宋子怡 張升校 蘇勤怡 李小峰

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種慢性的、以累及關(guān)節(jié)為主的多系統(tǒng)自身免疫性疾病,病變?cè)缙陉P(guān)節(jié)主要病理特征為滑膜炎細(xì)胞浸潤(rùn)、滑膜增生和血管翳形成,晚期常發(fā)生關(guān)節(jié)畸形。RA患者外周血和滑膜液中存在特異性自身抗體,如抗瓜氨酸蛋白抗體(autoantibodies to citrullinated protein antigens, ACPAs)、抗氨甲?；鞍卓贵w及抗乙?；鞍卓贵w等[1]。其中ACPAs最為關(guān)鍵,在RA亞臨床階段可在血液中存在數(shù)年。中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps, NETs)是RA中瓜氨酸蛋白的重要來(lái)源,能刺激機(jī)體產(chǎn)生ACPAs。此外,NETs還能與滑膜成纖維細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes, FLSs)相互作用導(dǎo)致炎性反應(yīng)增強(qiáng)。本文將重點(diǎn)概述NETs在RA發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵作用及以NETs為靶點(diǎn)的藥物在RA治療中的新進(jìn)展。

一、NETs的形成

NETs是中性粒細(xì)胞受到感染或炎癥等刺激后失去細(xì)胞內(nèi)膜完整性后釋放的一種染色質(zhì)纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),主要成分為組蛋白、DNA和顆粒蛋白,網(wǎng)上分布的各種酶及抗菌肽可捕捉、固定并殺滅侵入機(jī)體的細(xì)菌。2004年,Brinkmann等[2]發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了NETs,這是一種殺菌的新機(jī)制。NETs的形成與清除失衡與許多自身免疫性疾病的發(fā)生有關(guān)。

活性氧(reactive oxygenspecies, ROS)介導(dǎo)了NETs的形成,其產(chǎn)生包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamideadenine dinucleotide phosphate, NADPH)氧化酶(NADH oxidase, NOX)依賴途徑與NOX非依賴途徑[3,4]。在NOX依賴途徑中,在微生物、血小板、免疫復(fù)合物(immune complexes, ICs)、自身抗體、細(xì)胞因子、藥物、體外的蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)的強(qiáng)效激活劑乙酸肉豆蔻佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA)和鈣離子(Ca2+)等多種因素的刺激下,中性粒細(xì)胞被激活,其細(xì)胞膜上的NOX2進(jìn)而產(chǎn)生ROS,ROS作用于嗜苯胺藍(lán)顆粒(azurophilicgranules, AG),導(dǎo)致髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)和中性粒細(xì)胞彈性酶(neutrophil elastase, NE)從AG轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,這兩種酶在細(xì)胞核中促使組蛋白分解和染色質(zhì)解聚,隨后中性粒細(xì)胞膜破裂,NETs形成[5,6]。在NETs形成過(guò)程中,激活的中性粒細(xì)胞能進(jìn)一步誘導(dǎo)大量的肽?；彼崦搧啺访?peptidylarginine deiminase, PAD)4產(chǎn)生,使組蛋白瓜氨酸化。在NOX不足時(shí),線粒體可通過(guò)NOX非依賴途徑產(chǎn)生ROS,促使NETs形成。刺激NETs形成的信號(hào)通路目前尚未完全明確,Raf-MEK-ERK可能起著關(guān)鍵性的作用。此外,有研究表明,NETs的形成與G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors, GPCRs)和整合素等信號(hào)分子有關(guān)[7]。

中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NETs并伴隨細(xì)胞裂解、死亡的過(guò)程稱為NETosis,是一種在形態(tài)學(xué)上不同于凋亡和壞死的新的細(xì)胞死亡方式[8]。NETosis的發(fā)生因刺激類型的不同分為自殺性和非自殺性。前者如上所述,最為常見(jiàn),可在中性粒細(xì)胞受刺激后數(shù)小時(shí)內(nèi)發(fā)生。后者則可在中性粒細(xì)胞受刺激后幾分鐘內(nèi)發(fā)生,由金黃色葡萄球菌通過(guò)Toll樣受體(toll-like receptors, TLR)2配體和補(bǔ)體受體或由大腸桿菌通過(guò)TLR4或TLR4激活的血小板誘導(dǎo)產(chǎn)生[9]。與自殺性NETosis一樣,NE轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中,促進(jìn)染色質(zhì)進(jìn)一步解聚和核膜破壞,被蛋白質(zhì)修飾的染色質(zhì)通過(guò)小泡排出胞外。不同的是,中性粒細(xì)胞膜不被破壞且保留了趨化、吞噬、殺菌等功能。

