肖傳豪

(濮陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南大學(xué) 濮陽工學(xué)院，河南 濮陽 457000)

谷胱甘肽（GSH）是細(xì)胞內(nèi)含量最豐富的生物硫醇，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成[1-2].GSH在生物系統(tǒng)中起著至關(guān)重要的作用，參與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原活性、基因調(diào)控和外源代謝等多種細(xì)胞功能[3-4]，其在人體內(nèi)濃度異常與多種疾病有關(guān)，如癌癥、艾滋病病毒（HIV）、神經(jīng)退行性疾病、肝病和衰老等[5-6].

目前檢測(cè)GSH的方法主要有質(zhì)譜[7]、熒光[8]、電化學(xué)[9]和表面增強(qiáng)拉曼散射[10].然而，大多數(shù)方法需要使用復(fù)雜的儀器、繁瑣的預(yù)處理或高檢測(cè)成本，這些都大大阻礙了它們的實(shí)用性.為了滿足臨床和醫(yī)學(xué)的需要，開發(fā)簡(jiǎn)單、快速、靈敏的GSH檢測(cè)方法十分必要.比色法是一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏且可視化的檢測(cè)方法，近年來備受關(guān)注[11].

本實(shí)驗(yàn)體系的設(shè)計(jì)原理是基于GSH能還原刻蝕MnO2的特性.如圖1所示，當(dāng)GSH存在時(shí)，由于MnO2具有很強(qiáng)的氧化能力，因此Au@MnO2的外殼MnO2很容易被GSH還原刻蝕成Mn2+.隨著GSH濃度的增加，MnO2殼層被刻蝕的程度增強(qiáng)，導(dǎo)致溶液在400 nm處的溶液吸光度降低，溶液由淺綠色變成淺紅色.該方法簡(jiǎn)單快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高、可實(shí)現(xiàn)可視化檢測(cè)，并可應(yīng)用實(shí)際血清樣品中GSH的檢測(cè).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑UV-vis 2550型紫外可見分光光度計(jì)（日本島津）；H-7560型透射電子顯微鏡（日本日立公司）；實(shí)驗(yàn)級(jí)超純水器（美國艾科浦公司）.高錳酸鉀、聚-（烯丙胺鹽酸鹽）、四水氯金酸（HAuCl4·4H2O）、檸檬酸鈉、谷胱甘肽（美國Sigma公司），均為分析純，未經(jīng)純化.

1.2 納米Au@MnO2納米粒子的制備兩步法合成Au@MnO2納米粒子.第一步，合成納米金種子，將0.74 mL 100 mmol/L氯金酸注入到295 mL超純水中并在劇烈攪拌下加熱到100 ℃，然后快速將4.5 mL 0.5%檸檬酸鈉溶液加入上述溶液中，反應(yīng)15 min后，溶液顏色變?yōu)榧t色，得到平均粒徑為50 nm的金種子溶液.第二步，合成Au@MnO2納米粒子，將1.5 mL KMnO4溶液（22 mg/mL）添加到上述制備的納米金（AuNPs）中，劇烈攪拌下反應(yīng)5 min后，將3 mL 25 mg/mL聚-（烯丙胺鹽酸鹽）（PAH）溶液緩慢加入上述溶液反應(yīng)1 h，顏色變?yōu)樯罹G色，最后，以10 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，并用純水洗滌3次，將制備的Au@MnO2分散于60 mL水中備用.

圖1 基于Au@MnO2納米粒子還原刻蝕比色檢測(cè)GSH示意圖Fig.1 Schematic illustration for colorimetric detection of GSH based on Au@MnO2 nanoparticle reduction etching

1.3 實(shí)驗(yàn)方法將500 μL的Au@MnO2納米粒子溶液和300 μL磷酸緩沖鹽溶液（PBS）（pH=6.2）充分混合，然后分別加入含不同濃度GSH的200 μL PBS溶液，常溫下反應(yīng)2 min，測(cè)定400 nm處的吸光度值，以吸光值對(duì)GSH濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化考察溶液pH值對(duì)溶液吸光度的影響，在酸性條件下，在Au@MnO2溶液中加入GSH后，氧化還原反應(yīng)按以下方程式進(jìn)行：

其中GSSG為氧化型谷胱甘肽.

如圖2所示，隨著溶液pH的增加，溶液在400 nm處的吸光度逐漸降低.當(dāng)pH值超過6.2時(shí)，吸光度開始增加，表明pH=6.2時(shí)，MnO2最容易被GSH還原刻蝕.因此，pH=6.2被選擇溶液的最佳pH值.另外，MnO2和GSH的反應(yīng)時(shí)間也是影響GSH傳感靈敏度的一個(gè)重要因素，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MnO2和GSH的反應(yīng)在2 min內(nèi)達(dá)到穩(wěn)定，因此，本工作將GSH與MnO2的反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為2 min.

