吳澤明 朱海金 陳 海 相 虹 常 明

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是急性肺損傷(acute lung injury, ALI)的嚴(yán)重階段,是由感染、創(chuàng)傷及休克等因素引起的急性彌漫性肺損傷,臨床上多表現(xiàn)為急性呼吸窘迫、低氧血癥及呼吸衰竭,盡管臨床上已出現(xiàn)眾多支持治療應(yīng)對ARDS,但總體病殘率仍很高,預(yù)后差[1]。ARDS發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,至今未被闡明,目前認(rèn)為大量中性粒細(xì)胞聚集、活化及凋亡引起肺部炎性反應(yīng)導(dǎo)致肺損傷是ARDS發(fā)生的病理基礎(chǔ)[2]。Brinkmann等[3]在ARDS患者肺泡灌洗液及血漿中發(fā)現(xiàn)中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps, NETs),推測NETs與肺損傷的發(fā)生密切相關(guān)。NETs是由活化的中性粒細(xì)胞釋放的染色質(zhì),其組成成分包括DNA、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MPO)等,一方面NETs利用DNA的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)抓捕病原體,同時NE、MPO等蛋白成分殺滅病原體;另一方面NE、MPO等通過誘導(dǎo)上皮和內(nèi)皮細(xì)胞連接失調(diào)或細(xì)胞死亡損害肺上皮-內(nèi)皮屏障,導(dǎo)致肺泡中蛋白質(zhì)滲出和炎性細(xì)胞的大量積累,加速ARDS的發(fā)生[4]。

本課題組前期動物研究發(fā)現(xiàn),相較于健康大鼠,肺損傷新生大鼠MPO等蛋白表達(dá)量顯著增高,游離DNA(cell-free DNA, cf-DNA)水平上升,提示急性肺損傷中存在NETs的形成[5]。Marcos等[6]研究結(jié)果提示,活化的新生兒中性粒細(xì)胞可以形成NETs。目前NETs在成人ARDS及小鼠ALI中均有研究,新生兒ARDS的研究報道較少。本研究旨在探討新生兒ARDS中是否存在NETs的形成,以及動態(tài)觀察cf-DNA/NETs的變化在新生兒ARDS病情嚴(yán)重程度及治療效果判斷中的意義,現(xiàn)報道如下。

資料與方法

1. 一般資料:前瞻性選取2020年10月～2022年4月江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院收治的需呼吸機(jī)治療的37例ARDS新生兒為ARDS組,其中男性21例,女性16例,平均胎齡為38.1±1.2周。診斷標(biāo)準(zhǔn):符合2017年蒙特勒診斷標(biāo)準(zhǔn)[7];具體如下:①明確或可疑臨床損傷后出現(xiàn)了ARDS,氧合障礙伴隨殘氣量下降,需要正壓通氣以利于肺復(fù)張;②排除與ARDS有不同的病理生理基礎(chǔ)的新生兒ARDS、新生兒短暫呼吸增快,以及先天性肺畸形、肺表面活性物質(zhì)(pulmonary surfactant, PS)合成相關(guān)基因缺陷所致ARDS;③肺部影像學(xué)顯示雙側(cè)彌漫性不規(guī)則的透光度下降、滲出或白肺,這些改變不能被其他原因完全解釋,如局部積液、肺不張、新生兒ARDS、新生兒短暫呼吸增快或先天性肺畸形等;④肺水腫引起的呼吸衰竭不能夠完全由心力衰竭來解釋;⑤根據(jù)氧合指數(shù)(oxygenation index, OI)判斷病情輕重:輕度為4≤OI<8,中度為8≤OI<16,重度為OI≥16。其中OI=(吸入氧濃度×平均氣道壓×100)/動脈血氧分壓(cmH2O/mmHg)。同時滿足上述5條標(biāo)準(zhǔn)即可以診斷為ARDS,依據(jù)第5條可知本研究ARDS組分為輕度組12例、中度組15例及重度組10例。

選擇同期分娩的27例正常新生兒為對照組,其中男性16例,女性11例,新生兒平均胎齡為38.5±0.7周。以上入選對象均征得家屬同意,本研究經(jīng)江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審核批準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號:SWYXLL20191119-14)。

