田 力 張寧坤 楊 璐 夏 菁 彭朝勝

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC),全球最常見的惡性腫瘤之一,其發(fā)生率及病死率分居腫瘤第3位及第2位,我國CRC發(fā)生率及病死率也具此特點[1,2]。40%～60%初診CRC患者發(fā)現(xiàn)時就已為進展期[3];40%早期根治性手術(shù)切除術(shù)后的患者會出現(xiàn)復(fù)發(fā)或發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[4]?？鼓[瘤藥物是患者的主要治療手段,奧沙利鉑(oxaliplatin,L-OHP)是治療CRC的重要化療藥物之一,但其有效率因耐藥和毒瘤性反應(yīng)而降低。因此,尋找L-OHP藥物的療效預(yù)測因子、制定合理的個體化治療方案,是腫瘤治療的一個重要方向。

SLFN11(Schlafen 11)基因?qū)偃嗽葱許lfn(Schlafen)家族成員之一。Slfns基因家族包括 10 種鼠源和 5 種人類亞型,據(jù)基因同源性和編碼蛋白的大小可以分成 3 組[5]。研究發(fā)現(xiàn),SLFN蛋白為 SLFN1,在NIH-3T3 成纖維細胞中異位表達時觀察到 G0/G1期細胞周期停滯的情況,故而將其命名為 Schlafen1[6]。該家族基因具有對細胞生長起重要的負調(diào)控作用,作為潛在的抑癌基因而被逐漸重視。眾多臨床研究證實SLFN11基因可影響抗腫瘤細胞鉑類藥物(順鉑、卡鉑)的敏感度[7,8]。

L-OHP與順鉑、卡鉑同屬于烷化劑抗腫瘤藥物,屬于第3代鉑類藥物。但目前還沒有關(guān)于SLFN11基因表達和L-OHP敏感度相關(guān)的細胞學(xué)研究,臨床研究也很少,研究顯示,SLFN11高表達可影響CRC以L-OHP為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療的患者預(yù)后。這提示SLFN11與L-OHP療效可能存在一定的相關(guān)性,但由于此研究僅為單中心小樣本量臨床研究,其結(jié)果的可靠性需要進一步在細胞學(xué)及臨床上得到證實。因此本項目擬從細胞學(xué)層面體外驗證SLFN11對L-OHP抑制人直腸癌細胞(SW480)作用的影響,探索SLFN11表達水平對L-OHP療效的評估意義,為尋找該藥預(yù)測因子提供依據(jù)。

材料與方法

1.主要材料和試劑:SLFN11siRNA序列(漢恒生物科技有限公司)、mock序列(漢恒生物科技公司)、SLFN11基因和內(nèi)參基因GAPDH序列[生工生物工程(上海)股份公司]、Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑(C0526,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、AG RNAex Pro reagent(AG21102,湖南艾科瑞生物工程公司)、Evo M-MLV RT Premix for qPCR(AG11706,湖南艾科瑞生物工程公司)、SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit(AG11701,湖南艾科瑞生物工程公司),SLFN11一抗(26060-1-AP,武漢三鷹生物技術(shù)有限公司)、HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG(ZB-2301,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、細胞周期與凋亡檢測試劑盒(C1052,上海碧云天生物技術(shù)有限公司)、L-OHP(HY-17371,美國MedChemExpres公司)。

2.SW480細胞培養(yǎng):使用含10%胎牛血清L-15培養(yǎng)液,培養(yǎng)人結(jié)腸癌細胞系SW480(CL-0223A,武漢普諾賽生命科技有限公司)。待鋪板率達到80%～90%時,經(jīng)0.25%胰酶消化,1000r/min離心5min,重懸后按1∶2進行傳代,隨后選取處于對數(shù)生長期細胞進行后續(xù)實驗。為了避免實驗誤差并保證數(shù)據(jù)可重復(fù)性,每批實驗驗證中每組均設(shè)計3個生物學(xué)重復(fù)。

