蔣秀婷,凌 娜,葉應(yīng)旺

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

0 引 言

丙二酸鹽克羅諾桿菌(Cronobactermalonaticus)是一種常存于動物體及人體腸道內(nèi)的食源性致病菌,隸屬于克羅諾桿菌屬(Cronobacter.spp)[1],對干燥、熱、酸、堿及抗生素等極端條件具有一定的耐受性[2]。嬰幼兒配方奶粉(powdered infant formula,PIF)是克羅諾桿菌的主要傳播媒介,研究表明在長達2.5 a的干燥過程中,接入奶粉中的27株腸桿菌只有克羅諾桿菌可被重新復(fù)蘇[3],而食用了克羅諾桿菌的污染奶粉的嬰幼兒極易患腦膜炎、敗血癥或壞死性小腸結(jié)腸炎等疾病[4],致死率最高達80%[5]。

熱應(yīng)激、干燥滲透失衡、乙醇、跨膜蛋白缺陷以及過量產(chǎn)生某種膜蛋白(如分泌素)等環(huán)境脅迫會導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜完整性受損[6],而噬菌體休克蛋白(phage shock protein,Psp)系統(tǒng)則是一種存在于革蘭氏陰性菌的胞外應(yīng)激反應(yīng),能夠防止壓力條件下質(zhì)子動力(proton motive force,PMF)的消散,維持細(xì)胞存活以及細(xì)胞質(zhì)膜的完 整性[7]。PspA是一種外周細(xì)胞膜蛋白,有研究稱其可通過直接的物理作用在細(xì)胞膜上形成PspA-PspF復(fù)合物[8],抑制PspF的ATP酶活性和psp基因的轉(zhuǎn)錄來實現(xiàn)負(fù)調(diào)控[9]。當(dāng)細(xì)胞膜受到刺激時,PspB-PspC復(fù)合物檢測到誘導(dǎo)觸發(fā)因子[10],導(dǎo)致PspA將PspF從細(xì)胞膜釋放到細(xì)胞質(zhì)中,激活Psp系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄以緩解環(huán)境脅迫下對細(xì)胞造成的損害[11]。

目前,國內(nèi)外對PspA蛋白的研究大多集中于大腸桿菌[12]、霍亂弧菌[13]等革蘭氏陰性菌中,而在丙二酸鹽克羅諾桿菌中該蛋白的結(jié)構(gòu)功能、作用機理及蛋白互作情況仍處于起步階段。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)PspA蛋白與丙二酸鹽克羅諾桿菌耐受干燥應(yīng)激有關(guān),因而本研究采用基因工程的方法構(gòu)建了PspA大腸桿菌表達載體,并探討了PspA蛋白包涵體胞外復(fù)性、純化的方法,為研究PspA蛋白在丙二酸鹽克羅諾桿菌環(huán)境脅迫下的調(diào)控機制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株

表達載體pGEX-4T-1、丙二酸鹽克羅諾桿菌(Cronobactermalonaticus)保藏于廣東省微生物研究所;大腸桿菌(Escherichiacoli,E.coli)DH5a、E.coliBL21 菌株購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.2 酶與試劑

高保真DNA聚合酶(Taq DNA聚合酶)購于Takara公司;T4連接酶、BamHⅠ、SalⅠ限制性內(nèi)切酶均購于New England Biolabs公司;LB肉湯培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、氨芐青霉素(ampicillin,Amp)、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、Mag-Beads GST 融合蛋白純化磁珠、細(xì)菌基因組DNA 抽提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒、GeLRed核酸染料、DL2000/1 kbp DNA Marker、低分子量預(yù)染型蛋白Marker、Tris-HCl緩沖液、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、BCA法微量蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒、還原型谷胱甘肽(reduced glutathione,GSH)、氧化型谷胱甘肽(glutathione oxidized,GSSG)、乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)、精氨酸(l-Arginine,L-Arg)、苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)均購于生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)擴增儀、BIO-RAD電泳儀(伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)、溫金屬浴(北京天根生化科技有限公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)、恒溫培養(yǎng)振蕩器(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)、超低溫冰箱(惠而浦(中國)股份有限公司)、高速離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 目的基因的擴增

