莊志江 張麗紅 蘭瑞

(1河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病二區(qū)，河南 鄭州 450099；2鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科；3河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病五區(qū))

腦梗死即為缺血性腦卒中，在全部腦卒中類型中占比高達(dá)85%左右，是臨床最為常見的腦血管疾病〔1,2〕。據(jù)相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，中老年人群為腦梗死的高發(fā)群體，近年來我國人口老齡化現(xiàn)象不斷加重，每年新增腦梗死病例數(shù)呈現(xiàn)連年上升趨勢(shì)，引起廣大專家學(xué)者的關(guān)注〔3,4〕。腦梗死具有發(fā)病急、嚴(yán)重程度高、致殘、致死率高、預(yù)后差的特點(diǎn)，因此尋找一種安全有效的治療手段對(duì)腦梗死治療、預(yù)后改善具有重要意義〔5,6〕。有研究表示，西醫(yī)手段治療腦梗死，臨床療效并不十分理想，因此越來越多的專家學(xué)者致力于中醫(yī)藥治療腦梗死的研究〔7〕。本研究設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，建立腦梗死大鼠模型，使用清熱熄風(fēng)活血湯進(jìn)行干預(yù)，探究清熱熄風(fēng)活血湯干預(yù)效果及相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 選取30只SD健康雄性大鼠(鄭州大學(xué)動(dòng)物研究院，使用許可證號(hào)：SYXK(豫)2018-0004)，8～10周齡，平均(9.0±0.8)周齡；體重225～247 g，平均(235.9±8.8)g。在相對(duì)濕度50%～55%、溫度(23.1±2.4)℃的環(huán)境中喂養(yǎng)1 w，光照12 h/d。主要試劑：兔抗大鼠γ-干擾素(IFN-γ)抗體(Hyclone公司)；大鼠抗小鼠白細(xì)胞介素(IL)-2、IL-4抗體(Selleck公司)；兔抗小鼠大鼠總抗氧化能力(TAOC)、一氧化氮(NO)抗體(Gibco公司)；大鼠抗小鼠IL-22、IL-3抗體(BD公司)；小鼠抗兔磷酸化氨基末端蛋白激酶(p-JNK)、磷酸化-絲裂原活化蛋白激酶p38(p-p38 MAPK)抗體(Dako公司)。

1.2建模及分組干預(yù) 選取10只大鼠作為正常組，其余20只建立腦梗死模型：將建模大鼠在實(shí)驗(yàn)臺(tái)固定后麻醉干預(yù)，頸部消毒處理后剪開正中位置皮膚，顯微鏡下操作，分離頸總動(dòng)脈(CCA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)、頸外動(dòng)脈(ECA)，近心端結(jié)扎近端ECA，微動(dòng)脈夾夾住ICA，結(jié)扎固定CCA，大鼠腦組織中動(dòng)脈阻斷后去除微動(dòng)脈夾，根部固定ICA，消毒縫創(chuàng)。建模過程中死亡2只，將其余18只腦梗死大鼠隨機(jī)分為腦梗死組、清熱熄風(fēng)活血湯組各9只。清熱熄風(fēng)活血湯組使用清熱熄風(fēng)活血湯進(jìn)行干預(yù)：石決明20 g，茯神、夜交藤各15 g，天麻、鉤藤各12 g，川牛膝、山梔、桑寄生、黃芩、益母草、杜仲各10 g，清水浸泡藥材0.5 h，加水煎1.5 h，取藥汁，對(duì)大鼠進(jìn)行灌胃處理。正常組、腦梗死組均使用同劑量生理鹽水灌胃處理。

1.3指標(biāo)檢測(cè)

1.3.1學(xué)習(xí)記憶能力、神經(jīng)功能評(píng)分 在直徑1.5 m、高0.5 m的圓形水池加半池27℃水，池壁頂端作4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)，池水中央放置0.3 m高平臺(tái)，分別于各標(biāo)記點(diǎn)使大鼠入水，記錄所有大鼠入水后到達(dá)平臺(tái)所用時(shí)長，若大鼠2 min后未達(dá)到預(yù)置平臺(tái)，則人工引至平臺(tái)，此時(shí)潛伏期記為120 s。所有大鼠在預(yù)置平臺(tái)上停留0.5 min，將其于其他標(biāo)記點(diǎn)再次置入水中，連測(cè)5 d。使用大鼠神經(jīng)功能缺損(mNSS)評(píng)分表對(duì)大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)，評(píng)價(jià)項(xiàng)目包括運(yùn)動(dòng)、感覺、反射、平衡狀況等，最高分18分，評(píng)分越低表示大鼠神經(jīng)功能損傷越輕。

