王 坤 朱傳龍 田健美 孔小行 成芳芳 李 嫣

急性肝衰竭(acute liver failur,ALF)是由各種病原體感染,各種物質(zhì)中毒等原因引起的肝細(xì)胞亞大片或大片凋亡、壞死,致使其各種生物學(xué)功能?chē)?yán)重受損或失代償?shù)囊环N臨床癥候群,臨床病死率高[1]。由于缺乏理想的早期病情評(píng)估指標(biāo)和有效的藥物治療方案,急性肝衰竭的臨床評(píng)估與有效治療仍然是世界性的難題[2]。目前急性肝衰竭常用的治療方法為內(nèi)科治療,包括保肝、呼吸循環(huán)支持、血漿置換等治療,但療效仍有限[3]。肝移植仍是當(dāng)前該疾病最有效的治療方法,但由于供肝缺乏、醫(yī)療費(fèi)用高昂等問(wèn)題限制該方法的廣泛開(kāi)展[4]。因此,進(jìn)一步尋找一種新的方式早期診斷評(píng)估、治療急性肝衰竭至關(guān)重要。有研究表明,基因治療是一種很有前途的治療方式,可用于治療多種疾病,并且能提高治療的療效和患者的生存率[5]。

微小RNA(miRNA)是一類(lèi)小分子非編碼單鏈RNA,由約22個(gè)核苷酸組成,它通過(guò)與mRNA的3′-非轉(zhuǎn)錄區(qū)域(3′-UTR)結(jié)合,在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的功能,抑制靶基因的表達(dá),在調(diào)控體內(nèi)的蛋白質(zhì)編碼基因的表達(dá)中發(fā)揮重要作用[6]。既往研究表明,miRNA不僅可以作為肝衰竭的早期診斷指標(biāo),也在肝衰竭炎性反應(yīng)、肝細(xì)胞壞死、凋亡和肝細(xì)胞再生過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[7]。因此,通過(guò)探索這些miRNAs,可能會(huì)獲得疾病早期診斷和靶向治療的新線(xiàn)索。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:雄性SD大鼠42只,6周齡,體質(zhì)量為200～220g,購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司,許可證號(hào):SCXK(滬)2017-0005。本實(shí)驗(yàn)中所有的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物被飼養(yǎng)于蘇州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,SPF級(jí)飼養(yǎng)環(huán)境,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)進(jìn)行,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證:SYXK(蘇)2017-0043。

2.主要實(shí)驗(yàn)試劑:D-氨基半乳糖、脂多糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase,ALT)檢測(cè)試劑盒、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)檢測(cè)試劑盒及總膽紅素(total bilirubin,TBIL)檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所;TRIzol購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司;cDNA第一鏈合成試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司;全蛋白抽提試劑盒、BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司;兔anti-BCL2L2、羊抗兔IgG-HRP購(gòu)自江蘇親科生物研究中心有限公司;引物、miR-204-5p模擬物(miR-204-5p mimic)、pmirGLO-BCL2L2-WT、pmirGLO-BCL2L2-MUT報(bào)告載體均由江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司構(gòu)建完成。

3.急性肝衰竭大鼠模型建立、分組:取32只6周齡雄性SD大鼠,以隨機(jī)數(shù)字表法平均分成對(duì)照組(0h)、模型組(24h)、模型組(48h)、模型組(72h),每組各8只[模型組(72h)的大鼠在造模不足72h有死亡的情況,此時(shí)再隨機(jī)選取6周齡雄性SD大鼠補(bǔ)充入組,完成造模],對(duì)照組腹腔注射0.9%氯化鈉溶液,模型組采用D-氨基半乳糖(D-GalN,劑量為950mg/kg)和脂多糖(LPS,劑量為10μg/kg)依次腹腔注射制造大鼠急性肝衰竭模型,分別取對(duì)照組及模型組造模完成后24、48、72h大鼠靜脈血及肝組織。另取10只6周齡雄性SD大鼠,行上述急性肝衰竭造模后,觀察大鼠生存情況。

4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清ALT、AST、TBIL值:內(nèi)眥靜脈采取4組大鼠靜脈血,采血完成后,置于離心機(jī)中,4℃、3000r/min離心10min。收集上層血清,嚴(yán)格按照試劑盒所附說(shuō)明書(shū)的操作檢測(cè)。

