張碩穩(wěn) 李 丹 賀 靜 杜志興 鄭麗華 劉永建

乳腺癌是繼肺癌之后女性癌癥相關(guān)死亡的第二大原因,全球發(fā)生率超過200萬例,并且每年以0.3%的速度增長[1]。因此,尋找能夠有效預(yù)測乳腺癌預(yù)后的新的生物學(xué)標(biāo)志物有利于更精確地診斷和開發(fā)更好的臨床治療靶點(diǎn)。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, lncRNA)可以參與調(diào)節(jié)各種生理和病理過程,如細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲等[2]。近年來研究顯示,lncRNA在癌癥中異常表達(dá),可作為早期篩查、治療及預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物,其中l(wèi)ncRNA LINC00467作為腫瘤促進(jìn)基因參與各種類型的癌癥。例如,lncRNA LINC00467在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中高表達(dá),敲除后可在體外抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移,可作為潛在的預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物,在結(jié)直腸癌的進(jìn)展中至關(guān)重要[3]。微小RNA(microRNA, miRNA)在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮重要作用,其表達(dá)異常影響腫瘤細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移,miR-4735-3p是研究較少的家族成員之一,之前在膀胱癌細(xì)胞中的研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤作用[4～6]。lncRNA LINC00467和miR-4735-3p在癌癥中具有重要作用,但在乳腺癌中的研究尚未見報(bào)道,本研究檢測了lncRNA LINC00467和miR-4735-3p在乳腺癌組織中的表達(dá)情況,旨在分析其表達(dá)水平與乳腺癌患者臨床預(yù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系,為尋找乳腺癌臨床治療靶點(diǎn)和預(yù)后指標(biāo)提供新的見解。

對象與方法

1.一般資料:回顧性選取2017年4月～2019年4月于河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院接受乳腺癌改良根治術(shù)治療的109例乳腺癌患者,均為女性,患者年齡31～68歲,平均年齡為50.07±9.65歲;腫瘤最大徑0.53～5.23cm,平均最大徑為3.14±0.96cm;腫瘤分化程度:低分化31例,中分化48例,高分化30例;TNM分期[7]:Ⅰ期38例,Ⅱ期42例,Ⅲ期29例。在手術(shù)過程中收集乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織(經(jīng)病理診斷),立即置于液氮中短暫保存,術(shù)后保存至-80℃超低溫冰箱直至使用。本研究經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)(倫理學(xué)審批號:LS-2017第63號),患者均簽署知情同意書。

2.納入與排除標(biāo)準(zhǔn):納入標(biāo)準(zhǔn):①患者均參照《乳腺癌診療規(guī)范(2018年版)》中的乳腺癌診斷標(biāo)準(zhǔn)確診[7];②均為初診病例,術(shù)前未進(jìn)行過乳腺癌的相關(guān)治療;③術(shù)前檢查證實(shí)均不存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。排除標(biāo)準(zhǔn):①術(shù)前接受過其他治療的患者;②全身性感染或合并其他惡性疾病的患者;③不配合治療的患者。

3.總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄:取出凍存的乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織解凍,使用TRIzol試劑盒(批號:RK90273J,上海通蔚生物科技有限公司)提取總RNA,并通過核酸蛋白儀(型號:NanoDrop One/OneC,上海嘉鵬科技有限公司)評估RNA的純度(A260/A280>1.8)。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號:LK90172,上海嘉鵬科技有限公司)將大約1μg的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,-20℃條件下保存?zhèn)溆谩?/p>

4.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR)技術(shù)檢測lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表達(dá)水平:以GAPDH和U6作為內(nèi)參,RT-qPCR分析的所有引物由上海通蔚生物科技有限公司合成,引物序列詳見表1。根據(jù)RT-qPCR試劑盒(批號:LK35172,上海嘉鵬科技有限公司)的說明書,在RT-qPCR儀(型號:CFX130,上海巴玖實(shí)業(yè)有限公司)上進(jìn)行反應(yīng),反應(yīng)條件如下:95℃預(yù)變性30s,隨后95℃變性5s,60℃退火30s,循環(huán)45次。檢測得到的數(shù)據(jù)使用2-ΔΔCt方法計(jì)算lncRNA LINC00467(內(nèi)參GAPDH)和miR-4735-3p(內(nèi)參U6)的相對表達(dá)水平。

表1 RT-qPCR引物序列

5.隨訪乳腺癌預(yù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況:對所有患者進(jìn)行3年的術(shù)后隨訪,主要是通過門診復(fù)查的方式,隨訪時(shí)間從手術(shù)當(dāng)天開始,隨訪截止日期為2022年4月30日,主要記錄術(shù)后乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況。

