任丹丹 王 成

低溫保存是一種利用零下溫度將活細(xì)胞、組織和器官等生物樣品長期保存的方法[1]。低溫保存方法有玻璃化冷凍和慢速冷凍。慢速冷凍是指使用可編程冷凍機(jī),低速度降低冷凍含有活細(xì)胞或組織的液體。玻璃化冷凍是快速冷卻,添加高濃度冷凍保護(hù)劑,使活細(xì)胞或組織的液體轉(zhuǎn)化為玻璃樣無定形固體,避免形成有害的冰。玻璃化冷凍因操作更為簡便、耗時(shí)更短、費(fèi)用更低、凍融效果更好等優(yōu)勢(shì),常被用于組織的低溫保存。

生物樣品的冷凍通常伴隨著許多不良后果,如細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的冷凍損傷和滲透應(yīng)激。冷凍保護(hù)劑(cryoprotective agents, CPA)的添加可以防止這些不利影響。冷凍保護(hù)劑分為滲透性和非滲透性兩大類[2]。常用的滲透性CPA,如乙二醇(ethylene glycol, EG)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)和甘油,是能夠穿透質(zhì)膜并與水分子形成氫鍵以降低冰點(diǎn)而防止細(xì)胞內(nèi)外結(jié)冰的小分子。對(duì)組織進(jìn)行玻璃化冷凍時(shí),高濃度的滲透CPA具有極強(qiáng)的毒性。為了降低這種毒性帶來的損傷風(fēng)險(xiǎn),通常使用兩個(gè)或更多滲透CPA的組合來冷凍保存組織。盡管通過以上方式進(jìn)行優(yōu)化取得了一定積極的結(jié)果,但研究發(fā)現(xiàn)解凍后組織的活性和功能欠佳[3]。非滲透性CPA是一種大分子,包括糖類和高分子量聚合物。與滲透性CPA比較,它們的細(xì)胞毒性相對(duì)較小。在冷卻過程中不會(huì)穿透質(zhì)膜,留在細(xì)胞和組織外的隔室中,以促進(jìn)玻璃的形成。而非滲透性和滲透性CPA的組合可能會(huì)因減少滲透性CPA的細(xì)胞毒性作用,改善組織玻璃化冷凍的結(jié)果[4]。

糖類作為主要的非滲透性冷凍保護(hù)劑,已單獨(dú)或者添加在冷凍保護(hù)液中用于不同類型的細(xì)胞或組織的冷凍保存中。本文將簡述常用不同糖類保護(hù)劑的理化性質(zhì),重點(diǎn)從糖類保護(hù)劑機(jī)制的研究及不同糖類保護(hù)劑在胚胎、卵巢、睪丸等組織冷凍保存中的應(yīng)用展開綜述。

一、糖類的理化特性

糖類一般分為單糖、雙糖及多糖,主要由碳、氫、氧3種元素組成,是多羥基醛或多羥基酮及其縮聚物和某些衍生物的總稱。因化學(xué)分子式可寫成Cx(H2O)x,被稱為碳水化合物。在生命活動(dòng)過程中起著重要的作用,是一切生命體維持生命活動(dòng)所需能量的主要來源[5]。

1.單糖:葡萄糖、果糖是目前常被作為冷凍保護(hù)劑的六碳單糖,分子通式為C6H12O6。葡萄糖是自然界分布最廣的一種單糖,它是一種多羥基醛,易溶于水,微溶于乙醇,不溶于乙醚,是活細(xì)胞的能量來源和新陳代謝的中間產(chǎn)物,為生物的主要供能物質(zhì)[2,5]。果糖是葡萄糖的同分異構(gòu)體,通常為黏稠性液體,易溶于水、乙醇和乙醚。滲透性好,能較快地穿透細(xì)胞組織,同時(shí)溶解度高,難結(jié)晶,防腐性能好,具有較好的保藏效果。30%的果糖溶液冰點(diǎn)是-5℃,其冷凍性能與易控制冰晶生成的特性,使它常應(yīng)用于冰淇淋和其他冷飲加工[6]。

