劉小磊 熊正方

隨著生活水平的提高、生育政策開放以及女性生育年齡增大等因素,女性不孕率也在逐年增高,因此,輔助生殖技術就顯得越來越重要[1]。較基因組學和蛋白組學而言,代謝組學具有非侵入性、安全性高、樣本易獲得等優(yōu)點,近年來被人們所熟知和應用。通過對不孕女性卵泡液代謝物進行測定及篩選,可以間接反映卵母細胞的代謝水平,從而能夠預測卵母細胞的發(fā)育潛能。本文就其近年來的研究進展做一介紹。

一、代謝組學研究進展

代謝組是指生物體某種狀態(tài)下細胞、組織、器官或體內(nèi)內(nèi)源性小分子代謝物的總稱。代謝組學對中小分子物質(zhì)進行定性和定量測定與分析,是一門繼基因、轉錄和蛋白組學后,新興起來的學科,能更加直接、精確地反映生物體的生理狀態(tài)。生物體代謝組學通常利用磁共振成像或質(zhì)譜檢測技術分析生物體液代謝物,用來反映外界刺激、變化或者細胞代謝應答變化。

卵泡液代謝組學分析技術是一種非侵入的方法,通過測量卵泡液中代謝物種類及含量,找到潛在生物學標志物,對差異代謝物與臨床和實驗室數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析,從而對卵母細胞質(zhì)量和發(fā)育潛能更好地預測及評估。在檢測方式上,分為非靶向分析和靶向分析兩類。其中,非靶向分析通常建立在高分辨質(zhì)譜儀上,依賴高分辨率質(zhì)量分析器,對各類代謝物進行大規(guī)模、無偏向、系統(tǒng)性檢測,最大程度反映生物體代謝水平;而靶向分析建立在單位質(zhì)量分辨儀的質(zhì)譜儀上,對感興趣的代謝物進行選擇性、特異性地檢測,適用于特定關注的代謝物檢測。代謝組學已經(jīng)廣泛應用于疾病診斷、藥物治療等方面,在女性生殖領域,主要代謝物包括卵泡液、卵巢顆粒細胞、胚胎培養(yǎng)液等。有關卵泡液代謝組學在評估和預測卵母細胞質(zhì)量及發(fā)育潛能中的價值還需進一步研究,來探討其適應性及局限性,為盡早找到更加有效的代謝標志物提供依據(jù)。

二、卵泡液代謝物檢測對卵母細胞質(zhì)量及發(fā)育潛能評價的價值

細胞、組織、器官和機體的小分子代謝物是保持機體生物活性、維持其正常生理、代謝等必不可少的代謝終產(chǎn)物[2]。不同機體代謝物存在差異,因此,機體需要調(diào)整代謝物的濃度維持穩(wěn)態(tài)。卵泡液是卵泡在發(fā)育過程中不可或缺的微環(huán)境,包含細胞因子、激素等多種介質(zhì),這些與卵母細胞有絲分裂、受精、卵巢功能細胞黃素化等有關,其成分及含量變化影響了卵泡的發(fā)育、受精以及胚胎碎片率,可用來反映及預測卵母細胞的成熟及質(zhì)量[3,4]。因此,在卵母細胞發(fā)育過程中,除了形態(tài)學上的成熟評估之外,還可利用代謝標志物來評估卵母細胞質(zhì)量和發(fā)育潛能,以及預測其發(fā)育及受精能力,改善臨床妊娠結局。取卵的過程中,很容易獲得卵泡液,這是其非侵入性和樣本易獲得等優(yōu)點的重要體現(xiàn),且不影響卵母細胞本身質(zhì)量及功能,因此,能從卵泡液中檢測到差異代謝物,有利于評估及預測卵母細胞質(zhì)量。

1.葡萄糖代謝:如今,多采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)技術篩選出差異代謝物,進行葡萄糖代謝與卵母細胞質(zhì)量的相關性研究。有研究證實,在葡萄糖進行無氧氧化時,通過糖酵解生成丙酮酸,為卵母細胞供能,同時,也通過葡萄糖有氧氧化等代謝過程產(chǎn)能來調(diào)控卵母細胞生長;合適的葡萄糖濃度提高卵母細胞質(zhì)量,適宜的代謝途徑有利于卵母細胞發(fā)育[5]。卵母細胞體外培養(yǎng)及受精實驗也說明了這一點,即合適的葡萄糖濃度下,卵母細胞受精率和胚胎形成率才不會受到影響,而體外受精(in vitro fertilization, IVF)卵裂失敗、子宮內(nèi)膜異位癥等患者卵母細胞質(zhì)量及發(fā)育潛能與卵泡液內(nèi)葡萄糖的下降有關。在卵細胞成熟過程中,碳水化合物相關的代謝酶類及途徑會加強,包括三羧酸循環(huán)及磷酸戊糖途徑[6]。Xie等[7]研究發(fā)現(xiàn),在敲低卵丘細胞中與磷酸戊糖途徑中相關的酶葡萄糖-6-磷酸脫氫酶后,與只敲低3-磷酸甘油醛脫氫酶比較,卵母細胞質(zhì)量受到更加顯著影響。因此,磷酸戊糖途徑可能在卵母細胞成熟中發(fā)揮更大作用[6,7]。卵母細胞在發(fā)育過程中,其細胞核、細胞質(zhì)等成份受到葡萄糖含量的影響,最終降低了卵母細胞受精及胚胎發(fā)育能力[8]。卵母細胞生長、成熟離不開葡萄糖代謝,其是三大營養(yǎng)物質(zhì)之一,影響并決定了卵母細胞發(fā)育,因此,檢測卵泡液中代謝物種類及含量,對于卵母細胞發(fā)育潛能有重要預測價值。由于目前檢測技術的多樣性、不統(tǒng)一性以及代謝物種類較多,葡萄糖濃度變化和代謝標志物水平等影響卵母細胞質(zhì)量下降的具體因果關系,以及葡萄糖分子的代謝和卵母細胞之間的關聯(lián)還需進一步研究。