結(jié) 果

1.乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表達(dá)水平比較:與癌旁正常乳腺組織比較,乳腺癌組織lncRNA LINC00467表達(dá)水平較高,miR-4735-3p表達(dá)水平較低(P<0.05,表2)。

表2 乳腺癌組織和癌旁正常乳腺組織lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表達(dá)水平比較

2.復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組和未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組患者的臨床資料比較:隨訪結(jié)果顯示3例患者失訪,31例出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移(復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組),75例未出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移(未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組)。復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組和未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組患者的年齡、腫瘤最大徑及腫瘤分化程度比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),而TNM分期比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表3)。

表3 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組和未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組患者的臨床資料比較

3.復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組和未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組乳腺癌組織lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表達(dá)水平比較:與未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組比較,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組乳腺癌組織lncRNA LINC00467表達(dá)水平較高,miR-4735-3p表達(dá)水平較低(P<0.05,表4)。

表4 復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組和未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組乳腺癌組織lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表達(dá)水平比較

4.乳腺癌組織lncRNA LINC00467與miR-4735-3p表達(dá)水平的相關(guān)性:經(jīng)ENCORI數(shù)據(jù)庫預(yù)測,lncRNA LINC00467與miR-4735-3p存在相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)(圖1);乳腺癌組織lncRNA LINC00467與miR-4735-3p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.492,P=0.000,圖2)。

圖1 lncRNA LINC00467與miR-4735-3p靶向關(guān)系預(yù)測

圖2 乳腺癌組織lncRNA LINC00467與miR-4735-3p表達(dá)水平的相關(guān)性分析

5.影響乳腺癌患者術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的因素分析:以乳腺癌患者術(shù)后3年內(nèi)是否發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移(發(fā)生=1,未發(fā)生=0)作為因變量,以表3和表4中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo),即以TNM分期(Ⅰ期=0,Ⅱ期=1,Ⅲ期=2)及乳腺癌組織lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表達(dá)水平(連續(xù)變量)作為自變量進(jìn)行多因素Logistic回歸分析。結(jié)果顯示,TNM Ⅲ期及l(fā)ncRNA LINC00467表達(dá)水平是影響乳腺癌患者術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,而miR-4735-3p表達(dá)水平是保護(hù)因素(P<0.05,表5)。

表5 影響乳腺癌患者術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的多因素Logistic回歸分析

6.乳腺癌組織lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表達(dá)水平對術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價(jià)值:ROC曲線分析結(jié)果顯示,乳腺癌組織lncRNA LINC00467、miR-4735-3p以及兩者聯(lián)合預(yù)測術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的AUC分別為0.784、0.842、0.943;兩者聯(lián)合預(yù)測變量方程為z=0.498×lncRNA LINC00467-0.327×miR-4735-3p-8.154,兩者聯(lián)合優(yōu)于lncRNA LINC00467、miR-4735-3p單獨(dú)預(yù)測(z=2.863、2.016,P=0.004、0.044,詳見圖3和表6)。

圖3 乳腺癌組織lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表達(dá)水平預(yù)測術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的ROC曲線

表6 乳腺癌組織lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表達(dá)水平對術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的預(yù)測價(jià)值

結(jié) 果

乳腺癌患者的早期篩查和臨床治療手段已取得了一定的進(jìn)展,但其耐藥性、轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)仍然是最主要的障礙,導(dǎo)致乳腺癌患者的預(yù)后較差[8]。乳腺癌的治療手段通常與患者預(yù)后有關(guān),隨著特效藥的臨床使用,患者的生存率得到提高[9]。故亟需一種有效的預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物,為研究新的乳腺癌的臨床治療措施提供參考。

lncRNA和miRNA是基因表達(dá)的主要調(diào)節(jié)因子,并且是癌癥發(fā)病機(jī)制中的重要功能介質(zhì)[10, 11]。lncRNA通過直接或間接相互作用促進(jìn)癌癥的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)和耐藥性,可以作為潛在的有效生物學(xué)標(biāo)志物[12]。lncRNA LINC00467是一種新型的lncRNA,其表達(dá)升高能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活并抑制細(xì)胞凋亡,在神經(jīng)母細(xì)胞瘤、食管癌等多種腫瘤中發(fā)揮相似的功能,作為致瘤基因參與癌癥的發(fā)生和進(jìn)展,被視為一個(gè)潛在的癌癥預(yù)后標(biāo)志物[13]。本研究結(jié)果顯示,lncRNA LINC00467在乳腺癌組織中表達(dá)上調(diào),與之前報(bào)道的觀點(diǎn)一致,可能在乳腺癌中具有腫瘤促進(jìn)作用,表明lncRNA LINC00467的表達(dá)失調(diào)可能與乳腺癌的發(fā)病機(jī)制存在一定的關(guān)聯(lián)[13, 14]。