二、NETs介導(dǎo)RA的發(fā)病機(jī)制

在生理狀態(tài)下,NETs可對(duì)外界的危險(xiǎn)信號(hào)產(chǎn)生防御反應(yīng)。NETs可結(jié)合多種病原體并釋放高濃度的抗菌物質(zhì)以降低細(xì)菌毒力并殺死細(xì)菌,從而保護(hù)機(jī)體。然而,在慢性感染和炎性反應(yīng)時(shí),NETs可介導(dǎo)自身免疫反應(yīng)并直接殺死上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,導(dǎo)致組織充血、水腫及氧化損傷,促使RA發(fā)生、發(fā)展[10]。

RA發(fā)展過(guò)程中常有NETs的清除異常[11]。脫氧核糖核酸酶Ⅰ(deoxyribonucleaseⅠ, DNaseⅠ)是一種主要存在于血液和胃腸道中具有核酸內(nèi)切酶活性的酸性糖蛋白,是NETs的重要降解因子。DNaseⅠ可能通過(guò)抑制ROS的產(chǎn)生從而減少NETs形成及促進(jìn)已形成NETs降解發(fā)揮作用,但具體機(jī)制尚不清楚。研究發(fā)現(xiàn),RA滑膜中的DNaseⅠ中幾乎無(wú)活性,血清中的DNaseⅠ活性顯著降低,且與紅細(xì)胞沉降率(erythrocytesediment rate, ESR)、C反應(yīng)蛋白(C reactive protein, CRP)和中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)等炎性指標(biāo)呈負(fù)相關(guān)。因此,血清DNaseⅠ活性水平也許能作為評(píng)價(jià)RA活動(dòng)性的指標(biāo)[12]。DNaseⅠ的活性受損會(huì)導(dǎo)致NETs不能被有效清除,進(jìn)而增加瓜氨酸化自身抗原的暴露,增加ACPAs的產(chǎn)生,導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎癥進(jìn)一步惡化。

RA患者滑膜組織、類風(fēng)濕結(jié)節(jié)和皮膚組織中有大量NETs的存在,對(duì)激活中性粒細(xì)胞的刺激因素更加敏感。外周血中NETs的百分比與血清CRP、ESR、ACPAs和IL-17水平也呈顯著正相關(guān)[13]。NETs通過(guò)產(chǎn)生瓜氨酸蛋白等自身抗原、與環(huán)境因素相互作用誘導(dǎo)ACPAs產(chǎn)生以及促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞增殖和產(chǎn)生細(xì)胞因子等機(jī)制介導(dǎo)RA的自身免疫應(yīng)答。

1. NETs是瓜氨酸蛋白等RA自身抗原的主要來(lái)源:RA患者在亞臨床階段體內(nèi)即可出現(xiàn)自身抗原,其中瓜氨酸化組蛋白是RA中主要的抗原。在中性粒細(xì)胞形成NETs并殺滅病原體的過(guò)程中,組蛋白的瓜氨酸化是關(guān)鍵一步。瓜氨酸化是一種蛋白質(zhì)翻譯后的修飾過(guò)程,指蛋白質(zhì)肽鏈中蛋白的精氨酸殘基在PADs作用下脫亞氨基轉(zhuǎn)化為瓜氨酸化蛋白。PADs包含5種同工酶(PAD1～4和PAD6),中性粒細(xì)胞廣泛表達(dá)PAD2與PAD4。正常情況下PAD4無(wú)活性,但在氧化應(yīng)激或自身免疫反應(yīng)過(guò)程中,Ca2+進(jìn)入細(xì)胞使其活化,導(dǎo)致組蛋白、彈性蛋白酶、天青蛋白和髓樣細(xì)胞分化抗原等瓜氨酸化,增加了它們的抗原性[4]。此外,穿孔素和補(bǔ)體膜途徑能使中性粒細(xì)胞形成孔隙,通過(guò)增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度激活PADs,使中性粒細(xì)胞蛋白廣泛瓜氨酸化[14]。瓜氨酸化蛋白能刺激機(jī)體產(chǎn)生ACPAs,從而誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)。RA患者外周血中NETs與ACPAs水平具有相關(guān)性,當(dāng)ACPAs從血漿中清除時(shí),抗NETs抗體的活性也降低[15]。反過(guò)來(lái),ACPAs也能刺激中性粒細(xì)胞釋放NETs,使炎癥持續(xù)發(fā)生,形成惡性循環(huán)。此外,NETs形成過(guò)程中產(chǎn)生的與RA發(fā)病相關(guān)的自身抗原還有膜聯(lián)蛋白A1、過(guò)氧化氫酶、基質(zhì)相關(guān)蛋白酶8等。