2.氨基酸代謝:氨基酸是蛋白質(zhì)的主要基本單位,承擔生長、發(fā)育的不同生命過程,包括卵母細胞成熟和發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn),氨基酸是通過不同種類的轉運系統(tǒng)轉運到細胞內(nèi)發(fā)揮作用,如通過能量產(chǎn)生、蛋白合成等。有文獻表明,卵泡液中的纈氨酸、丙酮酸、異亮氨酸等含量均與卵母細胞的質(zhì)量與成熟相關,但是與所含同型半胱氨酸的量無關[8]。隨著卵母細胞不斷成熟,氨基酸的代謝發(fā)生變化,在其減數(shù)分裂的恢復期,組氨酸、絲氨酸的含量顯著增加,而在成熟細胞中其含量則不斷減少[6]?，F(xiàn)已證實,卵母細胞發(fā)育過程中,可以消耗亮氨酸和纈氨酸提供能量,而天冬氨酸的濃度卻影響獲卵數(shù),相較于高齡女性,年輕女性卵泡液中的水平則相對較高,結果其生育能力也受到很大程度的影響[9～11]。因此,在女性卵母細胞成熟過程中,天冬氨酸可能發(fā)揮很大的作用。經(jīng)研究,當天外源性使用人絨毛膜促性腺激素后黃體酮濃度增高,影響了氨基酸代謝使8-羥基鳥苷等水平升高而雌二醇等下降,最終使卵母細胞質(zhì)量下降[12]。氨基酸參與多種蛋白質(zhì)合成,卵母細胞的發(fā)育與成熟也與其有很大聯(lián)系,影響卵母細胞質(zhì)量及代謝的主要氨基酸代謝途徑可能與纈氨酸和谷氨酸等代謝有關。氨基酸種類或水平的改變可能會影響卵母細胞質(zhì)量和發(fā)育,最終影響臨床妊娠率,因此,通過探索其代謝過程得到可以預測卵母細胞質(zhì)量的特異性標志物,從而篩選出高質(zhì)量的卵母細胞。

3.脂質(zhì)代謝:脂質(zhì)是人體重要營養(yǎng)素之一,也是人體細胞組織的組成成分,卵泡液中含有豐富的飽和及不飽和脂肪酸,其中游離脂肪酸是脂質(zhì)代謝異常的重要生物醫(yī)學指標。有研究表明,卵泡液中的硬脂酸和棕櫚酸等濃度的改變,均能影響卵母細胞質(zhì)量,其中,高濃度的飽和脂肪酸影響卵母細胞的成熟[13]。已有研究證實,含有高濃度棕櫚酸的培養(yǎng)液中,會影響顆粒細胞活力和增殖能力,結果卵母細胞質(zhì)量受到很大影響[14]。近年來研究發(fā)現(xiàn),多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian system, PCOS)患者卵母細胞發(fā)育潛能下降和受精率低下與甘油三酯和甘油磷酸酯水平下降有關[15]。而磷脂酸水平升高會影響卵母細胞的發(fā)育[16]。在小鼠卵母細胞的成熟中,脂肪酸β-氧化起到重大作用,其中,相關的代謝物肉堿是把脂肪酸從卵泡液細胞質(zhì)轉運到線粒體的重要物質(zhì),起到抗氧化作用,有利于卵母細胞的成熟與發(fā)育[17]。有實驗表明,補充左旋肉堿可以改善因子宮內(nèi)膜異位癥、PCOS等因素引起的卵母細胞質(zhì)量下降,可以改善輔助生殖的臨床妊娠結局[18]。通過對不同發(fā)育程度的動物卵泡分析其脂質(zhì)方面的代謝,發(fā)現(xiàn)卵母細胞的成熟及發(fā)育潛能的下降與非脂化脂肪酸和硬脂酸的含量升高有關[19]。大量研究發(fā)現(xiàn),不孕女性脂質(zhì)代謝標志物水平與卵母細胞受精、發(fā)育等多方面存在密切聯(lián)系[20]。通過脂質(zhì)代謝組學的研究,能夠分析不孕女性的脂質(zhì)代謝標志物水平,從而預測卵母細胞結局,借以改善卵母細胞脂質(zhì)代謝物濃度以獲得高質(zhì)量卵子,最終提高臨床妊娠率。因此,利用卵泡液代謝組學技術,通過檢測不同脂質(zhì)代謝通路及不同發(fā)育階段的代謝物含量,對卵母細胞發(fā)育潛能可能有更好的預測價值。