以阪崎克羅諾桿菌基因組DNA為模板,根據(jù)GenBank中已存在的pspA基因cDNA、基因組序列和原核表達載體pGEX-4T-1質(zhì)粒圖譜設(shè)計兩端分別含有BamHⅠ和SalⅠ酶切位點的引物,其序列見表1所列。表1中,下劃線為酶切位點。

表1 引物序列

PCR反應(yīng)體系為50 μL,分別為Taq DNA聚合酶25 μL,上、下游引物各1 μL,模板DNA 1 μL,滅菌蒸餾水22 μL,低速離心混勻后放至PCR儀中,95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 2 min,共30個循環(huán),72 ℃再延伸5 min,最后12 ℃儲存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,切下符合預(yù)期大小的目的片段,使用DNA膠回收試劑盒純化。

1.2.2 重組質(zhì)粒表達載體的構(gòu)建與鑒定

分別將所獲得的pspA基因目的片段與pGEX-4T-1載體通過限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SalⅠ進行雙酶切,37 ℃反應(yīng)30 min,經(jīng)1.8%瓊脂糖凝膠電泳鑒定并回收純化基因片段與載體。兩者通過T4連接酶在25 ℃下混合4 h,獲得重組表達載體pGEX-4T-1-PspA。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)菌,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含Amp (最終質(zhì)量濃度為0.1 g/L)的LB瓊脂培養(yǎng)基中,30 ℃過夜培養(yǎng)。在生長菌落中挑取數(shù)個單克隆菌落進行鑒定,將獲得符合預(yù)期條帶大小的菌落接種至含氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng),提取質(zhì)粒DNA送至擎科(南京)生物科技有限公司進行測序,經(jīng)測序鑒定正確后將該重組質(zhì)粒命名為pGEX-4T-1-PspA進行凍存,并轉(zhuǎn)化至E.coliBL21感受態(tài)菌進行后續(xù)操作。

1.2.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達

將經(jīng)鑒定的重組BL21-pspA菌株接種于含Amp(最終質(zhì)量濃度為0.05 g/L)的LB液體培養(yǎng)基中,37 ℃培養(yǎng)至對數(shù)中期時,加入0.1 mol/L的IPTG至終濃度為1.0 mmol/L進行誘導(dǎo)表達,4 h后4 000 r/min離心培養(yǎng)液,棄上清。配制含PBS和PMSF的細(xì)菌蛋白裂解液重懸沉淀,并進行15 min超聲破碎后,4 ℃、12 000 r/min離心20 min,經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)檢測上清液和沉淀中目標(biāo)蛋白表達情況。

1.2.4 包涵體的復(fù)性

包涵體沉淀使用含8 mol/L尿素的0.1 mol/LTris-HCl緩沖液中重懸并超聲破碎,12 000 r/min離心后取上清,采取以下4種方法進行復(fù)性。

(1) 方法1。稱取3.1 g DTT溶于1 L的0.02 mol/L的PBS緩沖液中,菌體濕重稱重后按比例(1∶15)加入新配制的復(fù)性液,4 ℃過夜,12 000 r/min離心20 min取上清保存。

(2) 方法2。配制含2 mmol/L GSH和0.2 mmol/L GSSG的Tris-HCL復(fù)性緩沖液,按比例(1∶15)緩慢加入新配制的復(fù)性液,室溫孵育4～6 h后,4 ℃、12 000 r/min離心20 min取上清保存。

