馬慧可 李 萍 陳 佳 林 燕 姚文濤 何秀娟

慢性難愈合創(chuàng)面是指因多種內(nèi)在或外界因素導(dǎo)致創(chuàng)面長期處于潰爛、滲出或呈纖維化狀態(tài),不能按時完成正常的上皮化和及時的組織與功能修復(fù),治療4周后仍愈合緩慢或無明顯愈合傾向的傷口[1]。慢性難愈合創(chuàng)面主要包括感染性潰瘍、放射性潰瘍、創(chuàng)傷性潰瘍、癌性潰瘍、動靜脈潰瘍以及皮片或皮瓣移植術(shù)后的壞死創(chuàng)面等[2]。慢性難愈合創(chuàng)面的發(fā)病機制包括慢性或過度炎癥、修復(fù)細胞增殖受阻、局部高酶活性、氧化應(yīng)激損傷以及生長因子分泌不足等[3]。“缸口”是指潰瘍長期難以愈合,瘡口下陷不收、邊緣高突增厚,皮緣形如大缸環(huán)口之狀?！案卓凇毙纬啥喟l(fā)生在創(chuàng)面修復(fù)的重塑期,表皮與真皮未能同步恢復(fù),表皮缺損部位愈合過快或角質(zhì)形成細胞積聚過多導(dǎo)致上皮變硬變厚,創(chuàng)面形成“缸口”,從而導(dǎo)致傷口愈合延遲。臨床研究發(fā)現(xiàn)“缸口”是導(dǎo)致慢性難愈合創(chuàng)面的重要影響因素,缸口的深度與臨床療效密切相關(guān)。動物研究發(fā)現(xiàn),創(chuàng)緣與創(chuàng)面之間形成的角度越大,越有利于局部炎性滲出物引流、傷口收縮以及肉芽組織中纖維母細胞與新生毛細血管的生長。創(chuàng)緣與創(chuàng)面形成的角度過小的潰瘍,臨床上多將創(chuàng)緣皮膚適當切除,一方面有助于改善炎性滲出物在創(chuàng)面的引流與其在上皮處的過度積聚,從而促進上皮細胞的爬行,另一方面有助于創(chuàng)面暴露出更多的真皮組織,以改善遲滯的上皮組織的生長與創(chuàng)面局部的氧分壓,從而促進缺損組織的良性修復(fù)。因此,臨床上及時并有效的處理創(chuàng)緣在極大程度上促進了慢性皮膚潰瘍的愈合。

