細胞上表達，在效應(yīng)記憶T細胞上也有不同程度的表達，而在終端效應(yīng)記憶T細胞上不表達。CD4+T細胞在控制MTB感染方面發(fā)揮重要作用，而CD4+CD27-T細胞主要是終端效應(yīng)記憶細胞、效應(yīng)記憶細胞和效應(yīng)細胞，它們發(fā)揮最快和最強的激活效應(yīng)反應(yīng)[19]。然而，該亞群也最有可能因為活化而誘導(dǎo)細胞死亡，并會因為體內(nèi)抗原持續(xù)的刺激而耗竭，其頻率降低。免疫系統(tǒng)的激活和炎癥反應(yīng)在結(jié)核病的免疫發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用?；顒有越Y(jié)核病患者T細胞的總體免疫反應(yīng)性普遍降低，治療后恢復(fù)?；顒有越Y(jié)核病患者外周血CD4+T細胞和CD8+T細胞和NK細胞的IFN-γ分泌能力均較LTBI和健康對照組明顯下降[20]，說明結(jié)核病患者的T細胞和NK細胞的功能下降。結(jié)核病患者治療2個月后，外周血CD4+CD27-T細胞亞群上活化標(biāo)志物IFN-γ、TNF-α、CD38和Ki67水平的表達較治療前明顯下降，可能是由于細菌負荷減少所致；而CD4+CD27+T細胞亞群上活化標(biāo)志物HLA-DR表達較治療前明顯升高，可能是Treg減少引起的。此外，早期分泌抗原靶6-培養(yǎng)濾液蛋白10(ESAT6-CFP10)刺激后細胞因子反應(yīng)較治療前明顯減少，但豆蔻酰佛波醇乙酯刺激后細胞因子反應(yīng)較治療前明顯增加。與PPD刺激的快速應(yīng)答者相比，慢應(yīng)答者產(chǎn)生IFN-γ的CD8+CD27-T細胞明顯更多。若治療前CD8+CD27-T細胞高水平表達IFN-γ，治療2個月時通常預(yù)示培養(yǎng)陽性的風(fēng)險較高。CD4+和CD8+T細胞表達的活化標(biāo)記物(如PPD刺激的CD8+CD27-IFN-γ+和CD4+CD27+HLA-DR+CD38+T細胞)具有監(jiān)測結(jié)核病治療反應(yīng)的潛在用途[19]。結(jié)核病患者CD14lowCD16+單核細胞比例較健康對照組明顯下降；與單側(cè)感染組相比，雙側(cè)感染組患者的CD19+CD5+B細胞的頻率和CD14lowCD16+單核細胞上HLA-DR表達強度均明顯下降[21]?；顒有越Y(jié)核病患者外周血中CD4+CXCR5+T細胞的比例較健康對照組明顯下降，其活化標(biāo)記物(HLA-DR和可誘導(dǎo)共刺激分子)和抑制受體[T細胞免疫球蛋白及黏蛋白域蛋白3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain protein-3， Tim-3)和程序性死亡受體-1(programmed death-1，PD-1)]的表達明顯增加，而且結(jié)核特異性抗原誘導(dǎo)的抑制受體表達水平明顯高于植物血凝素，但并不誘導(dǎo)該細胞顯著表達IL-21和Ki-67；阻斷抑制性受體Tim-3和PD-1不僅可增加CD4+CXCR5+T細胞的頻率，而且還可以恢復(fù)其增殖和細胞因子的分泌潛力[22]。B細胞依靠終末分化細胞——漿細胞分泌抗體發(fā)揮體液免疫應(yīng)答效應(yīng)。通過IgD和CD27的表達分為雙陰記憶B細胞(CD19+IgD-CD27-)、靜息B細胞(CD19+IgD+CD27-)、類型轉(zhuǎn)換記憶B細胞(CD19+IgD-CD27+)和非類型轉(zhuǎn)換的記憶B細胞(CD19+IgD+CD27+)[7]。在結(jié)核性胸膜炎患者的胸腔積液中雙陰記憶B細胞較外周血中減少，而類型轉(zhuǎn)換記憶B細胞增多。這說明在感染局部MTB的感染造成循環(huán)B細胞的重新分布[20]。