(3) 方法3。按相應(yīng)濃度配制包涵體復(fù)性緩沖液:0.1 mol/L Tris-HCL、15%甘油、1 mmol/L EDTA、1 mmol/L GSH、1 mmol/L GSSG、0.5 mol/L L-Arg、1% PMSF、pH值8.5。按比例(1∶10)逐滴加入配制好的復(fù)性緩沖液,緩慢攪拌后注入透析袋中,密封放置于PBS中,4 ℃透析48 h,每隔12 h更換透析緩沖液。將透析袋包埋在蔗糖與聚乙二醇粉末中1 h,對蛋白溶液進行濃縮,4 ℃、12 000 r/min離心20 min取上清保存。

(4) 方法4。按相應(yīng)濃度配制包涵體復(fù)性緩沖液:0.1 mol/L Tris-HCL、15%甘油、0.1 mol/L NaCl、1 mmol/L GSH、1 mmol/L GSSG、0.5 mol/L L-Arg、1% PMSF、pH值8.5。按比例(1∶10)逐滴加入配制好的復(fù)性緩沖液,裝入透析袋中放置于6 mol/L尿素中4 ℃透析12 h,后按6、4、3、2、1、0 mol/L的尿素濃度更換透析緩沖液進行梯度透析。將透析袋包埋在蔗糖與聚乙二醇粉末中1 h,對蛋白溶液進行濃縮。4 ℃、12 000 r/min 離心20 min取上清保存。

1.2.5 融合蛋白的純化

取所獲得的蛋白上清液,使用Mag-Beads GST 融合蛋白純化磁珠進行純化,洗脫樣品經(jīng)BCA試劑盒和SDS-PAGE鑒定純化效率。采用超濾透析對目的蛋白進行濃縮,得到高濃度的GST-PspA融合蛋白。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的基因擴增及表達載體構(gòu)建與鑒定結(jié)果

目的基因pspA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果如圖1所示。

圖1 pspA基因的克隆

由圖1可知，1 000 bp左右處有符合pspA基因672 bp大小的特異性條帶,表明成功擴增出pspA基因目的片段。將PCR產(chǎn)物和pGex-4T-1質(zhì)粒分別用BamHⅠ和SalⅠ限制性內(nèi)切酶進行雙酶切。凝膠回收雙酶切產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)菌后,挑取陽性克隆進行DNA測序分析,結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，酶切產(chǎn)物與GenBank數(shù)據(jù)庫中pspA基因片段大小完全一致,且含有BamHⅠ和SalⅠ雙酶切位點,表明pGex-4T-1-PspA原核表達載體構(gòu)建成功。

圖2 DH5α-pspA原核載體的構(gòu)建分析

2.2 重組BL21-pspA菌株的誘導(dǎo)表達

前期擴增的pspA序列長度為672 bp,共編碼223個氨基酸,其蛋白分子量約為25 kDa,GST標(biāo)簽蛋白分子量26 kDa,因此誘導(dǎo)表達的GST-PspA融合蛋白的分子量約為51 kDa。將pGex-4T-1-pspA重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達菌株BL21,1.0 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)融合蛋白表達,以不添加 IPTG的表達菌株作為陰性對照,SDS-PAGE 檢測蛋白表達情況,結(jié)果如圖3所示。圖3中:M為蛋白Marker;1為陰性對照;2為蛋白上清液;3為包涵體蛋白。由圖3可知，當(dāng)IPTG濃度為1.0 mmol/L時,泳道2中上清液目的蛋白有略微提高,但泳道3顯示誘導(dǎo)后在51 kDa處有大量的目的融合蛋白,表明重組BL21-pspA菌株所表達的蛋白多為不可溶的無生物活性的包涵體。

圖3 重組 PspA蛋白SDS-PAGE分析

2.3 包涵體蛋白的復(fù)性與純化

經(jīng)4 ℃過夜梯度透析復(fù)性后,用Mag-Beads GST 融合蛋白純化磁珠純化融合蛋白,經(jīng)洗脫液多次洗脫,SDS-PAGE檢測蛋白純化情況如圖4所示。圖4中:M為蛋白Marker;A為方法1;B為方法2;C為方法3;D為方法4。