3.小干擾RNA(small interfering RNA,SLFN11siRNA)細胞轉(zhuǎn)染:設(shè)計3組SLFN11siRNA序列和1組mock序列(表1),以1×105/孔密度將SW480細胞接種于6 孔板中,培養(yǎng)過夜,待細胞鋪板率達到 30%～40%分組處理:①空白對照組(Control):未進行轉(zhuǎn)染操作;②陰性對照組:siRNA-NC:mock序列轉(zhuǎn)染組;③3個序列驗證組:分別轉(zhuǎn)染SLFN11-siRNA1-A3。轉(zhuǎn)染過程依Lipo6000TM轉(zhuǎn)染試劑說明書進行。轉(zhuǎn)染后6h更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h。用于后續(xù)RT-qPCR、Western blot法、細胞周期與細胞凋亡實驗。

4.RT-qPCR檢測:利用RT-qPCR檢測(表2)SLFN11基因mRNA水平。提取細胞總RNA,依試劑盒說明進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA上機進行檢測。采用2-ΔΔCt方法計算各組樣本對空白對照組目的基因相對表達量,SLFN11基因相對表達量= 2-[ΔCT(SLFN11)-ΔCT(GAPDH)]。

表2 SLFN11基因RT-qPCR序列

5.Western blot法檢測SLFN11蛋白表達:收取各組細胞,加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解緩沖液,于冰上裂解30min。4℃、12000r/min離心5min,進行總蛋白定量。取總蛋白30μg經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、SLFN11 一抗、HRP-IgG二抗孵育后,利用Image J圖像分析軟件分析灰度值表示目的蛋白相對表達量:SLFN11蛋白相對表達量(%)=siRNA轉(zhuǎn)染組灰度值/control組灰度值×100%。

6.L-OHP藥物毒性實驗:結(jié)合RT-qPCR和Western blot法檢測結(jié)果,將SW480細胞分為兩組,即mock組和SLFN11基因沉默組(SLFN11-/-)。用PBS配制5mmol/L藥物母液,并稀釋0、0.9375、1.875、3.75、7.5、15、30、40、50μmol/L 9個濃度。作用于轉(zhuǎn)染細胞48h后,清洗細胞,采用MTT檢測方法讀取吸光度A值。細胞抑制率(%)=1-(各藥物濃度A值/未加藥物A值)×100%。據(jù)藥物毒性數(shù)據(jù),選取L-OHP濃度3.75μmol/L作用于SW480細胞株進行后續(xù)細胞周期及凋亡實驗。

7.細胞凋亡:細胞隨機分為4組:control-BL組:SW480+siRNA-NC;control-L-OHP組:SW480+siRNA-NC+3.75μmol/L L-OHP;SLFN-/--BL組:SW480+SLFN11siRNA;SLFN-/--L-OHP組:SW480+SLFN11siRNA+3.75μmol/L L-OHP。細胞轉(zhuǎn)染48h后更換含有3.75μmol/L L-OHP培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)48h。收取細胞按AnnexinⅤ-FITC凋亡染色試劑盒中的要求進行檢測。細胞凋亡率(%)=右下象限細胞比例(%)+右上象限細胞比例(%)。

8.細胞周期:依上述操作過程進行實驗并收集細胞。經(jīng)1ml PBS洗細胞1次,加入500μl PBS 4℃避光孵育30min。以標(biāo)準程序用流式細胞儀檢測,一般計數(shù)(2～3)萬個細胞,熒光補償調(diào)節(jié)使用正常SW480細胞,分析單個細胞上PI的熒光強度,軟件自動擬合細胞周期。

結(jié) 果

1.SLFN11基因mRNA低表達有效siRNA篩選:結(jié)合RT-qPCR和Western blot法分別對SLFN11基因mRNA和蛋白表達情況進行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空白對照比較,siRNA-NC組、SLFN siRNA-1和SLFN siRNA-2組對SW480細胞SLFN11mRNA和蛋白表達均無顯著性影響(圖1),而SLFN siRNA-3顯著降低了SLFN11mRNA和蛋白的表達,分別降低約90%和80%。

2.SLFN11基因沉默后對L-OHP抑制細胞生長影響:以SLFN siRNA-3為刺激物制備SW480 SLFN11基因沉默模型,并進行藥物L(fēng)-OHP檢測。結(jié)果表明,SLFN11siRNA干擾組(SLFN siRNA-3)較未干擾(mock)組,細胞生長抑制率明顯減低(P<0.05),未干擾組IC50值為36.19μmol/L,SLFN11siRNA干擾組IC50值為43.55μmol/L。說明SLFN11基因沉默可有效降低L-OHP對SW480抑制作用的敏感度(圖2)。