1.3.2腦梗死面積、含水量檢測(cè) 各組大鼠麻醉后頸椎脫臼法處死，取出腦組織冷藏，30 min后2 mm厚度切片，添加2%氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液進(jìn)行染色，30 min后使用4%甲醛固定，6 h后拍照、計(jì)算梗死面積。含水量：吸取腦組織表面水分后稱重并記錄，使用烤箱將腦組織烤至恒重，稱量腦組織干質(zhì)量，腦含水量=(濕質(zhì)量-干質(zhì)量)/濕質(zhì)量。

1.3.3蘇木素-伊紅(HE)染色 將腦組織固定后浸泡于4%甲醛中1 d，取出后進(jìn)行石蠟包埋、連續(xù)切片。切片烤干后脫蠟，依次使用不同濃度酒精進(jìn)行復(fù)水處理。蘇木素染色15 min，取出清洗3次，鹽酸酒精分化處理30 s后進(jìn)行充分清洗，1%伊紅染色，酒精脫水，脫蠟后封片，顯微鏡觀察。

1.3.4輔助性T細(xì)胞(Th)1/Th2趨化因子、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)指標(biāo)水平檢測(cè) 使用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)：取各組大鼠腹部靜脈血3 ml,2 000 r/min離心15 min后-40℃保存。稀釋標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)記酶標(biāo)板，設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、待測(cè)標(biāo)本孔，并分別加入終止液和顯色劑、標(biāo)準(zhǔn)品、血清標(biāo)本和抗體，封膜并搖晃均勻，使用37℃保溫箱保存1 h后取出，去膜后清洗，將水分吸干后于各孔中添加顯色劑搖晃均勻，待顯色后加入終止液，以空白孔為基準(zhǔn)，使用酶標(biāo)儀測(cè)450 nm處吸光值，計(jì)算IFN-γ、IL-2、IL-4、TAOC、活性氧(ROS)、細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1、IL-3水平。

1.3.5Western印跡檢測(cè)JNK/p38 MAPK通路蛋白相對(duì)表達(dá)量 提取50 μg蛋白，煮沸至蛋白變性、凝膠電泳十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，根據(jù)蛋白分子切開凝膠轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，Western封閉液室內(nèi)封閉待測(cè)、內(nèi)參蛋白1.5 h，1∶1 000添加待測(cè)蛋白抗體，1∶2 000添加內(nèi)參抗體孵育1 d，取出后使用Western洗滌液清洗5次，1∶5 000加入山羊抗兔，Western洗滌液洗滌后顯色、曝光、成像。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS26.0軟件進(jìn)行F檢驗(yàn)、獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組腦組織病理學(xué)觀察 如圖1所示，正常組腦組織細(xì)胞細(xì)胞核清晰，排列規(guī)則，細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，未出現(xiàn)病理改變狀況；腦梗死組腦組織細(xì)胞細(xì)胞核破裂，排列雜亂，出現(xiàn)間質(zhì)水腫、炎性細(xì)胞浸潤情況；清熱熄風(fēng)活血湯組腦組織細(xì)胞腫脹、細(xì)胞核破裂、炎性細(xì)胞浸潤狀況相對(duì)較輕。

圖1 各組腦組織病理學(xué)觀察(HE染色，×400)

2.2各組學(xué)習(xí)記憶能力、神經(jīng)功能評(píng)分情況 如表1所示，腦梗死組、清熱熄風(fēng)活血湯組各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期長于正常組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；清熱熄風(fēng)活血湯組各時(shí)間點(diǎn)逃避潛伏期短于腦梗死組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；清熱熄風(fēng)活血湯組mNSS評(píng)分低于腦梗死組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.3各組腦梗死面積、腦組織含水量情況 如表1所示，腦梗死組、清熱熄風(fēng)活血湯組腦組織含水量高于正常組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；清熱熄風(fēng)活血湯組腦組織梗死面積、腦組織含水量均低于腦梗死組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表1 各組學(xué)習(xí)記憶能力、神經(jīng)功能評(píng)分及腦梗死面積、腦組織含水量比較

2.4各組Th1/Th2趨化因子水平比較 如表2所示，與正常組比較，腦梗死組、清熱熄風(fēng)活血湯組IFN-γ水平較低，IL-2、IL-4水平較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與腦梗死組比較，清熱熄風(fēng)活血湯組IFN-γ水平較高，IL-2、IL-4水平較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

2.5各組氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度對(duì)比 如表3所示，與正常組比較，腦梗死組、清熱熄風(fēng)活血湯組TAOC、ROS、ICAM-1、IL-3水平較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與腦梗死組比較，清熱熄風(fēng)活血湯組TAOC、ROS、ICAM-1、IL-3水平較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表2 各組Th1/Th2趨化因子水平比較

2.6各組JNK/p38 MAPK通路蛋白相對(duì)表達(dá)量對(duì)比 如表3、圖2所示，與正常組比較，腦梗死組、清熱熄風(fēng)活血湯組p-JNK、p-p38 MAPK表達(dá)較高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；與腦梗死組比較，清熱熄風(fēng)活血湯組p-JNK、p-p38 MAPK表達(dá)較低，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。