2.雙糖:Kim等[7]研究認(rèn)為,蔗糖和海藻糖是所有雙糖中最有效的低溫保護(hù)劑。蔗糖和海藻糖都是天然的非還原糖,具有相同化學(xué)式C12H22O11,但具有不同幾何結(jié)構(gòu)的雙糖分子。蔗糖由1分子葡萄糖和1分子果糖組成,化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,水溶解度高,一般不發(fā)生反應(yīng),除非酶的催化水解,是光合產(chǎn)物運(yùn)輸?shù)闹饕问健６Ｔ逄欠肿佑?個(gè)糖苷鍵連接的葡萄糖環(huán)組成,廣泛分布于細(xì)菌、真菌和動(dòng)植物的體內(nèi),由于其結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,無毒性,以及抗低溫、耐干燥和穩(wěn)定的化學(xué)性質(zhì),常作為保護(hù)劑應(yīng)用于各種生物材料的低溫保存[8]。棉子糖是一種由果糖、葡萄糖和半乳糖組成的三糖,也被應(yīng)用在組織的冷凍保存[9]。

3.多糖:多糖是由糖苷鍵結(jié)合的糖鏈,至少要超過10個(gè)單糖組成的聚合糖高分子碳水化合物。由相同的單糖組成的多糖稱為同多糖,如葡聚糖。以不同的單糖組成的多糖稱為雜多糖,如胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)、枸杞多糖(lycium barbarum polysaccharides, LBP)、附子多糖(fuzi-polysaccharides, FPS)等。多糖分子屬于極性大分子,呈弱酸性,易溶于水、乙醇,且無毒、無害等。天然廣泛存在于動(dòng)植物、真菌和微生物體中,因此也容易獲取[10]。

二、糖類抗冷凍機(jī)制

Maximow在1912年發(fā)現(xiàn)糖可能是冷凍前使用的第1種保護(hù)性添加劑,單糖和雙糖都能被用于低溫保存,但蔗糖、海藻糖等雙糖比單糖應(yīng)用更廣泛[2]。根據(jù)糖類糖苷鍵的相對(duì)分子質(zhì)量、組成、結(jié)構(gòu)和大小影響其穿透細(xì)胞膜的能力,糖類屬于非滲透性冷凍保護(hù)劑,其相關(guān)的保護(hù)機(jī)制總結(jié)如下。

1.糖可減少冰晶形成,提高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。冰晶通常在一定的溫度范圍內(nèi)即-60℃～0℃形成。這種過度會(huì)使細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外冰晶形成,冰晶會(huì)對(duì)多種生物膜產(chǎn)生機(jī)械或者生物化學(xué)應(yīng)力,導(dǎo)致細(xì)胞組織結(jié)構(gòu)和功能損傷。添加冷凍保護(hù)劑和玻璃化能解決這一問題[1]。糖類非滲透CPA補(bǔ)充到冷凍介質(zhì)中不能透過質(zhì)膜,而是在質(zhì)膜之間濃縮形成緩沖層,或吸附在質(zhì)膜表面形成黏層防止冰晶的產(chǎn)生。在凍存過程中使細(xì)胞組織部分脫水,而不直接與質(zhì)膜發(fā)生反應(yīng)[11]。玻璃化在降溫過程中能以極快的速度越過冰晶形成的溫度區(qū),使水分子來不及形成冰結(jié)晶而造成水分子無次序地排列形成均勻的團(tuán)塊。糖類CPA通過增加玻璃化溶液的黏度,提高玻璃化溶液所需的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度,使玻璃態(tài)的體系穩(wěn)定,不容易發(fā)生物理和化學(xué)變化[12]。例如,200g/L蔗糖溶液(-30℃)的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高于含有200g/L EG(-85℃)或200g/L甘油(-65℃)的溶液。

