陳國斌 祝文峰 史文娟 董倩

宮腔粘連 (intrauterine adhesion,IUA) 是最常見的子宮內膜病變疾病之一［1］。近年來,由于子宮內膜損傷和感染的增加,IUA 的發(fā)病率有所上升［2］。目前盡管經宮腔鏡下宮腔粘連分離術是IUA 的標準治療方法,但治療后復發(fā)率仍較高［3］。IUA 與繼發(fā)性不孕和流產密切相關,是目前影響女性生殖健康的重要病因之一［4］,因此研究IUA 的發(fā)病機制對于IUA 的防治具有重要的意義。相關研究表明,子宮內膜纖維化是IUA 最重要的病理特征之一［5］。基質細胞作為子宮內膜的主要細胞群之一,是子宮內膜功能的重要介質,因此,探究IUA 子宮內膜基質細胞纖維化相應的分子機制具有重要的意義。同源框轉錄反義RNA (homeobox gene antisense intergenic RNA,HOTAIR)是一種與多種纖維化疾病相關的長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA),已有研究報道,過表達HOTAIR 可促進子宮內膜纖維化［6］,但具體分子機制尚不完全明確。lncRNA 通過海綿化miRNA 來調控mRNA 表達是其發(fā)揮其作用的方式之一［7］。本研究通過生物信息學分析發(fā) 現(xiàn),HOTAIR 與miR-326、miR-326 與NUS1 存 在結合位點。相關文獻報道,miR-326 在IUA 子宮內膜組織中下調表達,過表達miR-326 通過下調促纖維化基因來抑制子宮內膜纖維化［8］；NUS1 在IUA 組織中上調,且其高表達與IUA 的嚴重程度呈正相關［9］。而HOTAIR 能否通過調控miR-326/NUS1 軸影響IUA 子宮內膜基質細胞纖維化尚不明確。因此,本研究主要探究HOTAIR 對IUA 子宮內膜基質細胞纖維化的影響以及其作用機制。

1 材料與方法

1.1材料 收集2018 年2 月～2020 年2 月在本院首次確診為IUA 的18 例患者的子宮內膜組織,另取同期因不孕癥接受宮腔鏡子宮內膜活檢的18 例患者的子宮內膜組織作為對照。本研究得到本院倫理委員會審核批準,術前獲得所有患者的書面知情同意書。HESC 細胞購自上海弘順生物公司。

1.2主要試劑 HOTAIR 小干擾RNA(si-HOTAIR)及其陰性對照(si-NC)、HOTAIR 過表達物(pIRES2-HOTAIR) 及其陰 性對照(pIRES2)、miR-326 模擬物(miR-326 mimic)及其陰性對照(mimic NC)均購自上海美軒生物公司；CCK-8 試劑盒購自上海廣銳生物公司；Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡試劑盒購自上海富雨生物公司；兔源-抗纖連蛋白(Fibronectin,FN)、Ⅰ型膠原蛋 白α1 鏈(collagen type 1 α1 chain,COL1A1)、α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)、NUS1、GAPDH 及過氧化物酶標記的羊抗兔免疫球蛋白G(IgG)二抗均購自英國Abcam 公司。

1.3細胞培養(yǎng)及分組 將HESC 細胞置于含有10%胎牛血 清、100 U/ml 青霉素 和100 μg/ml 鏈 霉素的DMEM-F12 培養(yǎng)基中,并在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。將HESC 細胞用10 ng/ml TGF-β1處理48 h［2］以誘導IUA 子宮內膜基質細胞模型,命名為IUA HESC細 胞。將IUA HESC 細胞分 為Ct 組(TGF-β1處 理HESC 細 胞48 h)、pcDNA 組(轉 染pcDNA 24 h 后 再用TGF-β1處 理HESC 細 胞48 h)、pcDNA-HOTAIR組(轉 染pcDNA -HOTAIR 24 h 后再用TGF-β1處理HESC 細胞48 h)、si-NC 組(轉染si-NC 24 h 后再用TGF-β1處理HESC 細胞48 h)、si-HOTAIR 組(轉染si-HOTAIR 24 h 后 再用TGF-β1處 理HESC 細 胞48 h)、si-HOTAIR+inhibitor NC 組(轉 染si-HOTAIR+inhibitor NC 24 h 后再用TGF-β1處理HESC 細胞48 h)、si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 組(轉染si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 24 h 后再用TGF-β1處理HESC 細胞48 h)。