圖2 SLFN 11沉默對L-OHP抑制SW480細胞株生長的影響

3.SLFN11基因沉默對L-OHP誘導(dǎo)SW480細胞凋亡的影響:對SW480凋亡率統(tǒng)計分析得出,與control-BL組(4.51%±0.25%)比較,L-OHP藥物干預(yù)(control-L-OHP組, 29.86%±0.28%)SW480細胞凋亡率極顯著升高,提高25.35%(P<0.05)。與SLFN-/--BL組比較(6.56%±0.30%),SLFN-/--L-OHP組細胞凋亡率 (12.79%±0.29%)極顯著地增加,提高6.23%(P<0.05)。與control-L-OHP組比較,SLFN-/--L-OHP組細胞凋亡率極顯著降低(P<0.05),降低17.07%。與control-BL組比較,SLFN-/--BL組細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。檢測結(jié)果顯示,一方面L-OHP可有效誘導(dǎo)SW480凋亡;另一方面SLFN11基因沉默后能夠有效抑制L-OHP誘發(fā)的腸癌細胞凋亡行為(圖3、圖4)。

圖3 SLFN11對L-OHP阻滯SW480細胞株細胞凋亡的影響A.control-B組凋亡細胞百分比;B.SLFN-/--BL組凋亡細胞百分比;C.control-L-OHP 組凋亡細胞百分比;D.SLFN-/--L-OHP組凋亡細胞百分比

圖4 SLFN11基因沉默對L-OHP誘導(dǎo)SW480細胞凋亡率與control-BL組比較,*P<0.05;與control-L-OHP組比較,#P<0.05;與SLFN-/--BL組比較,ΔP<0.05

4.SLFN11基因沉默對L-OHP阻滯SW480細胞周期的影響:對SW480細胞周期G2/M期比例進行統(tǒng)計分析,與control-BL組(23.30%±0.13%)比較,control-L-OHP組(32.04%±0.41%)SW480細胞G2/M期比例極顯著增加,升高8.74%(P<0.05)。與SLFN-/--BL組(24.37%±0.30%)比較,SLFN-/--L-OHP組(27.21%±0.31%)G2/M期比例顯著增加(P<0.05),升高2.84%。SLFN11-/--L-OHP組與control-L-OHP組比較G2/M期比例顯著降低(P<0.05),減少了4.83%。與control-BL組比較,SLFN-/--BL組對細胞周期比例無顯著影響(P>0.05,圖4)。一方面表明L-OHP能夠有效誘發(fā)腸癌細胞株SW480細胞周期阻滯。另一方面說明SLFN11敲除后能夠有效抑制L-OHP誘發(fā)的腸癌細胞周期阻滯行為(圖5、圖6)。

圖5 SLFN11基因沉默對L-OHP誘導(dǎo)SW480周期變化影響A.control-BL組細胞周期分布;B.SLFN-/--BL組細胞周期分布;C.control-L-OHP 組細胞周期分布;D.SLFN-/--L-OHP組細胞周期分布

圖6 SLFN11對L-OHP阻滯SW480細胞周期G2/M期比例影響A.與control-BL組比較,*P<0.05;與control-L-OHP組比較,#P<0.05;與SLFN-/--BL組比較,ΔP<0.05

討 論

化療是進展期CRC患者重要治療手段,可有效提高患者總生存期和無疾病進展生存期。治療基本按照腫瘤治療NCCN(The National Comprehensive Cancer Network)指南給予以L-OHP為基礎(chǔ)的抗腫瘤治療FOLFOX(L-OHP+氟尿嘧啶+亞葉酸鈣)或XELOX方案(L-OHP+卡培他濱)。但因鉑類藥物包括L-OHP單藥在腫瘤中的有效率不超過20%,聯(lián)合用藥有效率不超過50%,使用效果不夠理想[9,10]。至今在臨床上仍未發(fā)現(xiàn)一個能夠預(yù)測L-OHP療效的標(biāo)志物。因此,探索L-OHP療效預(yù)測因子的研究是實現(xiàn)腫瘤患者個體化治療面臨的迫切問題。

