李雅靖，王進千，韋姍姍，劉麗霞

（ 西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅 蘭州 730030 ）

生長激素（GH）對動物生長發(fā)育和基礎(chǔ)代謝起到非常關(guān)鍵的作用。作為一種生物大分子，GH發(fā)揮作用的條件是必須和位于其靶細胞膜表面上的受體（GHR）進行結(jié)合。GHR是細胞因子受體超家族成員之一，屬于一種跨膜糖蛋白，需要以二聚體作為形式與GH結(jié)合，并啟動下游的磷酸化作用信號級聯(lián)反應(yīng)和基因的表達[1]。GHR最初于兔子的胚肝細胞膜表面被發(fā)現(xiàn)，并通過試驗分離自動物體，現(xiàn)已成功克隆并從人類、小鼠、牛和羊的胚胎中獲得了該基因。鐘歡等[2]對奧尼羅非魚肝臟組織進行提取，轉(zhuǎn)錄測序得到相應(yīng)的GHR2基因序列，并進行了表達特征分析，結(jié)果顯示，該基因與奧尼羅非魚的表達優(yōu)勢和快速生長的雜種優(yōu)勢密切相關(guān)。劉媛等[3]應(yīng)用生物信息學與比較基因組的方法對GHR基因結(jié)構(gòu)進行分析，將GHR基因作為候選基因研究其對牛生長特征產(chǎn)生的變化。吳雪等[4]發(fā)現(xiàn)，威寧綿羊各細胞中GHR基因均具有不同水平的表現(xiàn)，在不同年齡、不同發(fā)育時期的相同組織上的表現(xiàn)也不同。

生物信息學是將計算機與信息科學技術(shù)等手段運用至生命科學中，對生物的內(nèi)部信息進行處理、歸納，并分析其變化規(guī)律。對生物學數(shù)據(jù)反映的生物學意義進行挖掘，可實現(xiàn)對生命系統(tǒng)的科學理解[5]。本研究對草魚GHR2基因進行生物信息學分析，并且以結(jié)果和相聯(lián)系的理論為依據(jù)，結(jié)合試驗對象的特征，在大數(shù)據(jù)的對比下對該基因的高級結(jié)構(gòu)與表達特征進行預測，對闡明草魚快速生長的機制具有重要意義，為更深入地研究草魚GHR2基因提供參考。

1 材料與方法

1.1 序列來源

從Ensembl網(wǎng)站獲得草魚GHR2基因編碼區(qū)序列（登錄號：ENSOABT00000046389.1）。

1.2 生物信息學軟件

對草魚GHR2基因全長序列編碼蛋白質(zhì)進行生物信息學分析。所用全部網(wǎng)址及軟件見表1。

表1 GHR2基因生物信息學分析軟件Tab.1 Bioinformatics analysis software for GHR2 genes

2 結(jié)果與分析

2.1 草魚GHR2基因編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)預測與分析

蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析結(jié)果顯示，共599個氨基酸被草魚GHR2基因編碼，分子式為C3015H4674N774O909S31，相對分子質(zhì)量為673 02.78 Da，理論等電點（PI）為4.89。

將該基因各氨基酸數(shù)量通過計算機以柱狀圖形式呈現(xiàn)，結(jié)果見圖1。

由圖1可知，含量最多的氨基酸是亮氨酸（Leu），所占氨基酸總量的11.0%；含量最少的氨基酸是色氨酸（Trp），在總數(shù)量中所占比例為1.7%。負電荷殘基總數(shù)（Asp+Glu）為75，正電荷殘基總數(shù)（Arg+Lys）為46。

圖1 草魚GHR2基因編碼蛋白質(zhì)的氨基酸組成Fig.1 Amino acid composition of proteins encoded by grass carp GHR2 gene

該基因編碼產(chǎn)物半衰期顯示是30 h，此外由于不穩(wěn)定指數(shù)為59.45（大于40.00），可知該基因編碼蛋白質(zhì)屬于不穩(wěn)定蛋白。

2.2 草魚GHR2基因編碼蛋白質(zhì)疏水性、親水性分析

通過軟件對檢測序列中每種氨基酸的氨基酸標度數(shù)值進行分析。氨基酸標度為正值，表明氨基酸具有較大的疏水性；氨基酸標度為負值時，值越小，表明氨基酸的親水性越強。軟件分析結(jié)果圖中正值區(qū)域表示疏水區(qū)域，0值以下區(qū)域表示親水區(qū)域。通過對親水性氨基酸與疏水性氨基酸數(shù)量統(tǒng)計分析，可判斷該基因編碼的產(chǎn)物是以親水性還是疏水性為主的蛋白，還可通過軟件檢測GRAVY值的正負，對氨基酸殘基的親水性/疏水性進行判斷。