1.4qRT-PCR 檢測組織和細胞中HOTAIR、miR-326 表達 使用TRIzol 試劑從組織勻漿和細胞中提取總RNA。將總RNA(2 μg)逆轉錄為 cDNA 后,以cDNA為模板進行定量聚合酶鏈式反應(PCR)。GAPDH 作為HOTAIR 的內參基因,U6 作為miRNA 的內源性對照,采用2-ΔΔCt法計算基因的表達量。引物序列：GAPDH：正向為5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'；反向為5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'；HOTAIR：正向為5'-CCTTATAAGCTCATCGGAGCA-3'；反向為5'-C ATTTCTGGGTGGTTCCTTT-3'；miR-326：正向為5'-C CTCTGGGCCCTTCC-3'；反向為5'-CAGTGCGTGTCGT GGAGT-3'；U6：正向為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'；反向為5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.5CCK-8 法檢測IUA HESC 細胞增殖 將各組細胞以2×104個/孔的密度接種在96 孔板中,孵育48 h 后每孔加入10 μl CCK8 試劑。使用SpectraMax M5 酶標儀檢測OD450。

1.6流式細胞術檢測IUA HESC 細胞凋亡 將各組細胞用PBS 洗滌后調整細胞濃度為5×104個/ml,加入5 μl Annexin-V-FITC 和 5 μl PI 在4 ℃下避光孵育20 min 后,再用500 μl 結合緩沖液重懸細胞。通過流式細胞儀觀察細胞凋亡情況。

1.7western blot 檢測組織和細胞中NUS1、COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表達 在冰上使用RIPA 裂解緩沖液從組織勻漿和細胞中提取總蛋白。將獲得的裂解物在4℃下以12000×g 離心30 min。通過使用BCA 蛋白質測定試劑盒進行蛋白質定量。蛋白質通過10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后轉移到PVDF 膜上。用5%脫脂奶粉封閉后,將膜與一抗NUS1(1∶1000)、COL1A1(1∶2000)、FN(1∶1000)、α-SMA(1∶2000)、GAPDH(1∶1000)在 4℃下孵育過夜,然后將膜與二抗(1∶1000)在室溫下孵育2 h。使用ChemiDoc MP 成像系統(tǒng)檢測條帶,并使用ImageJ 1.51軟件對所有蛋白質條帶進行定量分析。

1.8雙熒光素酶報告基因實驗 構建HOTAIR-WT 和HOTAIR-MUT,將HOTAIR-WT 和HOTAIR-MUT 分別與mimic NC 或miR-326 mimic 共轉染于IUA HESC 細胞,48 h 后檢測熒光素酶活性。

1.9RNA pull down實驗 對pIRES2-HOTAIR或pIRES2的DNA 片段進行PCR 擴增、酶切后,得到線性化的質粒DNA。使用生物素RNA 標記線性化的pIRES2-HOTAIR 和pIRES2,分別命名為bio-HOTAIR、bio-NC。將bio-HOTAIR、bio-NC 在體外轉錄、純化后,將其分別與IUA HESC 細胞的總細胞裂解物一起孵育,洗脫的RNA 被純化并通過qRT-PCR 評估HOTAIR、miR-326 的表達量。