一、EMT過度導(dǎo)致慢性難愈合創(chuàng)面“缸口”形成

傷口的愈合過程經(jīng)歷止血期、炎癥期、增殖期和重塑期,4個階段必須相互協(xié)調(diào),且以正確的時間和順序整合以實現(xiàn)正常的創(chuàng)面修復(fù)[4]。在皮膚創(chuàng)面修復(fù)的增殖期和重塑期,表皮修復(fù)從創(chuàng)口邊緣開始,涉及角質(zhì)形成細胞的激活、遷移和增殖以覆蓋新生肉芽組織,從而形成新生表皮并恢復(fù)表皮屏障功能,該過程被稱為再上皮化,這也是傷口愈合過程中的關(guān)鍵階段[5, 6]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)表現(xiàn)為細胞上皮特性逐漸丟失而表現(xiàn)出間質(zhì)的特性,細胞運動和遷移能力增強[7]。上皮特性的改變主要在于上皮細胞失去其原有的“上皮形態(tài)”,包括細胞-細胞間、細胞-外基質(zhì)間和細胞-基底膜間的連接減弱,細胞極性消失,同時上調(diào)Slug、Snail1、Snail2、Zeb1和Twist等EMT相關(guān)基因。EMT可分為3型:Ⅰ型EMT參與胚胎生成和器官發(fā)育;Ⅱ型EMT參與創(chuàng)面愈合、組織再生和器官纖維化;Ⅲ型EMT參與腫瘤形成和轉(zhuǎn)移[8]。其中,Ⅱ型EMT完全由損傷和炎癥引起,一旦創(chuàng)面達到修復(fù)狀態(tài)或炎癥消退便會停止EMT的發(fā)生。在再上皮化過程中,皮膚創(chuàng)緣的角質(zhì)形成細胞發(fā)生脫黏附,細胞骨架重排而變得疏松;這些改變同時使靜止的角質(zhì)形成細胞伸出板狀偽足,實現(xiàn)細胞遷移[9]。再上皮化完成后,角質(zhì)形成細胞會恢復(fù)上皮細胞表型,重建緊密的細胞連接和屏障功能,因此,再上皮化過程中的部分EMT是可逆的。在創(chuàng)面愈合早期,EMT來源的肌成纖維細胞可以通過分泌細胞外基質(zhì)和收縮傷口床來縮小創(chuàng)面[2]。但是在創(chuàng)面愈合晚期,如果炎癥持續(xù)刺激導(dǎo)致EMT無法及時消退,則會導(dǎo)致瘢痕形成。研究表明,轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)是發(fā)生EMT的誘導(dǎo)因子,EMT在皮膚創(chuàng)面愈合過程中參與炎性反應(yīng),促進成纖維細胞與血管增生,調(diào)節(jié)膠原合成等[10]。因此,其對于適當?shù)纳掀せ图毎饣|(zhì)沉積是必要的,但持續(xù)的從上皮細胞到肌成纖維細胞的過度轉(zhuǎn)化將導(dǎo)致纖維化[9]。

在皮膚創(chuàng)面愈合過程中,創(chuàng)緣上皮細胞遷移增強,細胞間黏附降低,角質(zhì)形成細胞通過增殖、遷移驅(qū)動再上皮化,成纖維細胞介導(dǎo)局部結(jié)締組織收縮,促進創(chuàng)面邊緣閉合[11]。再上皮化是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵組成部分,因此,參與再上皮化的角質(zhì)形成細胞是創(chuàng)面修復(fù)的主要參與者[12]。創(chuàng)面中的角質(zhì)形成細胞通過細胞間黏附減少、細胞骨架蛋白重組以及基因重編程轉(zhuǎn)換為具有間充質(zhì)表型的細胞,從而實現(xiàn)再上皮化以恢復(fù)表皮屏障,這一過程是創(chuàng)面愈合的基礎(chǔ)[8]。波形蛋白(Vimentin)和N-鈣黏蛋白(N-cadherin)的增多以及E-鈣黏蛋白(E-cadherin)的減少可作為判斷EMT發(fā)生及其進展程度的標志[11]。在細胞極化條件下,E-cadherin與相鄰細胞結(jié)合,形成上皮屏障的細胞間復(fù)合物,在相鄰細胞的細胞骨架之間形成橋梁。EMT轉(zhuǎn)錄因子(如Snail、Slug和Twist)與E-cadherin啟動子區(qū)E-boxs結(jié)合,下調(diào)E-cadherin來實現(xiàn)EMT[13]。然而,失去E-cadherin的細胞則不能相互黏附,因此E-cadherin表達水平的改變是判斷細胞遷移、腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移與否的重要標準。Snail與同一家族Slug可通過抑制E-cadherin來調(diào)節(jié)上皮再生過程中的角質(zhì)形成細胞運動,減少細胞間黏附來實現(xiàn)EMT[9]。細胞骨架在經(jīng)歷特征性重組過程中,肌動蛋白介導(dǎo)應(yīng)力纖維形成,以細胞角蛋白(cytokeratin, CK)為主的細胞骨架轉(zhuǎn)變?yōu)橐訴imentin為主的細胞骨架,調(diào)節(jié)細胞運動并發(fā)生EMT[14]。經(jīng)EMT轉(zhuǎn)化的細胞MMP2和MMP9上調(diào),降解細胞外基質(zhì)并促進細胞遷移。此外,局部降解的細胞外基質(zhì)還會釋放儲存的生長因子如TGF-β1,促進細胞間充質(zhì)表型的獲得、侵襲和轉(zhuǎn)移,進一步加強EMT[15]。