2.糖能保護(hù)組織細(xì)胞質(zhì)膜及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性。這些包括還原雙糖,如麥芽糖、乳糖,以及非還原雙糖,如海藻糖、蔗糖。單糖有果糖、葡萄糖[13]。用于低溫保存的幾種糖中,海藻糖最適合在低溫保存過程中穩(wěn)定蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜。與水和水的相互作用比較,海藻糖與水的相互作用緊密,冷卻時(shí)與細(xì)胞磷脂的極性頭基團(tuán)相互作用,形成圍繞細(xì)胞的玻璃殼,防止細(xì)胞膜雙層結(jié)構(gòu)的破壞,同時(shí)海藻糖的羥基能結(jié)合蛋白質(zhì)分子表面部分,減緩蛋白質(zhì)聚集的速度可防止蛋白質(zhì)變性[14]。在低溫保護(hù)介質(zhì)中,部分還原糖結(jié)合細(xì)胞膜的碳水化合物結(jié)構(gòu)——糖萼,供特定細(xì)胞適應(yīng)某些溫度和化學(xué)物質(zhì)。如麥芽糖具有半縮醛羥基,在溶液中以環(huán)狀和醛兩種形式存在。而精子膜表面的糖萼是一層致密的碳水化合物層,在精子冷凍/解凍過程中糖萼的變化會(huì)影響精子的存活率和活力。使用麥芽糖在公雞精液冷凍/解凍培養(yǎng)基中,可穩(wěn)定精子質(zhì)膜糖萼,提高精子存活率和活力[15]。

3.糖可維持組織細(xì)胞升溫時(shí)的滲透體積,避免過度膨脹和滲透性休克。在變暖期間,細(xì)胞外CPA濃度迅速降低,導(dǎo)致滲透失衡,使細(xì)胞過度膨脹,最終細(xì)胞溶解。單糖和雙糖在溫水溶液中增加了黏度,被用作滲透反作用力,以限制水滲透到細(xì)胞,防止腫脹損傷。例如,Angel-Velez等[16]在等滲保存介質(zhì)溶液中加熱馬卵母細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)與含有0.4mol/L海藻糖的基礎(chǔ)溶液比較,等滲培養(yǎng)基的囊胚率明顯下降。

4.與滲透性冷凍保護(hù)劑比較,糖類冷凍保護(hù)劑最大的優(yōu)勢(shì)是毒性小或無毒。在輔助滲透性CPA形成玻璃化時(shí),糖類有助于增加玻璃化溶質(zhì)的黏度和張力,減少滲透性CPA的用量而降低細(xì)胞毒性。DMSO作為廣泛使用的滲透性保護(hù)劑,具有一定的生物毒性,在移植凍存的組織前需快速洗脫,而這一步耗時(shí)且較困難。海藻糖無毒性,不同濃度海藻糖對(duì)于生殖組織具有保護(hù)作用。將海藻糖與DMSO聯(lián)用能夠顯著提高羊睪丸組織冷凍保存后的總細(xì)胞活力[17]。

5.冷凍保護(hù)劑抗氧化能力也是保存組織成功的要素。離體組織細(xì)胞在缺血缺氧期間會(huì)導(dǎo)致活性氧成分的增加,并可通過多種途徑導(dǎo)致細(xì)胞損傷或死亡。糖類抗氧化的主要機(jī)制有清除自由基、增強(qiáng)抗氧化酶活性、抑制脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生、抑制細(xì)胞凋亡等[18,19]?？寡趸嗵窃诩仪菥永鋬霰４娴难芯肯鄬?duì)較多,如海帶多糖和LBP聯(lián)合對(duì)山羊精液冷凍保存,提高了精子的活力,以及精子質(zhì)膜、頂體、脫氧核糖核酸的完整性[20]。

三、單糖-雙糖在組織保存中的應(yīng)用

1.胚胎:胚胎冷凍是輔助生殖的核心技術(shù)之一,胚胎的冷凍保存有利于不孕癥或因自身疾病暫時(shí)不能生育的人群。其次,保存遺傳資源,有利于解決面臨滅絕威脅的動(dòng)物的繁殖。胚胎的冷凍保存時(shí),玻璃化冷凍優(yōu)于慢速冷凍,目前已應(yīng)用于許多物種,包括人類、魚類、家禽。