SLFN11是Slfns基因家族之一,由Schwarz等[11]于1998年發(fā)現(xiàn),參與調(diào)控胸腺發(fā)育,對細胞生長、分化和免疫等功能都有調(diào)節(jié)作用。Barretina等[12]研究發(fā)現(xiàn),其可表達于多種細胞系,且不同腫瘤細胞SLFN11表達水平不一。SLFN11基因可使多種腫瘤細胞及多種抗腫瘤藥物敏感,如鉑類衍生物,拓撲異構(gòu)酶抑制劑,DNA合成抑制劑和PARP抑制劑[13]。Zoppoli等[14]研究表明,CRC和卵巢癌腫瘤組織中的SLFN11表達分布范圍明顯較周圍正常組織增大;但較周圍正常組織,腫瘤組織SLFN11表達水平明顯減低。隨后的一些基礎(chǔ)研究也證實了SLFN11基因可影響腫瘤細胞CPT-11和鉑類藥物(順鉑、卡鉑)的敏感度,如卵巢癌患者的以鉑類藥物為基礎(chǔ)的化療效果顯示,SLFN11基因高表達患者療效要明顯優(yōu)于低表達患者[15～17]。另外,SLFN11表達量與腫瘤細胞對DNA損傷藥物的敏感度呈正相關(guān),國內(nèi)研究者認為主要是由于SLFN11高表達,促使復(fù)制蛋白A復(fù)合體(replication protein A complex,RPA)從單鏈DNA(single-stranded DNA,ssDNA)上脫落,抑制細胞周期維持和同源重組修復(fù)而造成對DNA損傷藥物的敏感度[18]。

L-OHP為第3代鉑類藥物,雖與順鉑、卡鉑同屬于致DNA損傷的烷化劑,目前還沒有關(guān)于SLFN11基因表達和L-OHP敏感度相關(guān)的細胞學(xué)研究,臨床研究也相對較少。2015年一項臨床研究發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌患者輔助以L-OHP為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療治療中,KRAS基因野生型患者與突變型患者生存率比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,但KRAS野生型、SLFN11表達水平高的CRC患者預(yù)后良好,其3年及5年生存率較SLFN11低表達的患者明顯升高[19]。另外一項臨床研究結(jié)果也表明,具有高SLFN11表達的胃癌患者比低SLFN11表達患者具有更好的生存期,在輔助以鉑類(順鉑或L-OHP)為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療后,這種生存期優(yōu)勢更加明顯。激活SLFN11活性可以增加鉑類藥物的敏感度,而下調(diào)SLFN11表達水平則引起鉑類藥物的耐藥性。研究還發(fā)現(xiàn),長期L-OHP治療可抑制SLFN11的表達,從而引起耐藥[20]。這些均提示SLFN11與L-OHP療效可能存在一定的正相關(guān)性,但因這些臨床研究僅為單中心小樣本量臨床研究,其結(jié)果的可靠性需進一步在細胞學(xué)及臨床上得到證實。

筆者通過細胞學(xué)實驗觀察SLFN11對L-OHP抑制腫瘤細胞作用的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)干預(yù)處理SLFN11基因表達減低后,L-OHP抑制SW480生長作用顯著減弱。說明SLFN11基因低表達可減低SW480細胞株對L-OHP的敏感度,這與既往研究SLFN11基因表達影響腫瘤細胞對鉑類藥物敏感度的結(jié)論相一致,也與臨床研究結(jié)果相符[20,21]。進一步研究發(fā)現(xiàn),SLFN11低表達,可顯著減低L-OHP誘導(dǎo)的細胞凋亡和細胞周期阻滯,主要影響集中在細胞周期G2/M期,與L-OHP引起腫瘤細胞 G2/M 期停滯相一致,這更進一步證實了SLFN11表達水平影響L-OHP抗腫瘤效應(yīng)。

對于CRC患者,以L-OHP為基礎(chǔ)的化療方案和以伊立替康(CPT-11)為基礎(chǔ)的化療均是重要的一線或二線化療方案,而SLFN11被發(fā)現(xiàn)與包含CPT-11的拓撲異構(gòu)酶抑制劑敏感度也密切相關(guān),那么對于CRC患者,SLFN11基因表達顯得尤為重要,可以考慮作為化療藥物選擇的預(yù)測基因,對患者進行L-OHP或CPT-11藥物治療的分層篩選,盡可能指導(dǎo)個體化治療,從而提高患者的有效治療。