1.10統(tǒng)計學方法 使用IBM SPSS Statistics 24.0 軟件進行統(tǒng)計分析,計量資料以均數±標準差()表示,兩組間比較采用t 檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,進一步兩組間的比較采用SNK-q 檢驗。P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在組織和細胞中的表達 IUA 子宮內膜組織中 HOTAIR、NUS1/GAPDH 表達水平高于正常子宮內膜組織,miR-326 表達水平低于正常子宮內膜組織,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖1,表1。IUA HESC 細胞中 HOTAIR、NUS1/GAPDH 表達水平高于HESC 細胞,miR-326 表達水平低于HESC 細胞,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2,表2。

圖1 western blot 檢測組織中NUS1 蛋白表達

表1 HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在組織中的表達(,n=18)

表1 HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在組織中的表達(,n=18)

注：與正常子宮內膜組織比較,aP<0.05

圖2 western blot 檢測細胞中NUS1 蛋白表達

表2 HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在細胞中的表達(,n=6)

表2 HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在細胞中的表達(,n=6)

注：與HESC 細胞比較,aP<0.05

2.2HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在IUA HESC細胞中的表達 pcDNA-HOTAIR 組 HOTAIR、NUS1/GAPDH 表達水平高于Ct 組、pcDNA 組,miR-326 表達水平低于Ct 組、pcDNA 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；si-HOTAIR 組 HOTAIR、NUS1/GAPDH 表 達水平低于Ct 組、si-NC 組,miR-326 表達水平高于Ct 組、si-NC 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；si-HOTAIR組、si-HOTAIR+inhibitor NC 組 及si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 組 HOTAIR 表達水平比較,差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 組miR-326 表達水平低于si-HOTAIR 組、si-HOTAIR+inhibitor NC 組,NUS1/GAPDH 表達水平高于si-HOTAIR 組、si-HOTAIR+inhibitor NC 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3,表3。

表3 HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在IUA HESC 細胞中的表達(,n=6)

表3 HOTAIR、miR-326、NUS1 蛋白在IUA HESC 細胞中的表達(,n=6)

注：與Ct 組比較,aP<0.05；與pcDNA 組比較,bP<0.05；與si-NC 組比較,cP<0.05；與si-HOTAIR 組比較,dP<0.05；與si-HOTAIR+inhibitor NC 組比較,eP<0.05

圖3 western blot 檢測IUA HESC 細胞中NUS1 蛋白表達

2.3過表達或沉默HOTAIR 對IUA HESC 細胞增殖的影響 pcDNA-HOTAIR 組IUA HESC 細 胞OD450值高于Ct 組、pcDNA 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；si-HOTAIR 組IUA HESC 細胞OD450值低于Ct 組、si-NC 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 組IUA HESC 細胞OD450值高于si-HOTAIR 組、si-HOTAIR+inhibitor NC 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 七組IUA HESC 細胞OD450 值比較(,n=6)

表4 七組IUA HESC 細胞OD450 值比較(,n=6)

注：與Ct 組比較,aP<0.05；與pcDNA 組比較,bP<0.05；與si-NC 組比較,cP<0.05；與si-HOTAIR 組比較,dP<0.05；與si-HOTAIR+inhibitor NC 組比較,eP<0.05

2.4過表達或沉默HOTAIR 對IUA HESC 細胞凋亡的影響 pcDNA-HOTAIR 組IUA HESC 細胞凋亡率低于Ct 組、pcDNA 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；si-HOTAIR 組IUA HESC 細胞凋亡率高于Ct 組、si-NC 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 組IUA HESC 細胞凋亡率低于si-HOTAIR組、si-HOTAIR+inhibitor NC 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖4,表5。

表5 七組IUA HESC 細胞凋亡率比較(,%,n=6)

注：與Ct 組比較,aP<0.05；與pcDNA 組比較,bP<0.05；與si-NC 組比較,cP<0.05；與si-HOTAIR 組比較,dP<0.05；與si-HOTAIR+inhibitor NC 組比較,eP<0.05