用于胚胎玻璃化冷凍保存的糖類保護(hù)劑中,常用的單糖有果糖、葡萄糖,雙糖有海藻糖與蔗糖。Lin等[21]用濃度均為1mol/L的海藻糖、蔗糖、乳糖、果糖和葡萄糖5種非滲透性冷凍保護(hù)劑處理座頭石斑魚胚胎。結(jié)果顯示,經(jīng)海藻糖、蔗糖和乳糖處理后的胚胎存活率均>86.97%,正常胚胎發(fā)育率均>86.01%。在相同濃度下,海藻糖、蔗糖和乳糖的毒性水平低于果糖和葡萄糖。李振通等[22]比較分析了相同濃度的葡萄糖、果糖、蔗糖和海藻糖對(duì)胚星斑川鰈胚胎的保護(hù)作用,發(fā)現(xiàn)含有蔗糖和海藻糖的玻璃化液對(duì)胚胎的保護(hù)效果優(yōu)于另外兩種單糖,胚胎的成活率與孵化率相對(duì)較高,最高可達(dá)到80%左右。因此,雙糖更適用于魚類胚胎的玻璃化冷凍。

含有蔗糖的玻璃化冷凍液和加溫介質(zhì)可以提高胚胎解凍后的存活率、囊胚的再擴(kuò)張率和孵化率。玻璃化冷凍液中蔗糖的濃度范圍為0.4～1.0mmol/L。加溫介質(zhì)中蔗糖的濃度范圍為0.13～1.00mol/L,在此濃度范圍內(nèi)的蔗糖在玻璃化冷凍后的非人類胚胎中獲得了80%以上的存活率和48%的孵化率。而人類胚胎的臨床應(yīng)用顯示出95%以上的存活率、25%的妊娠率。代替蔗糖,玻璃化冷凍液中海藻糖的濃度范圍為0.25～1.00mol/L。在此濃度范圍內(nèi),玻璃化冷凍后非人胚胎的存活率和孵化率分別達(dá)到68%和47%。其中1mol/L的海藻糖在玻璃化冷凍的人類胚胎的臨床應(yīng)用中顯示出96%以上的存活率、25%的妊娠率[4,12,21]。

糖類保護(hù)劑和滲透性CPA結(jié)合起來,可以降低滲透性CPA的濃度,減小玻璃化冷凍液的毒性,改善胚胎解凍后存活率和功能。Bartolac等[4]用含有0.4mol/L蔗糖與17%的DMSO和EG玻璃化冷凍液冷凍豬囊胚時(shí),提高了復(fù)溫后囊胚的存活率,降低了單獨(dú)使用EG和DMSO產(chǎn)生的毒性效應(yīng)。總體而言,在胚胎組織的的冷凍保存和復(fù)溫過程中添加糖類保護(hù)劑,特別是蔗糖,有利于提高不同物種胚胎凍存后的活力和功能特性。

2.卵巢和睪丸:生殖組織冷凍保存對(duì)于保存哺乳動(dòng)物的生育能力至關(guān)重要。生殖組織的凍存方法存在爭議,因?yàn)樯辰M織的冷凍保存與種類、CPA濃度、冷凍載體選擇等因素相關(guān)。對(duì)于卵巢組織,目前認(rèn)為玻璃化冷凍比慢速冷凍更有利。

(1)卵巢:與胚胎類似,在玻璃化冷凍液中添加蔗糖和海藻糖可顯著提高卵巢組織解凍后卵泡的活力。玻璃化冷凍液中蔗糖的濃度范圍為0.25～0.75mol/L,最常用的為0.50mol/L。加溫介質(zhì)中蔗糖的濃度范圍為0.125～1.000mol/L,而濃度通常從1mol/L開始遞減。在這樣的濃度范圍內(nèi),蔗糖使卵泡存活率超過85%,并保持了哺乳動(dòng)物卵巢組織的功能特性。玻璃化冷凍液中海藻糖的濃度范圍為0.1～0.5mol/L。在這樣的濃度范圍內(nèi),海藻糖使卵泡存活率超過75%[9,12]。將雙糖與高分子量聚合物相結(jié)合,也可進(jìn)一步提高卵巢組織解凍后卵泡的活力。例如:在含有蔗糖的玻璃化冷凍液中添加2.5%聚乙烯吡咯烷酮[23]。