5.蘇木精-伊紅(HE)染色觀察各組大鼠肝組織病理變化及行炎癥活動(dòng)指數(shù)(histology activity index,HAI)評(píng)分:4組大鼠肝組織標(biāo)本收集后,將其放入10%的甲醛溶液中固定72h,然后用乙醇脫水,石蠟包埋,切片,切片厚度為4μm。組織切片經(jīng)脫蠟,水化,行HE染色,封片后置于200倍光鏡顯微鏡下觀察肝臟病理變化并拍照,并采用HAI評(píng)分系統(tǒng)對(duì)各組肝臟組織炎癥壞死凋亡等情況進(jìn)行評(píng)分。

6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT -PCR) 檢測(cè)miR-204-5p、BCL2L2表達(dá)水平:取出4組肝臟組織,使用Trizol法提取肝臟組織總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄合成互補(bǔ)DNA(cDNA),建立熒光定量PCR體系。以U6為miR-204-5p內(nèi)參,GADPH為BCL2L2內(nèi)參,采用2-Δ ΔCt計(jì)算miR-204-5p、BCL2L2相對(duì)表達(dá)量。miR-204-5p上游引物:5′-ACACTCCAGCTGGGUUCCCUUUGUCAUCCU-3′,下游引物:5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′;U6上游引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,下游引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′;BCL2L2上游引物:5′-AGTCTGTCATCCTTGCCCCTTT-3′,下游引物:5′-GCTCCACAGACATAACCCTTCT-3′;GADPH上游引物:5′-AGGTTGTCTCCTGTGACTTCAA-3′;下游引物:5′-CTGTTGCTGTAGCCATATTCATTG-3′。

7.Western blot法檢測(cè)4組大鼠肝組織中BCL2L2蛋白表達(dá)情況:采用RIPA裂解液裂解肝組織,離心后取上清液采用BCA法檢測(cè)樣本蛋白含量,用GADPH作為內(nèi)參,使用12% SDS-PAGE電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜封閉后加入一抗(兔anti-BCL2L2)孵育過(guò)夜,加入羊抗兔IgG-HRP二抗,室溫反應(yīng)2h,TBsT洗膜后使用超敏ECL發(fā)光液孵育PVDF膜進(jìn)行顯影,保存圖片,采用Imagel J軟件分析條帶灰度值。

8.TUNEL法檢測(cè)肝細(xì)胞凋亡:取4組肝臟組織石蠟切片,脫蠟水化后每張切片滴加蛋白激酶K及TdT酶反應(yīng)液,避光反應(yīng)1h,清洗后滴加Streptavadin-HRP,避光反應(yīng)30min,洗滌后行DAB顯色及蘇木精復(fù)染,沖洗干凈,晾干后封片,選取5個(gè)400倍鏡下視野,每個(gè)高倍視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞,計(jì)數(shù)各視野的凋亡指數(shù)。凋亡指數(shù)(%)=各視野陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/100×100%。

9.雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-204-5p與BCL2L2之間的靶向關(guān)系:通過(guò)Targetscan數(shù)據(jù)庫(kù)分析miR-204-5P的靶基因可能是BCL2L2,分別將BCL2L2-WT、BCL2L2-MUT質(zhì)粒與miR-204-5pmimics、mimics-NC共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染48h后,收集各組細(xì)胞并參照雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

結(jié) 果

1.4組大鼠血清ALT、AST、TBIL水平的變化:與對(duì)照組比較,行急性肝衰竭造模后的大鼠血清ALT、AST及TBIL值均隨造模時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),肝功能損傷明顯,詳見(jiàn)表1。

表1 4組大鼠血清ALT、AST及TBIL值水平

2.4組大鼠肝組織病理變化:大鼠行急性肝衰竭造模24h后,200倍光鏡視野下觀察肝組織病理可發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞水腫、點(diǎn)狀變性壞死及炎性滲出,隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),大鼠的肝臟壞死程度逐漸加重,在造模后72h觀察其肝臟病理可見(jiàn)肝細(xì)胞發(fā)生大片狀壞死,結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞及有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn),詳見(jiàn)圖1A。此外,隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),HAI評(píng)分逐漸升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),詳見(jiàn)圖1B。