創(chuàng)面愈合過程中的EMT受到成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子、肝細胞生長因子和TGF-β等多種信號通路的精細調(diào)節(jié)[16]。TGF-β調(diào)控細胞增殖、遷移、分化以及EMT,參與損傷修復(fù)和致纖維化。TGF-β超家族中TGF-β1與致纖維化密切相關(guān)。在慢性創(chuàng)面中,炎性巨噬細胞可分泌TGF-β1,刺激成纖維細胞增殖和合成細胞外基質(zhì),而皮膚創(chuàng)面邊緣纖維化是慢性創(chuàng)面的重要發(fā)病機制[17]。TGF-β信號通路經(jīng)Smad依賴型和Smad非依賴型通路發(fā)揮作用。TGF-β/Smad信號通路中,TGF-β配體結(jié)合TGF-βR1、TGF-βR2導(dǎo)致Smad2和Smad3磷酸化,之后與Smad4形成復(fù)合物并易位至細胞核,反式激活編碼ECM、基質(zhì)金屬蛋白酶、結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)和Snail基因的表達,最終促進EMT的形成[18]。同樣,骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)可結(jié)合TGF-β受體導(dǎo)致Smad1和Smad5磷酸化,也與Smad4形成復(fù)合物。同時,抑制性Smad6和Smad7也與Smad2和Smad3競爭性結(jié)合TGF-βR1[19]。這些Smad復(fù)合物(Smad2-Smad3-Smad4和Smad1-Smad5-Smad4)遷移到細胞核,并作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)間充質(zhì)狀態(tài)相關(guān)基因的表達[18]。研究發(fā)現(xiàn),TGF-βR1/TGF-βR2、Smad2-Smad3-Smad4失活均可以阻斷TGF-β1誘發(fā)EMT。雖然Smad3可以誘發(fā)EMT,但Smad2可以抑制TGF-β1誘發(fā)EMT,并且Smad2缺陷的角質(zhì)形成細胞通過增強Smad3和Smad4活性而發(fā)生EMT。因此,TGF-β是致纖維化的主要調(diào)節(jié)因子。

創(chuàng)傷修復(fù)與腫瘤發(fā)生均有細胞增殖與分化、組織重塑與炎性反應(yīng)等過程的參與,并且涉及多條共用信號通路。2020年《Nature》報道,TGF-β通過RAS反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1(RAS responsive element binding protein 1, RREB1)協(xié)調(diào)EMT過程和纖維化[20]。TGF-β是EMT過程和纖維化的有效誘導(dǎo)因子,其依賴于迅速加速性肉瘤蛋白(rapidly accelerated sarcoma,RAS)和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)通路來誘導(dǎo)EMT發(fā)生。RREB1和RAS轉(zhuǎn)錄效應(yīng)子是EMT中TGF-β激活的Smad轉(zhuǎn)錄因子的關(guān)鍵伴侶,之后被MAPK激活以促使Smad被募集Snail,最后經(jīng)染色質(zhì)可極性誘導(dǎo)產(chǎn)生EMT。在癌細胞中,TGF-β/Smad和RREB1直接驅(qū)動Snail,促進腫瘤內(nèi)纖維化。因此,RREB1促進RAS和TGF-β通路間的相互聯(lián)系,誘導(dǎo)EMT過程和纖維化。