圖4 流式細胞術檢測IUA HESC 細胞凋亡

2.5過表達或沉默HOTAIR 對IUA HESC 細胞纖維化的影響 pcDNA-HOTAIR 組IUA HESC 細胞中COL1A1/GAPDH、FN/GAPDH、α-SMA/GAPDH 表達水平高于Ct 組、pcDNA 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；si-HOTAIR 組IUA HESC 細胞中COL1A1/GAPDH、FN/GAPDH、α-SMA/GAPDH 表達水平低于Ct 組、si-NC 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；si-HOTAIR+miR-326 inhibitor 組IUA HESC 細胞中COL1A1/GAPDH、FN/GAPDH、α-SMA/GAPDH 表 達水平高于si-HOTAIR 組、si-HOTAIR+inhibitor NC 組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖5,表6。

圖5 western blot 檢測IUA HESC 細胞中COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表達

表6 七組IUA HESC 細胞中COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表達比較(,n=6)

表6 七組IUA HESC 細胞中COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表達比較(,n=6)

注：與Ct 組比較,aP<0.05；與pcDNA 組比較,bP<0.05；與si-NC 組比較,cP<0.05；與si-HOTAIR 組比較,dP<0.05；與si-HOTAIR+inhibitor NC 組比較,eP<0.05

2.6HOTAIR 靶向調控miR-326/NUS1 軸 starbase 預測lncRNA HOTAIR 與miR-326、miR-326 與NUS1 的結合位點,見圖6。miR-326 mimic 和HOTAIR-WT 共轉染組的熒光素酶活性低于mimic NC 和HOTAIR-WT共轉染組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；mimic NC 和HOTAIR-MUT 共轉染組與miR-326 mimic 和HOTAIRMUT 共轉染組的熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。miR-326 mimic 和NUS1-WT 共轉染組的熒光素酶活性低于mimic NC 和NUS1-WT 共轉染組,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；mimic NC 和NUS1-MUT共轉染組與miR-326 mimic 和NUS1-MUT 共轉染組的熒光素酶活性比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表7。bio-lncRNA HOTAIR 沉淀中 的lncRNA HOTAIR 和miR-326 水平均顯著高于bio-NC,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖7。

表7 熒光素酶活性比較(,n=6)

表7 熒光素酶活性比較(,n=6)

注：與mimic NC 和HOTAIR-WT 共轉染組比較,aP<0.05；與mimic NC 和NUS1-WT 共轉染組比較,bP<0.05

圖6 starbase 預測lncRNA HOTAIR 與miR-326、miR-326 與NUS1 的結合位點

圖7 RNA pull down 驗證HOTAIR 與miR-326 的靶向結合

3 討論

IUA 是以子宮內膜損傷后宮腔前后壁部分或全部粘連為特征的常見婦科疾病。臨床表現(xiàn)包括月經量減少、閉經、不孕、前置胎盤、反復流產、早產、胎盤粘連、胚胎著床困難、胎盤發(fā)育異常等,嚴重影響女性的生殖健康［10］。IUA 的治療主要是宮腔鏡手術分離粘連,其次是防止再粘連,治療目的是恢復宮腔形態(tài)、促進內膜生長、改善妊娠結局。然而,統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)輕、中度IUA 治療后的再粘連率為30%,而嚴重者高達62.5%。且妊娠率僅為22.5%～33.3%［11］。據報道,子宮內膜纖維化進展參與了IUA 的發(fā)生、發(fā)展［12］。因此,探究IUA 子宮內膜纖維化相關的分子機制具有重要意義。