2. 環(huán)境因素通過(guò)NETs誘導(dǎo)ACPAs產(chǎn)生促使RA發(fā)病:RA發(fā)病早期,一些環(huán)境因素如吸煙和牙周病感染都能以依賴PADs的方式形成NETs并產(chǎn)生瓜氨酸蛋白,進(jìn)而誘導(dǎo)ACPAs產(chǎn)生[16]。隨后,瓜氨酸化蛋白可與相應(yīng)的自身抗體結(jié)合形成ICs,在ICs刺激下,關(guān)節(jié)滑膜炎性反應(yīng)持續(xù)進(jìn)展,最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織破壞及畸形。NETs中的瓜氨酸蛋白產(chǎn)生后進(jìn)一步誘導(dǎo)NETs的形成,形成正反饋。據(jù)報(bào)道,在健康吸煙者的支氣管肺泡灌洗液中,PADs酶的表達(dá)和活性升高,瓜氨酸化蛋白水平也升高,可能與煙草中的尼古丁有關(guān)。一些臨床證據(jù)表明,在RA亞臨床和臨床階段,ACPAs陽(yáng)性患者常伴有支氣管擴(kuò)張、間質(zhì)性肺疾病和小氣道阻塞等呼吸系統(tǒng)疾病[17]。牙齦卟啉單胞菌會(huì)引起牙周炎,并在高度血管化的環(huán)境中產(chǎn)生瓜氨酸抗原。放線菌團(tuán)聚桿菌是一種革蘭陰性桿菌,可引起牙周炎和感染性心內(nèi)膜炎,通過(guò)產(chǎn)生白細(xì)胞毒素a來(lái)觸發(fā)中性粒細(xì)胞整體高脂化,它也能夠通過(guò)誘導(dǎo)ACPAs產(chǎn)生導(dǎo)致RA發(fā)生,但具體機(jī)制尚不明確[18]。

3. NETs通過(guò)促進(jìn)滑膜成纖維細(xì)胞增殖和產(chǎn)生細(xì)胞因子加重RA關(guān)節(jié)損害:RA滑膜微環(huán)境非常有利于形成NETs。FLSs是促進(jìn)關(guān)節(jié)滑膜增生的主要細(xì)胞,可吸引炎性細(xì)胞作用于滑膜,加劇關(guān)節(jié)炎癥及組織破壞。NETs的瓜氨酸蛋白可作為自身抗原激活滑膜中的免疫細(xì)胞,刺激FLSs或巨噬細(xì)胞表達(dá)和釋放IL-8、IL-6和IL-25等促炎性細(xì)胞因子,這些炎性細(xì)胞因子和多種抗體又可以誘導(dǎo)NETs產(chǎn)生,導(dǎo)致機(jī)體免疫耐受喪失,促進(jìn)RA的發(fā)展。RA-FLSs可將NETs內(nèi)化至晚期糖基化終產(chǎn)物受體-TLR9途徑中。這種由FLSs內(nèi)化的NETs可使FLSs合成更多的促炎性細(xì)胞因子和趨化因子,并通過(guò)主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ使FLSs具有抗原遞呈細(xì)胞能力[19]。FLSs可以將含有瓜氨酸肽的NETs遞呈給RA抗原的特異性T細(xì)胞并激活它們,從而介導(dǎo)適應(yīng)性免疫反應(yīng)。研究表明,NETs在體外能促進(jìn)RA-FLSs增殖并使RA-FLSs內(nèi)CTGF mRNA表達(dá)上調(diào)和MST1激酶表達(dá)顯著下調(diào)[20]。Khandpur等[13]研究結(jié)果表明,NETs對(duì)FA-FLSs的影響可能與RA患者滑膜中DNaseⅠ活性受損有關(guān)。