由圖4可知，51 kDa處存在單一條帶,且亮度最高,融合蛋白有效表達且成功純化。通過BCA試劑盒檢測可知,方法1、方法2獲得約0.02 mg的GST-PspA融合蛋白,方法3獲得約0.4 mg的GST-PspA融合蛋白,而方法4復(fù)性效率最高,最終獲得2.2 mg的高純度GST-PspA融合蛋白。

圖4 不同復(fù)性方法下重組PspA蛋白純化情況

3 討 論

細(xì)胞質(zhì)膜保護細(xì)胞免受環(huán)境脅迫的影響,并賦予細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。胞質(zhì)外不同應(yīng)激條件會破壞質(zhì)膜平衡，從而導(dǎo)致跨膜電位的損失和PMF的耗散,而Psp系統(tǒng)則通過保護質(zhì)膜的完整性來維持質(zhì)子梯度和保護PMF。Psp系統(tǒng)的核心成分是外圍質(zhì)膜結(jié)合蛋白PspA,負(fù)責(zé)Psp反應(yīng)的負(fù)向調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能[14],可與內(nèi)膜結(jié)合形成高階寡聚體效應(yīng)復(fù)合物,修復(fù)質(zhì)膜損傷并保護PMF[15]。

本研究通過克隆丙二酸鹽克羅諾桿菌pspA基因全長序列,并成功誘導(dǎo)純化該基因編碼的PspA蛋白。實驗結(jié)果顯示,因大腸桿菌表達菌株BL21表達效率高,融合蛋白合成速度過快,蛋白間非特異性結(jié)合過多,未及時在細(xì)胞內(nèi)進行折疊而聚集形成PspA包涵體蛋白[16]。本實驗將所獲得的PspA包涵體蛋白溶解于高濃度的尿素緩沖液中,通過離子間的相互作用破壞包涵體蛋白間的氫鍵使之變性,增加蛋白的可溶性。繼而緩慢去除變性劑,使目標(biāo)蛋白從完全伸展?fàn)顟B(tài)恢復(fù)到正常的折疊結(jié)構(gòu)。本研究中方法1和方法2為稀釋復(fù)性法,向包涵體蛋白中直接加入不同配方的緩沖液,改進放置條件,經(jīng)SDS-PAGE檢測發(fā)現(xiàn)復(fù)性效率較低,其原因可能是蛋白溶液體積增加較大,變性劑稀釋速度過快,導(dǎo)致可溶性蛋白的重折疊不易控制。方法3和方法4為透析法,透析袋中的蛋白樣品與外透液進行離子交換直到除去大部分小分子物質(zhì)。方法4通過逐步降低透析緩沖液中的尿素濃度來去除蛋白樣品中的變性劑,并且在復(fù)性緩沖液體系中引入甘油增加溶液的黏度,減小分子碰撞形成聚合體的可能,添加還原性/氧化性谷胱甘肽來促進重組PspA蛋白形成正確的二硫鍵,而精氨酸則能夠避免復(fù)性中重組PspA蛋白相互聚集,具有穩(wěn)定蛋白質(zhì)的作用[17]。通過SDS-PAGE檢測分析PspA蛋白的復(fù)性純化效率,結(jié)果顯示復(fù)性方法4能夠在一定程度上恢復(fù)重組蛋白的生物學(xué)活性,且效率最高。

克羅諾桿菌對所有年齡段人群都具有致病性,且危害大、致死率高[18]?？肆_諾桿菌作為嬰幼兒配方奶粉的A類致病菌[19],近年來引發(fā)多起食品安全事件而備受世界衛(wèi)生組織、國家政府以及消費人群的高度關(guān)注。因此,本研究成功誘導(dǎo)了丙二酸鹽克羅諾桿菌PspA蛋白,為后續(xù)從基因及蛋白水平方面探究該菌能夠長期存活在干燥環(huán)境中的分子調(diào)控機制及蛋白互作網(wǎng)絡(luò)提供理論基礎(chǔ),同時也對減少和避免易染食品的污染和污染后的防治具有重要意義。