在比較雙糖對(duì)貓卵巢組織玻璃化冷凍后卵泡活力的影響研究中發(fā)現(xiàn),相同濃度的海藻糖比蔗糖更適合于貓卵巢組織的玻璃化冷凍[9]。而Tian等[23]用0.2mol/L的蔗糖和海藻糖玻璃化冷凍液保存人卵巢組織,通過比較凍存后卵巢組織卵泡形態(tài)和應(yīng)力松弛行為。結(jié)果顯示,蔗糖作為冷凍保護(hù)劑在人卵巢組織冷凍保存中的效果與海藻糖無顯著差異。

糖類CPA與滲透性CPA組合,可以提高卵巢組織冷凍保存后的功能和活性。例如,40% EG與0.1mol/L或者0.5mol/L的蔗糖和海藻糖、0.1mol/L的棉子糖組合或不組合玻璃化凍存貓卵巢碎片。結(jié)果顯示,EG與海藻糖組合的冷凍液,使卵巢組織解凍后的正常卵泡的百分占比最高[9]。杜天奇等[18]將海藻糖與滲透保護(hù)劑DMSO對(duì)比研究發(fā)現(xiàn),海藻糖冷凍復(fù)蘇后羊完整卵巢中卵泡形態(tài)結(jié)構(gòu),基質(zhì)細(xì)胞密度的維持更好,并且海藻糖具有一定的抗凋亡活性?？傊?在卵巢玻璃化冷凍液中,糖類CPA無論是單獨(dú)使用還是作為輔助添加劑,都有利于保留卵巢組織凍存后的形態(tài)和功能。

(2)睪丸:葡萄糖、蔗糖、海藻糖被應(yīng)用于睪丸組織的低溫保存。張嘯龍等[19]研究證明,分別添加0.1mol/L蔗糖或海藻糖對(duì)睪丸生精細(xì)胞低溫冷凍均具有保護(hù)作用,而同時(shí)添加可顯著提高睪丸組織冷凍復(fù)蘇后生精細(xì)胞活率和復(fù)蘇率,降低細(xì)胞凋亡率及低溫凍存對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的損傷。

玻璃化冷凍保存睪丸組織近年來被嘗試。玻璃化冷凍液中蔗糖的濃度范圍為0.5～0.6mol/L。加溫介質(zhì)中蔗糖的濃度范圍為0.25～1.00mol/L。在這樣的濃度范圍內(nèi),蔗糖使鼠睪丸組織的存活率超過84.0%,并保持了功能。睪丸組織在含有0.5mol/L海藻糖的培養(yǎng)液中玻璃化冷凍,存活率為73.6%[12,17,19]。

四、多糖在組織保存中的應(yīng)用

葡聚糖在冷凍過程中的主要作用是改變?nèi)芤旱酿ざ纫赃m應(yīng)溫度,降低組織解凍后破裂的傾向。通過減輕冷凍保存過程中產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力,并在胚胎周圍建立黏性基質(zhì),防止升溫過程中固體和液體之間的過渡階段結(jié)晶。從而保護(hù)胚胎免受冷凍損傷。在單獨(dú)含有10%葡聚糖的培養(yǎng)液中玻璃化冷凍的兔胚胎解凍后,94%～99%的玻璃化胚胎未受損傷,在擴(kuò)張囊胚時(shí)的發(fā)育率達(dá)到76%～79%。