表3 各組氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)嚴(yán)重程度及JNK/p38 MAPK通路蛋白相對(duì)表達(dá)量對(duì)比

1～3:正常組，腦梗死組，清熱熄風(fēng)活血湯組

3 討 論

腦梗死是一種臨床常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，患者主要臨床表現(xiàn)為頭暈頭痛、偏癱、步態(tài)失常、惡心嘔吐、大小便失禁等，嚴(yán)重影響患者身體健康、生命安全〔8,9〕。據(jù)世衛(wèi)組織調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，腦梗死癥狀具有較高發(fā)病率、復(fù)發(fā)率，絕大多數(shù)復(fù)發(fā)腦梗死患者會(huì)出現(xiàn)終身殘疾，因此對(duì)腦梗死進(jìn)行及時(shí)有效的治療，降低腦梗死復(fù)發(fā)率對(duì)患者預(yù)后改善具有重要意義〔10,11〕。介入、溶栓、手術(shù)治療等均為常用的治療腦梗死的手段，但臨床療效并不十分理想。我國傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為腦梗死的主要病機(jī)為年老體弱、肝虧腎虛、經(jīng)脈痹阻等，清熱熄風(fēng)活血湯具有清熱、平肝陽、滋肝補(bǔ)腎的作用。

研究表明，腦梗死患者神經(jīng)功能、認(rèn)知功能受到明顯損傷，改善患者神經(jīng)功能、認(rèn)知功能是臨床治療腦梗死、改善患者預(yù)后的關(guān)鍵〔12,13〕。本研究說明腦梗死癥狀的發(fā)生發(fā)展導(dǎo)致一定程度的認(rèn)知功能、神經(jīng)功能損傷，使用清熱熄風(fēng)活血湯進(jìn)行干預(yù)能夠減輕腦梗死大鼠神經(jīng)功能損傷程度，提升大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，具有一定神經(jīng)損傷保護(hù)作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，使用清熱熄風(fēng)活血湯進(jìn)行干預(yù)的腦梗死大鼠腦組織梗死面積、含水量明顯下降，進(jìn)一步體現(xiàn)出清熱熄風(fēng)活血湯的腦保護(hù)作用。

研究表明，Th1/Th2平衡失調(diào)參與腦梗死癥狀的發(fā)生發(fā)展〔14〕，IFN-γ、IL-2、IL-4均為Th1/Th2趨化因子，本研究結(jié)果顯示，腦梗死大鼠出現(xiàn)Th1/Th2平衡失調(diào)狀況，使用清熱熄風(fēng)活血湯干預(yù)能夠調(diào)節(jié)腦梗死大鼠Th1/Th2平衡，改善大鼠免疫應(yīng)答。

臨床研究表明，腦梗死癥狀的發(fā)生發(fā)展伴隨著機(jī)體腦組織氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)〔15,16〕。腦組織氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致機(jī)體腦組織損傷、神經(jīng)功能缺損，抑制腦組織氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)是治療腦梗死、改善患者神經(jīng)功能和預(yù)后的關(guān)鍵〔17,18〕。本研究結(jié)果說明，腦梗死大鼠腦組織出現(xiàn)一定程度的氧化應(yīng)激損傷及炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損。本研究說明，使用清熱熄風(fēng)活血湯進(jìn)行干預(yù)能夠有效減輕腦梗死大鼠腦組織氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)，這可能也是清熱熄風(fēng)活血湯減輕腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損的重要機(jī)制之一。

有學(xué)者表示，腦梗死癥狀的發(fā)生發(fā)展與神經(jīng)元細(xì)胞異常凋亡具有密切聯(lián)系〔19,20〕。JNK/p38 MAPK通路能夠介導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞分化、凋亡，還能夠分化炎性因子，在腦血管疾病發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用〔21,22〕。本研究結(jié)果顯示，使用清熱熄風(fēng)活血湯進(jìn)行干預(yù)能夠調(diào)控JNK/p38 MAPK通路蛋白表達(dá)，抑制腦梗死大鼠神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，減輕神經(jīng)系統(tǒng)損傷嚴(yán)重程度，起到腦保護(hù)作用。

綜上所述，使用清熱熄風(fēng)活血湯對(duì)腦梗死模型大鼠進(jìn)行干預(yù)，能夠有效改善腦梗死大鼠認(rèn)知功能、神經(jīng)功能，其作用機(jī)制可能是清熱熄風(fēng)活血湯干預(yù)能夠減輕腦梗死大鼠腦組織氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)，調(diào)控JNK/p38 MAPK通路，抑制神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用，為腦梗死的治療提供一定的理論依據(jù)。