圖1 4組大鼠肝組織病理情況A.4組大鼠肝組織病理變化(HE,×200);B.4組大鼠肝組織相應(yīng)HAI評(píng)分

3.大鼠行急性肝衰竭造模后生存率:取10只SD大鼠行急性肝衰竭造模,研究發(fā)現(xiàn),造模12h后大鼠的活力下降,活動(dòng)度減少;24h后部分大鼠出現(xiàn)精神萎靡、食納減少、觸碰反應(yīng)差等表現(xiàn),造模48h內(nèi)即有大鼠出現(xiàn)死亡,后大鼠陸續(xù)出現(xiàn)死亡,所有造模大鼠均在5天內(nèi)死亡,詳見(jiàn)圖2。

圖2 急性肝衰竭大鼠造模后生存情況

4.4組大鼠肝組織中miR-204-5p、BCL2L2的表達(dá)情況:RT-PCR檢測(cè)顯示,模型組大鼠肝組織中miR-204-5p的相對(duì)表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組,且隨著大鼠行急性肝衰竭造模后時(shí)間推移,肝組織中miR-204-5p基因的相對(duì)表達(dá)水平逐漸升高(各組表達(dá)量分別為1.26±0.29、1.76±0.21、2.99±0.32、4.30±0.88),詳見(jiàn)圖3A;而肝組織中BCL2L2基因的相對(duì)表達(dá)水平逐漸降低(各組表達(dá)量分別為0.95±0.10、0.56±0.07、0.34±0.07、0.13±0.06),詳見(jiàn)圖3B。Western blot法檢測(cè)結(jié)果顯示,肝組織中BCL2L2蛋白表達(dá)亦逐漸降低,詳見(jiàn)圖3C,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

圖3 4組大鼠肝組織中miR-204-5p、BCL2L2表達(dá)情況A.4組大鼠肝組織中miR-204-5p基因的相對(duì)表達(dá)水平;B.4組大鼠肝組織中BCL2L2基因的相對(duì)表達(dá)水平;C:4組大鼠肝組織中BCL2L2蛋白表達(dá)情況

5.4組大鼠肝細(xì)胞凋亡情況:通過(guò)TUNNEL法檢測(cè)各組肝細(xì)胞的凋亡情況,結(jié)果顯示,隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),肝組織中凋亡的肝細(xì)胞顯著增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),詳見(jiàn)圖4。

6.miR-204-5p靶向BCL2L2:miR-204-5p表達(dá)水平與BCL2L2表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(R2=0.752,P<0.001),詳見(jiàn)圖5A。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)顯示,miR-204-5p與BCL2L2之間存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn),詳見(jiàn)圖5B。雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照mimics-NC組比較,miR-204-5p mimics與BCL2L2-WT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的相對(duì)熒光素酶活性明顯降低(P<0.001),詳見(jiàn)圖5C。

結(jié) 果

急性肝衰竭是臨床上導(dǎo)致高病死率的嚴(yán)重臨床綜合征,既往研究指出,肝細(xì)胞凋亡與急性肝衰竭關(guān)系十分密切,大量肝細(xì)胞凋亡在急性肝衰竭疾病發(fā)展過(guò)程中起了重要的作用[8]。因此,抑制肝細(xì)胞凋亡是防治急性肝衰竭的重要途徑。在本研究中,大鼠行急性肝衰竭模型造模,造模完成后,可見(jiàn)隨造模時(shí)間的延長(zhǎng),大鼠肝功能急劇惡化;且完善肝組織病理檢測(cè)可見(jiàn)隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),大鼠的肝臟壞死程度逐漸加重,在造模后72h即可發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞發(fā)生大片狀壞死,肝組織結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞及有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。行大鼠急性肝衰竭造模后生存率分析顯示,所有造模大鼠均在5天內(nèi)死亡,上述結(jié)果均提示大鼠急性肝衰竭模型造模成功。