4.膽固醇代謝:膽固醇是動物組織細胞不可或缺的物質(zhì),不僅參與形成細胞膜,而且是合成膽汁酸,維生素D以及甾體激素的原料,影響并調(diào)控著女性生殖系統(tǒng)。有研究發(fā)現(xiàn),影響PCOS患者卵母細胞發(fā)育、成熟的一個因素可能與7β-羥基膽固醇有關[21]。5-Dehydroepisterol甾醇合成和膽固醇合成有密切關系,同樣,在合成神經(jīng)活性固醇、類固醇類激素等均與膽固醇相關聯(lián)[22]。因此,5-Dehydroepisterol在下丘腦-垂體-卵巢軸上起著重大作用,對卵母細胞和卵母細胞膜的成熟及生長發(fā)育影響較大。研究證實,反復胚胎移植失敗不明原因的患者,其卵泡液中的膽固醇的含量下降,而不孕高齡患者卵母細胞質(zhì)量下降和其卵泡液中的磷脂酰膽堿和硫脲內(nèi)酯的含量有密切關系[23]。Chen等[24]研究認為,PCOS患者卵泡液中的膽固醇產(chǎn)物的量對卵母細胞的發(fā)育及成熟具有重要的預測價值。近年來研究發(fā)現(xiàn),所有類固醇激素合成的前提物質(zhì)均是膽固醇,但其如何通過影響卵巢顆粒細胞激素合成來影響卵母細胞發(fā)育仍是以后的研究熱點。因此,通過靶向和非靶向檢測技術,分析差異標志物膽固醇的含量,一定程度上能夠預測卵母細胞質(zhì)量。

5.維生素代謝:維生素廣泛參與人體的新陳代謝,在女性生殖領域發(fā)揮著重要的作用,其中在卵母細胞發(fā)育和成熟過程中的重要代謝物就包括維生素D和E等多種維生素。維生素D在卵母細胞成熟中,最主要是以維生素D3的形式參與,其升高有利于卵泡生長,低含量則有助于提高竇前卵泡的成活率[25]。通過對顆粒細胞(granule cell,GCs)、促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone,GnRH)、抗繆勒管激素(anti-Müllerian hormone,AMH)、卵泡刺激素(follicular stimulating hormone,FSH)的影響,維生素D可以對卵母細胞產(chǎn)生作用。但有資料表明,卵泡液中過高的維生素D水平會影響妊娠率。同時,卵泡液中的低水平25OHD3和β-維生素對卵母細胞產(chǎn)生影響,在IVF中增加維生素D有利于增加獲卵數(shù),提高了妊娠率和雌二醇水平[26]。另外有學者研究認為,在行IVF治療的不孕患者中,高水平的25OHD出現(xiàn)在大卵泡的卵泡液中,結局是臨床妊娠率也較高[27]。研究表明,維生素E是參與卵母細胞發(fā)育過程的重要物質(zhì),也是最主要的抗氧化劑之一,影響女性的生育能力,現(xiàn)已證實其水平升高與卵母細胞質(zhì)量提高有關。在含有一定量維生素E的卵泡液中,卵母細胞的成熟度更高,且具有一定水平的維生素E的血清中,胚胎的質(zhì)量也更好。檢測卵泡液中的維生素A發(fā)現(xiàn)卵泡液中含有的視黃醇和全反式維甲酸與卵泡發(fā)育有關。而其他種類的維生素還需要進一步實驗,來探索就代謝方面不同種類維生素對卵母細胞發(fā)育潛能的預測價值。

三、展 望

近年來,繼轉錄組學和蛋白組學之后,代謝組學在女性生殖領域發(fā)揮著越來越重要的作用。對卵泡液代謝方面的研究發(fā)現(xiàn),代謝標志物主要在葡萄糖、氨基酸、脂質(zhì)、膽固醇等方面存在差異。同時,檢測手段也從檢測不同標本的1個或幾個差異代謝物,發(fā)展到對同一標本檢測幾種不同代謝物,通過其在代謝圖譜上的差異,可以得到差異代謝物的含量及種類,以及在統(tǒng)計學上的差異,從而進一步了解卵母細胞生存及發(fā)育狀態(tài),得以篩選出高質(zhì)量卵子。雖然研究代謝組學的樣本易獲得,但所需要的樣本量一般較大,卵泡液代謝物種類繁多,致使后期數(shù)據(jù)及結果分析成為一大難題。因此,仍然需要技術改進及大量樣本的實驗與研究。這樣,通過卵母細胞卵泡液非靶向與靶向分析技術,得到不同種類代謝物和代謝通路,并進行大量實驗驗證,未來能夠更好地應用于臨床來預測卵母細胞發(fā)育潛能,從而提高卵母細胞質(zhì)量,增加輔助生殖的成功率。