與lncRNA一樣,miRNA在大多數(shù)癌癥中也表達(dá)失調(diào),包括乳腺癌[15]。最近有報(bào)道稱lncRNA可以通過影響miRNA參與調(diào)控基因的表達(dá),進(jìn)而調(diào)節(jié)各種類型的癌癥[16, 17]。Teng等[6]和Li等[18]研究顯示,lncRNA ARAP1-AS1與miR-4735-3p結(jié)合調(diào)控下游靶基因表達(dá)從而調(diào)節(jié)膀胱癌和卵巢癌的進(jìn)展,并且表明miR-4735-3p能夠抑制膀胱癌腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲,在膀胱癌細(xì)胞中具有抗癌作用。本研究結(jié)果顯示,與癌旁正常乳腺組織比較,miR-4735-3p表達(dá)水平在乳腺癌組織中下調(diào),表明其在乳腺癌中可能具有腫瘤抑制作用。lncRNA和miRNA之間的相互作用在乳腺癌的進(jìn)展和復(fù)發(fā)等方面起著至關(guān)重要的作用[12,19]。本研究利用ENCORI數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站,預(yù)測lncRNA LINC00467與miR-4735-3p有相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)。因此,本研究進(jìn)一步分析兩者的相關(guān)性,結(jié)果顯示,乳腺癌組織中l(wèi)ncRNA LINC00467與miR-4735-3p表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān),隨著lncRNA LINC00467的表達(dá)上調(diào),miR-4735-3p的表達(dá)降低。說明lncRNA LINC00467可能通過負(fù)向調(diào)節(jié)miR-4735-3p在乳腺癌的進(jìn)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用,下一步筆者將通過體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證兩者的關(guān)系。

乳腺癌的治療效果可能受到潛在發(fā)病機(jī)制的限制,結(jié)合lncRNA LINC00467和miR-4735-3p在乳腺癌組織中的表達(dá)情況,本研究分析了兩者與乳腺癌患者術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的關(guān)系,結(jié)果顯示,復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組乳腺癌組織lncRNA LINC00467表達(dá)水平較未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組高,miR-4735-3p的表達(dá)水平較未復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移組低,表明lncRNA LINC00467異常升高可能與乳腺癌患者術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的發(fā)生有關(guān)。關(guān)于lncRNA LINC00467高表達(dá)與不良預(yù)后密切相關(guān)的研究在結(jié)直腸癌和骨質(zhì)瘤等癌癥中均有報(bào)道[3,20]。本研究結(jié)果顯示,乳腺癌組織lncRNA LINC00467表達(dá)水平是影響乳腺癌患者術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,與以往的研究類似,提示lncRNA LINC00467的高表達(dá)可能與乳腺癌患者術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān),可作為評估乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的潛在指標(biāo)。目前關(guān)于miR-4735-3p在臨床中的研究較少,本研究結(jié)果顯示,乳腺癌組織miR-4735-3p表達(dá)水平是影響乳腺癌患者術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的保護(hù)因素,其表達(dá)水平越低,越容易發(fā)生復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。此外,本研究還繪制了ROC曲線,結(jié)果顯示,乳腺癌組織lncRNA LINC00467、miR-4735-3p表達(dá)水平用于預(yù)測乳腺癌患者術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有較好的價(jià)值,且兩者聯(lián)合具有更高的AUC,敏感度也相應(yīng)提高,更有利于評估乳腺癌患者術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移情況。

綜上所述,乳腺癌組織中l(wèi)ncRNA LINC00467高表達(dá),miR-4735-3p低表達(dá),兩者均可用于預(yù)測乳腺癌患者術(shù)后3年內(nèi)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移,且兩者聯(lián)合預(yù)測價(jià)值更高,推測lncRNA LINC00467可能負(fù)向調(diào)節(jié)miR-4735-3p參與乳腺癌的進(jìn)展,但本研究使用的樣本量較小,可能使結(jié)果具有局限性,后期將開展大樣本量研究對其發(fā)病機(jī)制進(jìn)行深入探討。