既往研究表明,miRNA參與急性肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展[9]。miR-204-5p定位于人類(lèi)第9號(hào)染色體73424891～73425000位之間,且該基因已被證實(shí)在許多癌癥中具有腫瘤抑制作用,如結(jié)直腸癌和胃癌,以及在多種疾病中具有調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)及氧化應(yīng)激的作用,促進(jìn)疾病發(fā)生、發(fā)展[10～13]。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),miR-204-5p參與細(xì)胞凋亡和炎癥損傷的調(diào)節(jié),被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的正調(diào)控因子[14,15]。本研究成功制造急性肝衰竭大鼠模型,并發(fā)現(xiàn)隨著急性肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展,急性肝衰竭大鼠肝功能損傷及肝細(xì)胞凋亡、壞死越重,其肝組織中miR-204-5P的相對(duì)表達(dá)水平逐漸升高。因此,miR-204-5p可能是急性肝衰竭發(fā)病機(jī)制中重要的調(diào)節(jié)因子,成為診斷及治療急性肝衰竭的新的潛在靶點(diǎn),可作為評(píng)估急性肝衰竭嚴(yán)重程度的指標(biāo),有助于早期評(píng)估患者病情,預(yù)測(cè)急性肝衰竭的發(fā)生、發(fā)展。

如前所述,miRNA通過(guò)調(diào)控靶基因的表達(dá)發(fā)揮作用。Bcl-2樣蛋白2(Bcl-2 like protein 2,BCL2L2)屬于Bcl-2蛋白家族成員,是一種控制細(xì)胞存活的抗凋亡蛋白,是細(xì)胞活力的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。BCL2L2蛋白對(duì)于內(nèi)在的凋亡途徑至關(guān)重要,在caspase依賴(lài)的細(xì)胞凋亡的調(diào)控中起著調(diào)節(jié)作用,BCL2L2通過(guò)抑制線(xiàn)粒體細(xì)胞色素c和caspase-3依賴(lài)的蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng),維持線(xiàn)粒體膜的完整性,保護(hù)細(xì)胞免于凋亡[16,17]。近年來(lái),越來(lái)越多的研究集中在miRNA對(duì)BCL2L2的調(diào)控上,通過(guò)抑制BCL2L2的表達(dá),促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18,19]。本研究中,急性肝衰竭大鼠肝組織中BCL2L2的表達(dá)水平顯著低于正常大鼠肝組織,且隨著大鼠急性肝衰竭造模后時(shí)間的推移,肝組織中BCL2L2基因的表達(dá)水平逐漸降低,且肝組織中凋亡的肝細(xì)胞逐漸增加。miR-204-5p表達(dá)水平與BCL2L2表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),且通過(guò)生物信息學(xué)分析提示了miR-204-5p和BCL2L2的靶向結(jié)合關(guān)系,并采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步證實(shí)了miR-204-5p和BCL2L2之間存在靶向關(guān)系。因此,miR-204-5p可與BCL2L2mRNA的 3′非編碼區(qū)結(jié)合,抑制BCL2L2表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡,促進(jìn)急性肝衰竭的發(fā)生及病情進(jìn)展。

本研究也存在一定的局限性,首先,本實(shí)驗(yàn)的樣本量較小,其次本實(shí)驗(yàn)未設(shè)置miR-204-5p 抑制劑組(miR-204-5p inhibitor)、miR-204-5p模擬物組(miR-204-5p mimic)等尾靜脈注射急性肝衰竭大鼠,進(jìn)一步驗(yàn)證miR-204-5p靶向調(diào)控BCL2L2的關(guān)系。因此,在后續(xù)的工作中,將加大實(shí)驗(yàn)大鼠樣本量及完善上述相關(guān)實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步評(píng)估驗(yàn)證miR-204-5p靶向調(diào)控BCL2L2促進(jìn)急性肝衰竭大鼠肝細(xì)胞凋亡的機(jī)制。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),急性肝衰竭大鼠肝組織中miR-204-5p的相對(duì)表達(dá)水平隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高,miR-204-5p通過(guò)靶向調(diào)控BCL2L2促進(jìn)肝細(xì)胞凋亡,進(jìn)而促進(jìn)急性肝衰竭疾病的發(fā)生、發(fā)展。因此,miR-204-5p可成為早期診斷、評(píng)估及治療急性肝衰竭的新的潛在靶點(diǎn)。