RREB1編碼的蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子,參與細胞增殖、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和DNA損傷修復(fù)等生物過程,能結(jié)合下游基因啟動子區(qū)的Ras 反應(yīng)元件(RAS-responsive elements,RRE)發(fā)揮作用,被認為是RAS/RAF信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的一個效應(yīng)分子。RREB1基因位于人類6號染色體(6p25),全長144kb,編碼的蛋白是具有15個鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子,目前已知存在12個異構(gòu)體[21]。RREB1能誘導(dǎo)降鈣素、p53、FSH等基因的轉(zhuǎn)錄,抑制血管緊張素原、p16、hZIP1、PSA、HLA-G等基因的轉(zhuǎn)錄。RREB1和雄激素受體、C-Terminal結(jié)合蛋白等核蛋白相結(jié)合,并參與microRNA、lncRNA、circularRNA等的調(diào)控。在實體腫瘤中RREB1與細胞遷移運動有關(guān)。MCF10A乳腺上皮細胞敲低RREB1后細胞的遷移與表面活性受到抑制,從而形成緊密的細胞集落[22]。因此,RREB1減少細胞間黏附促使細胞遷移,而RREB1低表達可通過抑制細胞遷移,在抗纖維化與抗腫瘤方面發(fā)揮重要作用。因此,慢性皮膚潰瘍局部炎癥持續(xù)存在,RREB1可能促進TGF-β/Smad和RAS/MAPK信號通路協(xié)同誘導(dǎo)EMT過程導(dǎo)致EMT過度甚至纖維化,是“缸口”形成的機制。

二、中醫(yī)藥抑制TGF-β/Smad和RAS/MAPK信號通路對EMT過度以及“缸口”的研究

慢性皮膚潰瘍屬中醫(yī)“瘡瘍”范疇,中醫(yī)藥治療瘡瘍顯示了強大的生命力。瘡瘍的形成經(jīng)歷初起(初期)、成膿(中期)、潰后(膿成)3個階段,總則為早期為消,中期為托,后期為補。顧筱巖認為,若臁瘡經(jīng)久難愈,瘡面凹陷,瘡周紫黑,質(zhì)地僵硬,有如“缸口”之狀,僅用生肌之法,則肉芽浮起而致新肉不生;若局部采用墊棉壓迫法,可使肉芽平伏,并配合纏縛療法,用布綁扎小腿,利于氣血暢通,促進瘡面愈合,日久便可見效[23]。創(chuàng)面愈合增殖期階段的潰瘍創(chuàng)面肉芽色淡白,瘡周紫滯,致缸口形成,久不收斂,斂后復(fù)潰,管壁粗硬。鄭勇等[24]采用祛瘀生肌法,主張舊瘀宜通滯,因此在補陽還五湯之基礎(chǔ)上加用蟲類藥材,如水蛭取搜剔絡(luò)邪之功。水蛭善入則堅積易破,借其力以攻積久之滯,自有得而無害也。瘡面愈合重塑期階段,瘡周形成較厚硬且彈性差的灰白組織,形成“缸口”,阻礙新生上皮組織在瘡面的爬行,從而形成慢性難愈合瘡面。闕華發(fā)[25]認為,瘡周有潛行性空腔時,采用墊棉療法墊壓空腔處,再以繃帶加壓纏縛,壓緊患處,可促進皮肉黏合,利于創(chuàng)面愈合。對于“缸口”的處理,闕華發(fā)[25]認為可采用煨膿濕潤法,油膏厚敷創(chuàng)面厚硬組織,待其軟化后機械清除,并外敷生肌斂瘡藥膏,可促進上皮生長,加速瘡面愈合。