圖2 溶液pH值對(duì)Au@MnO2溶液吸光度的影響Fig.2 Effect of solutions pH on the absorbance of Au@MnO2 solution

2.2 Au@MnO2納 米 粒 子 表 征透 射 電 鏡 圖 如圖3（a）所示，中心的Au核被MnO2的緊密包覆層包圍，形成了均勻的核殼結(jié)構(gòu).納米金的平均粒徑為50 nm，金納米粒子表面的MnO2殼層厚度為15～30 nm.由吸收光譜（圖3（b））可見，400 nm和600 nm分別對(duì)應(yīng)于MnO2和納米金的紅移.圖3（c）中的HRTEM圖像顯示出納米金的晶格間距是0.21 nm，對(duì)應(yīng)于Au的（111）晶面（JCPDS No.4-784），MnO2的晶格間距是0.24 nm，對(duì)應(yīng)于MnO2的（301）晶面（JCPDS No.44-0141）[12].Au@MnO2納米粒子和不同濃度GSH反應(yīng)后的TEM（圖4）顯示MnO2外殼能被GSH充分刻蝕.

圖3 Au@MnO2納米粒子表征Fig.3 The characterization of Au@MnO2 nanoparticles

圖4 不同濃度的GSH刻蝕Au@MnO2后的TEM圖Fig.4 TEM images of Au@MnO2 after etching by different concentrations of GSH

2.3 GSH靈敏度分析為了研究這種基于Au@MnO2納米粒子的比色方法用于定量檢測(cè)GSH的可行性，測(cè)量不同GSH濃度下傳感體系的吸光度信號(hào)變化.如圖5（a）所示，隨著GSH濃度的升高（0，2，5，10，50，100，1 000，5 000，10 000，50 000，100 000 nmol/L），溶液在400 nm處的吸光度逐漸降低，溶液的顏色從淺綠色慢慢變?yōu)闇\紅色.圖5（b）（c）顯示了在GSH濃度2～100 000 nmol/L范圍內(nèi)，溶液在400 nm處的吸光度與GSH濃度對(duì)數(shù)值的線性擬合關(guān)系，其線性回歸方程為y=0.446-0.027x（R2=0.95）（其中y代表溶液吸光度，x代表GSH濃度對(duì)數(shù)值）.根據(jù)3σ/slope[13]計(jì)算GSH的檢測(cè)限（LOD）為1.62 nmol/L.其中σ代表儀器的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，slope是線性擬合直線的斜率.與其他已報(bào)道的方法相比，本方法的檢測(cè)性能出示了較低的檢測(cè)限和更寬的線性響應(yīng)范圍（表1）.

2.4 特異性分析為研究本檢測(cè)方法對(duì)GSH的特異性，實(shí)驗(yàn)選用賴氨酸（Lys），組氨酸（His），精氨酸（Arg），天門冬氨酸（Asp），蛋氨酸（Met），三聚氰胺（Mel）作為干擾物，上述干擾物的濃度均為900 μmol/L.如圖6（a）(b）所示，相比于空白溶液，除90 μmol/L GSH引起明顯的吸光度值和顏色改變，所有濃度為900 μmol/L的干擾物質(zhì)其吸光度幾乎沒有變化，顏色也基本一致.另外，如圖6(c)所示，在GSH單獨(dú)存在以及干擾物（Na+，K+，抗壞血酸和葡萄糖）和GSH共存的情況下，研究了GSH檢測(cè)的抗干擾性.結(jié)果表明GSH和干擾物共存的情況下產(chǎn)生的吸光度改變和GSH單獨(dú)存在下產(chǎn)生的吸光度改變值幾乎相同.因此，將Au@MnO2納米粒子應(yīng)用于GSH比色檢測(cè)具有優(yōu)異的特異性和抗干擾能力.

圖5 不同濃度GSH溶液傳感體系吸光度變化Fig.5 The absorption spectra of sensing system with GSH various concentration

表1 不同比色方法檢測(cè)GSH性能的比較Tab.1 Comparison of different colorimetric methods for GSH detection

圖6 本文方法對(duì)GSH的特異性和抗干擾性Fig.6 The specificity and anti interference of this colorimetric method toward GSH

2.5 血清中GSH的測(cè)定用本方法對(duì)真實(shí)人體血清樣品中GSH的含量進(jìn)行檢測(cè)，血清樣品來自于當(dāng)?shù)氐腻ш柺腥嗣襻t(yī)院.首先，血清被蒸餾水稀釋到100倍，然后通過加標(biāo)的方法向血清樣品加入一系列不同濃度的GSH （0，2，5，10，100，1 000，5 000，10 000 nmol/L）.如圖7所示，隨著GSH濃度的增加，溶液在400 nm處的吸光度逐漸降低.在2～10 000 nmol/L范圍內(nèi)，吸光度值與GSH濃度對(duì)數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=0.436-0.017x，相關(guān)系數(shù)為0.96.加標(biāo)血清樣品中GSH的平均回收率為95.2%～100.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%～3.9% （表2）.結(jié)果表明該比色法在實(shí)際血清樣品中檢測(cè)GSH具有可行性.

圖7 實(shí)際樣品檢測(cè)結(jié)果Fig.7 Real sample test results

表2 GSH的回收率實(shí)驗(yàn)Tab.2 Recovery experiment of GSH

3 結(jié)論

利用化學(xué)還原法合成核殼型的Au@MnO2納米粒子，通過GSH對(duì)MnO2殼層的刻蝕來調(diào)節(jié)Au@MnO2的形貌發(fā)生改變，從而導(dǎo)致溶液顏色發(fā)生改變，實(shí)現(xiàn)了對(duì)GSH的比色檢測(cè).該方法具有較寬的檢測(cè)線性范圍和較低的檢測(cè)限，同時(shí)具有操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)時(shí)間短、儀器要求低等優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了其它方法成本高、需借助大型檢測(cè)儀器等缺點(diǎn).