草魚GHR2基因編碼蛋白質(zhì)親水性及疏水性分析結(jié)果見圖2。

由圖2可知，草魚GHR2基因編碼蛋白質(zhì)位于第259位的異亮氨酸（Ile）呈疏水性最大值，為+3.178；親水性最大值為-3.133，是位于第472位的蘇氨酸（Thr）。

圖2 草魚GHR2基因編碼蛋白質(zhì)疏水性/親水性預測分析Fig.2 Analysis of hydrophobic / hydrophilic prediction of GHR2 gene

統(tǒng)計整個編碼產(chǎn)品中兩種不同類型的氨基酸，親水氨基酸在全部氨基酸數(shù)量中占61.85%，疏水氨基酸所占比例是全部氨基酸數(shù)的39.15%，通過檢測的平均分呈現(xiàn)負值為-0.182，可預測結(jié)果顯示出親水性，草魚GHR2基因編碼中的蛋白質(zhì)是親水性蛋白質(zhì)。

2.3 草魚GHR2基因編碼蛋白質(zhì)的N-糖基化位點預測（見圖3）

蛋白質(zhì)的N-糖基化是一種常見的、涉及多種生理和病理過程的蛋白翻譯后修飾，對蛋白質(zhì)功能具有調(diào)節(jié)作用。因為其對蛋白質(zhì)的功能發(fā)揮非常重要，一旦出現(xiàn)狀況則會引起如腫瘤、自身免疫性疾病、感染等多器官系統(tǒng)疾病。對N-糖基化位點的鑒別是認識N-糖鏈功能的重要前提[6]。因此，對糖基化位點及該位點糖型分析具有十分重要的意義。

由圖3可知，草魚GHR2基因編碼蛋白存在7個潛在的N-糖基化位點，分別為Asn57、Asn80、Asn100、Asn141、Asn146、Asn376和Asn540。

圖3 草魚GHR2基因編碼蛋白質(zhì)的N-糖基化位點預測Fig.3 N-glycosylation site prediction of grass carp GHR2 protein

2.4 草魚GHR2基因編碼蛋白質(zhì)的磷酸化位點預測（見圖4）

蛋白質(zhì)磷酸化作為非常關(guān)鍵的一種蛋白質(zhì)翻譯后修飾，參與調(diào)節(jié)生物體內(nèi)的絕大多數(shù)細胞內(nèi)部的生物學過程[7]。

由圖4可知，利用相應(yīng)的生物信息學軟件對草魚GHR2進行磷酸化位點預測，對預估結(jié)果進行分析，統(tǒng)計共有73個潛在的磷酸化位點，其中包含43個絲氨酸（S）、22個蘇氨酸（T）、8個酪氨酸（Y）。

圖4 草魚GHR2基因編碼蛋白質(zhì)磷酸化位點預測Fig.4 Phosphorylation site prediction of grass carp GHR2 protein

2.5 草魚GHR2基因編碼蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域預測（見圖5）

由圖5可知，運用TMPRED和TMHMM2.0軟件對草魚GHR2蛋白跨膜結(jié)構(gòu)進行分析，結(jié)果顯示，草魚GHR2基因蛋白整體序列多數(shù)位于細胞膜表面，為跨膜蛋白。

圖5 草魚GHR2基因編碼蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)域分析Fig.5 Transmembrane domain analysis of protein encoded by GHR2 gene in grass carp

2.6 草魚GHR2基因編碼蛋白質(zhì)的信號肽分析（見圖6）

圖6 草魚GHR2基因編碼蛋白質(zhì)信號肽分析Fig.6 Signal peptide analysis of proteins encoded proteins in GHR2 gene

信號肽是一種保守的氨基酸序列，在不同的、新產(chǎn)生的蛋白質(zhì)N末端均存在。將新合成的蛋白轉(zhuǎn)移到具有不同膜結(jié)構(gòu)的亞細胞器中，并在生物體中調(diào)控蛋白的分泌和運動[8]。通常信號肽的長度介于13~36個氨基酸殘基范圍內(nèi)，以環(huán)狀構(gòu)象存在的信號肽使由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中蛋白質(zhì)形成的孔道打開。在信號肽的引導下，多肽鏈進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，隨后由腔表面的信號肽酶水解。