以上這些發(fā)現(xiàn)，均是一些小樣本、單中心的臨床觀察，缺乏循證醫(yī)學(xué)證據(jù)，需要進一步擴大研究樣本量，納入更多不同類型的結(jié)核病患者，統(tǒng)一檢測方法，開展多中心臨床研究，為結(jié)核病患者的免疫功能評價提供更多手段和臨床依據(jù)，為研究其背后的免疫機制發(fā)揮價值。目前檢測結(jié)核病患者免疫功能的技術(shù)包括庫爾特計數(shù)(血常規(guī))、流式細胞術(shù)(淋巴細胞亞群檢測)、酶聯(lián)免疫吸附試驗或酶聯(lián)免疫斑點試驗或液相懸浮芯片檢測技術(shù)(細胞因子檢測)、膠體金技術(shù)或化學(xué)發(fā)光法(結(jié)核抗體檢測)。近些年來，如流式細胞術(shù)(從傳統(tǒng)的流式細胞術(shù)到全光譜流式細胞術(shù)、成像流式細胞術(shù))等技術(shù)的發(fā)展，為臨床評估結(jié)核病患者的免疫功能提供了技術(shù)支撐，可以減少臨床的等待時間，用更少的樣本量提供更多的檢測結(jié)果。

二、重視免疫功能狀態(tài)評估指征的臨床應(yīng)用

在許多活動性結(jié)核病患者存在免疫細胞減少和免疫功能低下的情況下[23]，《共識》推薦在條件允許的情況下，對所有活動性結(jié)核病患者進行免疫功能狀態(tài)評估。《共識》重點強調(diào)了對高齡、病變廣泛、病情嚴重，合并HIV感染、糖尿病、貧血或低蛋白血癥、免疫缺陷性疾病、免疫抑制劑使用和惡性腫瘤的活動性結(jié)核病患者重點進行免疫功能評價。

要正確把握免疫功能狀態(tài)評估策略。首先，根據(jù)患者就診時的血常規(guī)和結(jié)核感染檢測(如PPD皮膚試驗、γ-干擾素釋放試驗、Th1型細胞因子檢測)結(jié)果進行初步的判斷，如果反映免疫功能低下，則建議在有條件的臨床實驗室，進行淋巴細胞亞群檢測，了解T細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、NK細胞、B細胞的比例及數(shù)量。如果免疫細胞數(shù)量減少，則說明患者的免疫功能低下，若免疫細胞數(shù)量并沒有減少，則建議進一步進行免疫細胞表型檢測和免疫細胞功能檢測，進一步了解患者的免疫狀況，為進行免疫干預(yù)提供依據(jù)。鑒于機體免疫狀態(tài)并不處于穩(wěn)定不變的狀態(tài)，隨著治療和疾病的進展會走向恢復(fù)或加重，并且每例患者的基礎(chǔ)狀態(tài)并不相同。因此，建議在首次就診時即進行免疫功能評價，獲得患者的基礎(chǔ)免疫數(shù)據(jù)。然后根據(jù)患者疾病狀態(tài)定期復(fù)查和動態(tài)監(jiān)測，為進行免疫干預(yù)的時機選擇和免疫調(diào)節(jié)劑的使用提供依據(jù)。例如，IFN-γ或IL-2 檢測陰性的活動性結(jié)核病患者，若化療聯(lián)合霧化重組人γ-干擾素(rhuIFN-γ)或注射重組人白細胞介素-2(rhuIL-2)的治療效果較單純化療效果好[24-26]。

目前主要用于結(jié)核病患者免疫功能評估的方法大多是基于血液的檢測方法，其采樣方便，對患者損傷較小，患者依從性較好，但其只能檢測到外周血中的免疫改變。在結(jié)核感染的過程中，會有免疫細胞被趨化至感染部位發(fā)揮作用，其感染局部的免疫功能改變通過外周血檢測是不夠的，可通過檢測患者肺泡灌洗液、胸腔積液等來實現(xiàn)。檢測這些體液需要進一步臨床研究來達成共識，也需要克服檢測過程中的生物安全問題。

總之，《共識》介紹了我國現(xiàn)有的結(jié)核病免疫檢測方法，提出了活動性結(jié)核病患者免疫功能狀態(tài)評估的指征、方法及策略，指導(dǎo)臨床醫(yī)師的臨床應(yīng)用。隨著新研發(fā)的免疫功能評價方法的深入研究和應(yīng)用，將會更清楚、準(zhǔn)確地描繪不同類型活動性結(jié)核病患者在不同階段的臨床免疫表征，為免疫干預(yù)的時機把握和免疫調(diào)節(jié)劑的合理選擇提供更充分的依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻薛勇：起草文章；吳雪瓊：對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱、指導(dǎo)文章撰寫