2.方法: ARDS組于治療前、治療3天及治療7天3個時間點各抽取靜脈血2ml,對照組抽取一次靜脈血2ml,離心血清(離心轉(zhuǎn)速3000r/min,離心時間10min),取上層血清于-80℃冰箱保存。采用基于PicoGreen熒光染料法檢測cf-DNA/NETs水平,Quant-ItTM PicoGreen dsDNA Assay Kit購自美國Invitrogen公司;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測血漿NE及TNF-α水平,ELISA試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司。

結(jié) 果

1.ARDS組和對照組新生兒的一般資料比較:ARDS組和對照組新生兒在胎齡、出生體重及性別方面比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05),詳見表1。

表1 ARDS組和對照組新生兒的一般資料比較

2.ARDS各組和對照組新生兒的cf-DNA、NE及腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平比較:結(jié)果顯示,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(F=57.517,P<0.001;F=219.408,P<0.001;F=133.200,P=0.005)。經(jīng)兩兩比較發(fā)現(xiàn),ARDS各組cf-DNA、NE及TNF-α水平均高于對照組(P<0.05),重度組cf-DNA、NE及TNF-α水平均高于輕度組及中度組(P<0.05),中度組NE水平高于輕度組(P<0.05),但cf-DNA及TNF-α水平與輕度組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),詳見表2。

表2 ARDS各組和對照組新生兒的cf-DNA、NE及TNF-α水平比較

3.ARDS各組新生兒不同時間cf-DNA、NE及TNF-α水平比較:與治療前比較,ARDS各組治療3天及7天時cf-DNA、NE及TNF-α水平均有不同程度下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(時間:F=52.750,P<0.001;F=44.859,P<0.001;F= 62.098,P<0.001;組間:F=21.237,P<0.001;F=75.427,P<0.001;F=31.776,P=0.005;交互:F=3.042,P=0.023;F=3.047,P=0.023;F=8.618,P<0.001),詳見表3。

表3 ARDS各組新生兒不同時間cf-DNA、NE及TNF-α水平比較

4.cf-DNA與NE及TNF-α水平相關(guān)性分析:Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,cf-DNA與NE及TNF-α水平均呈正相關(guān)(P<0.05),詳見表4。

表4 cf-DNA水平與NE及TNF-α水平相關(guān)性分析

結(jié) 果

ALI/ARDS是多種因素導(dǎo)致的肺部病變,臨床上表現(xiàn)為進(jìn)行性呼吸困難和低氧血癥,在新生兒危重癥中較為常見[8]。新生兒作為人生的一個特殊階段,引起ARDS的病因與兒童及成人也有所差異,肺內(nèi)因素(肺炎、胎糞吸入綜合征)和肺外因素(敗血癥、圍生期窒息)是引起新生兒ARDS的重要原因,其自身較差的環(huán)境適應(yīng)能力、未發(fā)育完善的器官及不成熟的免疫功能更是難以阻止病情惡化,甚至死亡[9,10]。因此早期判斷病情嚴(yán)重程度,控制病情發(fā)展,有利于降低ARDS新生兒的病死率。目前認(rèn)為,各種直接或間接因素?fù)p傷上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞,引起肺泡-毛細(xì)血管屏障功能喪失,液體涌入肺泡中,造成肺水腫;同時外界刺激使中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞活化,釋放各種細(xì)胞因子產(chǎn)生持續(xù)炎性反應(yīng),如TNF-α、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6, IL-6)等,加速ARDS的進(jìn)展[2]。近年來研究顯示,ARDS患者體內(nèi)被刺激活化的中性粒細(xì)胞釋放出NETs,在此過程中,活化的肽基精氨酸脫亞胺酶4(peptidylarginine deiminase 4, PAD4)、MPO及NE共同引起組蛋白裂解,弱化組蛋白及DNA的結(jié)合力,導(dǎo)致染色質(zhì)解凝聚,核膜及細(xì)胞膜破裂后NETs釋放到細(xì)胞外發(fā)揮滅菌作用,但NE及MPO等細(xì)胞毒性作用破壞肺上皮-內(nèi)皮屏障結(jié)構(gòu)完整性,富含蛋白質(zhì)的液體向外釋放,造成肺水腫,加劇ARDS的進(jìn)展[11]。目前在多種疾病中都已發(fā)現(xiàn)NETs的參與[12,13]。通過測量NETs中的蛋白成分和DNA復(fù)合物間接反映NETs含量[14]。