4. NETs介導(dǎo)RA發(fā)展的其他可能機(jī)制:除了上述機(jī)制外,NETs還可通過(guò)產(chǎn)生PAD2、排出線粒體DNA(mtDNA)、促進(jìn)血管新生和血管翳的形成、激活補(bǔ)體系統(tǒng)等加劇RA炎癥。NETs中的PAD2不僅可以直接降解滑膜中的軟骨成分,還能激活FLSs和巨噬細(xì)胞的促炎途徑,從而加劇關(guān)節(jié)損傷。目前,大多數(shù)研究者認(rèn)為,NETs有細(xì)胞核及線粒體兩種來(lái)源,但仍未進(jìn)一步明確。NETosis期間,中性粒細(xì)胞排出的mtDNA具有促炎特性,這一發(fā)現(xiàn)增加了NETs介導(dǎo)的自身免疫的復(fù)雜性。由于mtDNA含有細(xì)菌核酸的殘?bào)w,且存在異常甲基化,因此,機(jī)體可能產(chǎn)生對(duì)mtDNA的免疫反應(yīng),增強(qiáng)TLR信號(hào)和放大炎癥信號(hào)而誘發(fā)RA[21]。RA滑膜中明顯增多的NETs可以促進(jìn)血管新生,但這一過(guò)程的分子機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。此外,NETs結(jié)合相關(guān)抗體后,可通過(guò)經(jīng)典途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)進(jìn)一步加重炎性反應(yīng)[22]。

三、以NETs為靶點(diǎn)在RA中的潛在療法

NETs在RA發(fā)病早期發(fā)揮了重要的促炎作用,多種藥物可通過(guò)調(diào)控NETs靶點(diǎn)治療RA。研究表明,托珠單抗和利妥昔單抗等能通過(guò)減少NETs的生成延緩RA進(jìn)展[23]。雷公藤不僅可以減少健康人和RA患者的NETs,還能通過(guò)抑制氧化爆發(fā)和脾酪氨酸激酶的活化阻止絲裂原活化蛋白激酶、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶、活化核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclear transcription factor kappa B, NF-κB)的磷酸化減少NETs中組蛋白的瓜氨酸化,從而延緩RA進(jìn)展。另外一些研究表明,抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)可以通過(guò)阻斷T淋巴細(xì)胞mTOR受體阻止NETs的形成和ROS的釋放降低RA等自身免疫性疾病的活動(dòng)性。PAD4抑制劑CL-脒(CI-amidine)可通過(guò)減少小鼠關(guān)節(jié)和血清中的瓜氨酸蛋白和IL-6減輕關(guān)節(jié)損害,但效果欠佳。DNaseⅠ可促進(jìn)NETs的清除從而減輕小鼠腎臟組織損傷并延長(zhǎng)壽命。GSK199作為一種低鈣PAD4酶抑制劑也可減緩關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度。由此可見(jiàn),靶向中性粒細(xì)胞產(chǎn)生的NETs可能成為改善RA患者預(yù)后的新的治療靶點(diǎn),針對(duì)其產(chǎn)生機(jī)制有望開(kāi)發(fā)新的靶向藥物。

四、展 望

中性粒細(xì)胞及其產(chǎn)生的NETs大量存在于RA的炎癥部位,在自身免疫反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。RA的發(fā)生、發(fā)展與NETs生成能力的增加以及導(dǎo)致持續(xù)性炎癥和組織損傷的NETs清除障礙有關(guān)。NETosis會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)翻譯后修飾的蛋白質(zhì)和DNA暴露,從而打破自身免疫耐受并激活適應(yīng)性免疫反應(yīng),誘導(dǎo)免疫細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體和細(xì)胞因子等,并直接激活鄰近細(xì)胞,誘導(dǎo)組織損傷并導(dǎo)致全身炎性反應(yīng),促使RA發(fā)生。NETs還可以通過(guò)激活補(bǔ)體途徑等方式放大炎性反應(yīng)。本研究概述了可用于預(yù)防NETs生成或增加其降解的可能靶向藥物,但仍需要對(duì)這些藥物進(jìn)行更多的研究和臨床試驗(yàn)以證實(shí)其療效,從而減輕對(duì)RA患者的傷害。進(jìn)一步探索NETs影響RA的發(fā)病機(jī)制將為NETs成為具有診斷意義的生物學(xué)標(biāo)志物和靶向NETs治療RA提供堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。