由圖6可知，GHR2基因編碼產(chǎn)物在第25位的得分值曲線比較有代表性，其中C值為0.33，Y值為0.562并且S值曲線較陡，表明草魚GHR2基因編碼蛋白是一種具有信號肽的蛋白，且第25號位置為信號肽剪切位點。

2.7 草魚GHR2基因編碼蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預測與分析（見圖7、圖8）

由圖7可知，草魚GHR2蛋白是由16.69%的α-螺旋（Hh），25.38%延伸鏈（Ee）和57.93%無規(guī)則卷曲（Cc）組成，以無規(guī)則卷曲為主。在二級結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，多肽鏈通過盤旋、折疊，在次級鍵維系的基礎(chǔ)上產(chǎn)生的特定空間結(jié)構(gòu)稱為三級結(jié)構(gòu)[9]。

圖7 草魚GHR2蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預測Fig.7 Secondary structure prediction of GHR2 protein in grass fish

由圖8可知，草魚GHR2蛋白三級結(jié)構(gòu)主要由無規(guī)則卷曲構(gòu)成，與對GHR2基因編碼產(chǎn)物的二級結(jié)構(gòu)結(jié)論相符。

圖8 草魚GHR2蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)預測Fig.8 Prediction of triple structure of GHR2 protein in grass carp

蛋白質(zhì)復雜的分子結(jié)構(gòu)決定其生物學功能，而對蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的定量預測研究與定量分析對進一步了解蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和作用關(guān)系具有十分關(guān)鍵的作用，對深入認識蛋白結(jié)構(gòu)與功能之間復雜的關(guān)聯(lián)機制具有極其重要的意義[10]。

3 討論

魚類的生長受神經(jīng)內(nèi)分泌調(diào)節(jié)，調(diào)節(jié)魚類生長的相關(guān)激素利用激素發(fā)揮作用的特異性與位于靶細胞膜上的激素受體進行結(jié)合，在該過程中所發(fā)生的復雜反應(yīng)可實現(xiàn)GH作用的發(fā)揮。魚類中已通過克隆得到GHR1和GHR2等兩種基因全序列，其中從奧利亞羅非魚中只獲得含有典型跨膜結(jié)構(gòu)的GHR2基因序列[11]。魚類GHR基因的表達水平與自身生長、營養(yǎng)狀況密切相關(guān)。早期研究發(fā)現(xiàn)，禁食3周的大馬哈魚肝臟GHR基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，血液中GH水平顯著升高。尼羅羅非魚則主要通過與肝臟GHR1的結(jié)合促進其自身生長[12]。

大多研究通過RT-PCR的方法在不同物種的不同組織中檢測到GHR的表達。有研究顯示在魚類所有組織中，以肝臟中GHR表達量最高[13]，間接表明了GHR2基因在功能上的保守性。通過對藍太陽魚生長激素全長cDNA的克隆與序列分析，曹運長等[14]將推導出的氨基酸序列與其他動物生長激素進行了同源性比較；研究結(jié)果顯示，藍鰭鯛與大多數(shù)鱸形目魚類的生長激素具有高度的同源性（85%以上），而與其他魚類如鲇形目和魚類的同源性較低（低于70%）。劉臻等[12]利用DNAMAN軟件對13種脊椎動物的GH cDNA編碼區(qū)序列進行同源性分析，結(jié)果顯示，所克隆的鱖GH cDNA序列與同屬鱖魚的同源性高達90%以上，與不同目的魚種的同源性較低，該結(jié)果也反映了生長激素在魚類之間的高度保守性。此外，宋興超等[15]在梅花鹿GHR基因的研究中將梅花鹿與反芻動物和部分哺乳動物、鳥類、魚類進行序列相似性分析，結(jié)果也證實了這一說法。綜上所述，不同物種GHR基因編碼氨基酸序列的相似性具有相同的趨勢。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，草魚GHR2基因編碼蛋白質(zhì)是由599個氨基酸組成的不穩(wěn)定可溶性蛋白，PI為4.89，屬于可溶性的不穩(wěn)定酸性蛋白。草魚GHR2蛋白是一種跨膜蛋白，存在信號肽，其二級結(jié)構(gòu)以無規(guī)則卷曲為主，具有較多的膜信號傳導外點，影響草魚某些細胞的代謝與信號傳導過程，并且可能影響蛋白質(zhì)對絲氨酸蛋白水解酶的鈍化或抑制的作用。