在一項臨床研究中,研究者檢測未足月胎膜早破(preterm premature rupture of membranes, PPROM)新生兒及正常新生兒臍血的NE水平,發(fā)現(xiàn)PPROM組NE水平高于正常對照組,并且PPROM組中發(fā)生新生兒肺炎者NE水平高于未發(fā)生新生兒肺炎者,考慮NE對肺組織的過氧化損傷促進(jìn)新生兒肺炎的發(fā)生、發(fā)展[15]。本研究結(jié)果顯示,與對照組比較,ARDS組新生兒的NE水平上升,間接反映新生兒ARDS中存在NETs;與輕度組比較,中度組及重度組NE水平逐步升高;ARDS各組新生兒治療前NE水平均高于治療3天及7天時,推測高水平NE加重肺損傷程度,影響ARDS的進(jìn)展與預(yù)后。

既往研究發(fā)現(xiàn),肺泡巨噬細(xì)胞可分泌各種促炎性細(xì)胞因子如TNF-α等,促進(jìn)中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞及巨噬細(xì)胞聚集,并使上皮細(xì)胞及效應(yīng)T細(xì)胞活化加重肺部炎癥表現(xiàn),甚至發(fā)展為ARDS[16]。解霞等[17]通過監(jiān)測新生兒ALI肺泡灌洗液中的TNF-α水平,發(fā)現(xiàn)ALI組TNF-α高于健康對照組,ALI組治療后TNF-α水平明顯降低,提示TNF-α或許可以作為預(yù)測新生兒ALI病情程度及預(yù)后的指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示,ARDS各組新生兒的TNF-α水平均高于對照組,提示TNF-α參與ARDS的發(fā)生;ARDS各組新生兒的TNF-α水平比較,重度組高于輕度組及中度組,但輕度組與中度組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義,猜測與機(jī)體內(nèi)部抗炎有關(guān),治療后ARDS各組新生兒的TNF-α水平均下降,以上結(jié)果提示TNF-α在評估新生兒ARDS病情程度及治療效果中有一定價值。

cf-DNA是由中性粒細(xì)胞衍生而來,故可通過檢測cf-DNA來獲悉血漿中NETs的含量[18]。臨床研究中用PicoGreen熒光染料法檢測重癥肺炎并發(fā)ARDS及重癥肺炎患者外周血cf-DNA水平,結(jié)果顯示,重癥肺炎并發(fā)ARDS組cf-DNA水平較重癥肺炎組明顯升高,ARDS組治療48h后cf-DNA水平逐步下降,提示高水平的NETs影響ARDS發(fā)生、發(fā)展[19]。本課題組前期研究結(jié)果提示,ALI小鼠中存在NETs的形成,cf-DNA可以作為評估ALI小鼠肺損傷嚴(yán)重程度的指標(biāo)[5]。本研究結(jié)果顯示,ARDS各組新生兒的cf-DNA水平高于對照組,進(jìn)一步提示ARDS存在NETs形成;ARDS各組中重度組cf-DNA水平最高,輕度組與中度組cf-DNA整體水平無明顯差異,猜測體內(nèi)過量的NETs可加速ARDS進(jìn)展,治療后ARDS各組均有下降,提示監(jiān)測cf-DNA對新生兒ARDS病情嚴(yán)重及治療效果評估有一定價值。

研究發(fā)現(xiàn),在ALI/ARDS發(fā)生時,NETs激活巨噬細(xì)胞,誘導(dǎo)M0巨噬細(xì)胞分化為M1型并產(chǎn)生TNF-α等炎性介質(zhì)促進(jìn)炎性反應(yīng),同時TNF-α等也可以促進(jìn)NETs的生成,循環(huán)反復(fù)[4]。本研究結(jié)果顯示,ARDS新生兒的cf-DNA與NE及TNF-α均呈正相關(guān),考慮NETs與炎性介質(zhì)及免疫細(xì)胞相互作用,共同促進(jìn)炎性反應(yīng),影響新生兒ARDS發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述,本研究對NETs相關(guān)標(biāo)志物進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測,發(fā)現(xiàn)ARDS新生兒外周血NETs及相關(guān)標(biāo)志物NE及TNF-α水平顯著升高,病情程度越重,差異性越明顯;治療后NETs相關(guān)標(biāo)志物NE及TNF-α水平逐漸降低,且cf-DNA與NE及TNF-α均呈正相關(guān),提示cf-DNA/NETs對新生兒ARDS病情嚴(yán)重程度及治療效果評估有一定的價值。本研究后期需擴(kuò)大樣本量,延長隨訪時間,完善cf-DNA/NETs在該疾病中的作用機(jī)制,予以驗證本研究結(jié)論。