EPS是由微生物合成和分泌的糖基聚合物。假單胞菌產(chǎn)生的EPS ID1是一種以葡萄糖、半乳糖和巖藻糖為主,含有少量糖醛酸和氨基酸的高分子雜多糖。EPS ID1對(duì)產(chǎn)生菌具有顯著的冷凍保護(hù)作用,這意味著它可以單獨(dú)或與其他CPA聯(lián)合用作細(xì)胞冷凍保存的試劑。因此,Tania等在玻璃化冷凍液中添加EPS ID1用于冷凍保存牛胚胎[24]。結(jié)果顯示,在玻璃化冷凍液和加溫介質(zhì)中添加10μg/ml的EPS ID1,可以保護(hù)牛卵母細(xì)胞免受冷凍損傷,并且對(duì)細(xì)胞凋亡有正向調(diào)節(jié)作用。推測(cè)EPS ID1可能抑制冰再結(jié)晶活性、抗氧化損傷而對(duì)牛囊胚提供冷凍保護(hù)作用。

LBP是來源于枸杞子的主要化學(xué)活性成分,由有半乳糖醛酸、葡萄糖和阿拉伯糖三大單糖聚合而成,具有調(diào)節(jié)激素、控制氧化應(yīng)激及抑制細(xì)胞凋亡而保護(hù)生殖組織。蔡玉芳等[25]研究發(fā)現(xiàn),400mg/L的LBP有利于卵巢組織的保存,并可顯著提高冷凍卵巢組織移植后的存活率。FPS是附子的主要活性成分之一,由葡萄糖和阿拉伯糖聚合而成,無毒,具有調(diào)節(jié)血糖、血脂,抗氧化應(yīng)激及保護(hù)血管的平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞的作用。本課題組前期將FPS引入血管的深低溫保護(hù)研究中發(fā)現(xiàn),10mg/ml的FPS對(duì)大鼠腹主動(dòng)脈具有保護(hù)作用,對(duì)機(jī)制進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn),FPS可通過改善線粒體功能障礙并減輕組織氧化損傷,保護(hù)了深低溫保存中腹主動(dòng)脈線粒體結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定,為后期血管生存保存體力[26]。

目前多糖對(duì)組織冷凍保存的作用在國內(nèi)外鮮有報(bào)道,但通過以上相關(guān)研究表明,多糖相對(duì)分子質(zhì)量過大,不能穿過質(zhì)膜,使組織內(nèi)外滲透壓不同而脫水。同時(shí),多糖具有一定的黏稠性,可包圍于組織周圍使組織內(nèi)冰晶數(shù)量減少,提高組織保存的效果。中藥多糖抗氧化應(yīng)激的能力強(qiáng)、安全性大的特點(diǎn)對(duì)于提高組織凍存后的活力起著很重要的作用。

五、展 望

糖類屬于非滲透性保護(hù)劑,不同糖類的理化性質(zhì)、冷凍保護(hù)機(jī)制存在一定差別。同一類組織凍存中用不同糖有著不同的保存效果,而同一種糖在不同組織冷凍保存中也存在明顯的差異。玻璃化冷凍液和復(fù)溫時(shí)的加溫介質(zhì)中,糖的選擇和糖的濃度都應(yīng)得到優(yōu)化,以最大限度地減少冷凍對(duì)組織細(xì)胞的傷害,保持生物組織的高活性和功能性。目前添加糖CPA玻璃化冷凍的生殖組織的體外培養(yǎng)和異種移植被證明可以產(chǎn)生用于體外受精的功能性生殖細(xì)胞。人類胚胎、卵巢的玻璃化冷凍后移植的活產(chǎn)病例已有報(bào)道,但由于目前臨床數(shù)據(jù)較少,玻璃化冷凍的臨床意義尚無法估計(jì),還需要開展更多臨床研究確定其安全性和有效性。因此,含有糖類非滲透性CPA介質(zhì)的玻璃化冷凍液對(duì)于組織解凍后,進(jìn)一步的體內(nèi)研究還很欠缺。另外,多糖對(duì)于組織細(xì)胞的冷凍保存有很好的應(yīng)用前景,需要開展進(jìn)一步的探索,以適用于更多不同類型組織的冷凍保存。