TGF-β/Smad和RAS/MAPK信號通路誘導(dǎo)EMT過度導(dǎo)致慢性慢性難愈合創(chuàng)面“缸口”形成。中藥復(fù)方或中藥提取物可在創(chuàng)面愈合早期階段上調(diào)TGF-β或TGF-β/Smad信號通路來促進創(chuàng)面愈合,但其在創(chuàng)面修復(fù)后期通過抑制EMT過度來促進創(chuàng)面修復(fù)的具體機制還有待于深入研究。張臻等[26]用益氣化瘀方灌胃糖尿病大鼠,抑制TGF-β/ALK5/Smad2/3信號通路,促進糖尿病大鼠創(chuàng)面愈合并減少瘢痕形成。王振宜等[27]將復(fù)黃生肌愈創(chuàng)油膏外用于糖尿病大鼠,在創(chuàng)面修復(fù)晚期,下調(diào)TGF-β、Smad3表達,上調(diào)Smad7表達,促進創(chuàng)面愈合的同時阻止成纖維細胞過度增殖與遷移,從而減少瘢痕形成。孫桂芳等[28]將生肌玉紅膏體外干預(yù)人增生性瘢痕成纖維細胞(hurean hyportrophic scar fibroblast, hHSF),抑制hHSF增殖、α-SMA和Ⅰ、Ⅱ型膠原mRNA和蛋白表達,顯著下調(diào)TGF-β/Smad信號通路;臨床實踐表明,生肌玉紅膏可促進創(chuàng)面愈合,廣泛應(yīng)用于糖尿病性潰瘍以及燒燙傷,效果顯著;體內(nèi)實驗表明,生肌玉紅膏可抑制瘢痕增生,減少膠原沉積,減輕兔耳增生性瘢痕。同樣,血竭素B臨床可應(yīng)用于燒燙傷,促進創(chuàng)面愈合;同時,血竭素B可下調(diào)TGF-β1/Smad信號通路,減輕兔耳增生性瘢痕。王文淇等[29]將斷體地龍?zhí)崛∫鹤饔糜谛∈髣?chuàng)面,在創(chuàng)面修復(fù)后期,TGF-β下調(diào),減少膠原沉積與瘢痕形成。這些數(shù)據(jù)表明,中藥或中藥提取物在促進創(chuàng)面愈合的同時,又可通過TGF-β/Smad信號通路發(fā)揮潛在的抑制瘢痕性增生的療效。

趙炳南使用“治翻車”療法治療慢性皮膚潰瘍瘡周異常纖維化,瘡面“缸口”板硬,利用黑布藥膏的活血化瘀、軟堅散結(jié)作用,緩慢軟化創(chuàng)面痂皮,盡可能減小其對正常組織的損害[30]。外用黑布藥膏可打破慢性創(chuàng)面的愈合停滯狀態(tài),清除異常纖維化的肉芽組織,促進正常肉芽組織的生長,重新啟動創(chuàng)面的愈合機制。黑布藥膏中老黑醋的軟堅解毒、蜈蚣的破瘀攻毒以及五倍子的收斂解毒起關(guān)鍵作用,全方共奏破瘀軟堅、聚毒催膿之功,以消為主,消中帶托,破中有立[31]。另有研究表明,黑布藥膏可顯著降低局部組織中TGF-β1的表達,從而起到抑制瘢痕增生和攣縮發(fā)生的作用。此外,黑布藥膏中蜈蚣和五倍子可顯著抑制瘢痕疙瘩膠原蛋白的合成與hHSF的增殖,減少其DNA與膠原的合成。因此,黑布藥膏可抑制TGF-β表達和成纖維細胞活性,從而發(fā)揮抗皮膚纖維化的作用。因此,TGF-β/Smad信號通路是調(diào)控創(chuàng)面愈合與抗EMT過度的關(guān)鍵機制,從該通路出發(fā),進行中醫(yī)藥在EMT過度所致的慢性創(chuàng)面的療效及藥效基礎(chǔ)研究具有廣闊的研究前景。

三、展 望

EMT經(jīng)過了近40年的發(fā)展,但皮膚EMT的相關(guān)文章比例不足3%,對創(chuàng)面修復(fù)的研究也是針對如何促進EMT,而對抑制或逆轉(zhuǎn)皮膚EMT的研究仍比較欠缺。中醫(yī)藥一方面可加速創(chuàng)面愈合,一方面可通過抑制EMT與抗纖維化作用提高創(chuàng)面修復(fù)能力,從而有助于慢性難愈合創(chuàng)面“缸口”愈合。因此,抑制TGF-β/Smad和RAS/MAPK造成的EMT過程和纖維化可能成為促進創(chuàng)面愈合新的治療靶點,將為研究中醫(yī)藥治療慢性難愈合創(chuàng)面“缸口”的作用基礎(chǔ)和理論內(nèi)涵提供新的思路和方向。