lncRNA 可參與纖維化疾病的各種生物學功能［13,14］。HOTAIR 作為一 種位于HOXC 基因座 的lncRNA,已有研究報道稱沉默HOTAIR 可抑制單側輸尿管阻塞大鼠腎間質纖維化［15］；降低HOTAIR 表達可抑制高糖誘導的糖尿病腎病系膜細胞纖維化［16］。表明HOTAIR 參與了纖維化疾病的進展。本研究通過TGF-β1誘導HESC 以構建IUA 體外細胞纖維化模型,并檢測了HOTAIR 在IUA 子宮內膜組織及IUA HESC細胞中的表達,結果顯示HOTAIR 在IUA 子宮內膜組織及IUA HESC 細胞中上調。COL1A1、FN、α-SMA作為衡量纖維化的常見指標,已有研究顯示,槲皮素通過降低TGF-β1誘導的子宮內膜基質細胞中COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表達來抑制細胞纖維化反應［17］。本研究顯示,過表達HOTAIR 可促進IUA HESC 細胞中COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表達,而沉默HOTAIR 則可抑制IUA HESC 細胞中COL1A1、FN、α-SMA 蛋白表達,提示沉默HOTAIR 可抑制IUA HESC 細胞纖維化。此外,本研究還發(fā)現(xiàn),過表達HOTAIR 可促進IUA HESC 細胞增殖,抑制細胞凋亡,而沉默HOTAIR 則呈相反趨勢。表明沉默HOTAIR 可能通過抑制細胞增殖,促進細胞凋亡的方式來抑制細胞纖維化。

lncRNA 可通過海綿吸附miRNA 來發(fā)揮其生物學功能。本研究通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)HOTAIR 與miR-326 存在結合位點。miR-326 是一種與纖維化疾病有關的miRNA,據報道,miR-326 在IUA 子宮內膜組織中的表達低于正常子宮內膜組織,并且與纖維化標志物(α-SMA、COL1A1 和 FN)的表達呈負相關［18］。以上研究表明miR-326 可抑制IUA 進展。本研究結果與其是一致的,本研究顯示,miR-326 在IUA 子宮內膜組織及IUA HESC 細胞中低表達,過表達HOTAIR 可抑制IUA HESC 細胞中miR-326 表達,沉默HOTAIR可促進IUA HESC 細胞中miR-326 表達,且雙熒光素酶報告基因和RNA pull down 實驗證實了HOTAIR 可與miR-326 靶向結合,推測沉默HOTAIR 可能通過上調miR-326 表達抑制IUA HESC 細胞纖維化。為了驗證該推測,本研究在沉默HOTAIR 的基礎上再加上miR-326 inhibitor 干預IUA HESC 細胞,結果顯示,miR-326 inhibitor 減弱了沉默HOTAIR 對IUA HESC 細胞纖維化的抑制作用,證實了沉默HOTAIR 可能通過上調miR-326 表達抑制IUA HESC 細胞纖維化。

miRNAs 可直接結合靶向mRNA 的3'端非翻譯區(qū)(3'UTR)以降解靶向mRNA 或抑制翻譯［19］。為了進一步探究沉默HOTAIR 可能通過上調miR-326 表達抑制IUA HESC 細胞纖維化的分子機制,本研究通過starbase 預測發(fā)現(xiàn)miR-326 與NUS1 存在結合位點。NUS1,也稱為 NgBR,是一種跨膜受體蛋白,已有研究顯示,NUS1 在人IUA 組織中異常高表達,過表達NUS1 減弱了IUA 后的子宮內膜上皮細胞凋亡作用［20］,提示NUS1 參與了IUA 進展。本研究發(fā)現(xiàn),NUS1 蛋白在IUA 子宮內膜組織及IUA HESC 細胞中高表達,過表達HOTAIR 后,IUA HESC 細胞中miR-326 下調表達,NUS1 蛋白上調表達；沉默HOTAIR 后,IUA HESC 細胞中miR-326 上調表達,NUS1 蛋白下調表達,且雙熒光素酶報告基因實驗證實了NUS1 蛋白可與miR-326靶向結合,以上結果表明沉默HOTAIR 可能通過海綿化miR-326 來下調NUS1 表達進而抑制IUA HESC 細胞纖維化。

綜上所述,沉默HOTAIR 可能通過海綿化miR-326 來下調NUS1 表達進而抑制IUA HESC 細胞纖維化,該研究可能為IUA 的治療提供潛在的靶點。