徐家雯，屠心茹，劉 銳，江 瑞，陶 龍，姚余有，2*

1.安徽醫(yī)科大學 公共衛(wèi)生學院 衛(wèi)生檢驗與檢疫學系，安徽 合肥 230031；2.安徽醫(yī)科大學 人口健康與優(yōu)生安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230031

女性患阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)的風險更高[1]，學習記憶損傷是AD的早期癥狀，海馬與學習記憶密切相關，且海馬對壓力、應激等環(huán)境因素很敏感[2]。慢性應激是指機體長期受到各種內外負面因素的刺激而發(fā)生的非特異性全身反應[3]，慢性應激可能引起機體免疫、神經生化等系列改變[4]，從而影響腦細胞的正常功能，影響學習記憶。m-TOR信號受損后，導致小鼠海馬中樹突狀蛋白合成減少[5]，慢性應激是否可通過m-TOR信號通路致老年雌性海馬組織神經元損傷，最終引起學習記憶損傷有待研究?；诖?，該研究采用20月齡自然老化ICR小鼠模擬人老年期，對其施加慢性不可預測溫和應激(chronic unpredictable mild stress，CUMS)，觀察各組記憶能力，并探討慢性應激致老年雌鼠學習記憶下降的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：SPF級10月齡ICR小鼠共40只，雌鼠與雄鼠各20只，體質量60～80 g(杭州子源實驗動物有限公司合格證號：20210523Abzz0105000786)。在鼠房溫度為18～25 ℃、環(huán)境相對濕度50%～70%、循環(huán)給與12 h光照和12 h黑暗、小鼠可自由獲得水和食物的條件下，飼養(yǎng)全部小鼠至20月齡。

1.1.2 試劑：β-actin抗體、m-TOR抗體、P-mTOR抗體和辣根酶標山羊抗鼠抗體(Abmart公司)；小鼠血清CRH ELISA試劑盒(Elabscience公司)； BCA試劑盒(上海碧云天公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的分組及處理：將小鼠分為對照雌性組、對照雄性組、應激雌性組、應激雄性組。應激開始前，使用新物體識別實驗測定4組應激前學習記憶能力。采用隨機數表法對應激組每天施加一種應激，持續(xù)30 d，慢性應激施加方法參考相關文獻并加以改進[6]。慢性應激方式共包括以下8種：1)夾尾(距尾尖2 cm處，5 min);2)禁水(24 h);3)改變居住環(huán)境(讓鼠在潮濕的墊料上生活24 h);4)禁食(24 h);5)束縛應激(60 min);6)冰水游泳(4～6 ℃，5 min);7)熱水游泳(28～35 ℃，15 min);8)晝夜顛倒。應激結束后，采用新物體識別和Morris水迷宮測定4組小鼠應激后學習記憶能力。行為學實驗結束后，將小鼠麻醉后眼球取血并處死，解剖小鼠取海馬、全腦。

1.2.2 新物體識別實驗測定學習記憶：該實驗一共分為兩個階段，第一階段為熟悉期：在測試箱中放入A、B兩個相同的物體，讓小鼠自由探索10 min。第二階段為識別期：熟悉1 h后，將測試箱中的B物體換成C物體，C物體是不同于A、B物體的新物體，讓小鼠自由探索5 min。實驗結束后分析小鼠在熟悉期和識別期對各個物體的探索時間，計算識別系數。計算公式為：識別系數=新物體探索時間/(新物體探索時間+熟悉物體探索時間)。

1.2.3 Morris水迷宮測定學習記憶：參考相關文獻進行操作[7]。在定位巡航試驗中，連續(xù)訓練6 d，4次/d，投放點分別為正北、正南、正西、正東。定位巡航試驗結束后，在第7天，撤除平臺，選定和平臺相對的象限為入水點，記錄60 s內小鼠為搜索平臺而穿過平臺各象限區(qū)域的時間，以及穿過平臺區(qū)的次數。

1.2.4 腦組織Nissl染色：小鼠腦組織標本于4%多聚甲醛固定24～72 h后脫水、石蠟包埋并切片(3 μm)，對切片進行尼氏染色。于正置熒光顯微鏡下觀察每張切片(×200)，選取各組小鼠海馬相同層面CA3、CA1和DG區(qū)3個視野，采用Image-J軟件計視野內染色陽性細胞數。

1.2.5 腦組織Golgi-Cox染色：行為測試結束后，隨機從各組中抽取部分小鼠斷頭取腦，將腦組織置于20 mL Golgi-Cox溶液中(將5%重鉻酸鉀，5% 氯化汞，5%鉻酸鉀和純水按5∶5∶4∶10的比例配制)，37 ℃避光放置7 d。7 d 后取出腦組織置于30%蔗糖溶液中，浸泡1 d。使用振動切片機對腦組織行連續(xù)切片，切片厚度為200 μm，取相同層面海馬切片依次進行顯影、脫水、封片、干燥等操作。采用 Image-J軟件對神經元樹突進行分析。

1.2.6 Western blot檢測蛋白：測定海馬組織m-TOR、p-mTOR蛋白表達水平 提取海馬組織中的總蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移蛋白至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，一抗(m-TOR、p-mTOR)孵育，二抗孵育，采用化學發(fā)光成像儀進行顯影，采用Image-J軟件進行光密度值分析。

1.2.7 ELISA檢測血清CRH含量：從-80 ℃冰箱中取出血清后置于冰上緩慢融化，按照試劑盒說明書操作。采用酶標儀檢測微孔板對應的吸光度(absorbance,A)值。使用Origin 9.0軟件計算標準曲線并將檢測樣本A值代入標準曲線公式計算血清CRH濃度。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 各組小鼠行為學實驗結果

2.1.1 新物體識別：應激前各組認知系數水平相近。應激后僅應激雌性組認知系數較應激前下降(P<0.001)，且顯著低于應激雄性組(P<0.001)和應激后的對照雌性組(P<0.001)(圖1)。

*P<0.001 compared with before applied stress of stress female group；#P<0.001 compared with after applied stress of stress female group圖1 各組小鼠新物體識別實驗識別系數Fig 1 Recognition coefficients of new object recognition experiments in each group of

2.1.2 Morris水迷宮：隨訓練天數的增加，各組小鼠逃避潛伏期整體呈下降趨勢，但應激雌性組在為期6 d的訓練中與其他各組相比均需花費更多時間找到平臺。應激雌性組小鼠第1、3、4、5和6天相較對照雌性組小鼠逃避潛伏期差異有統(tǒng)計學意義(DAY1:P<0.05；DAY3:P<0.05；DAY4:P<0.01; DAY5:P<0.001；DAY6:P<0.001)；從第5天開始，應激雌性組與應激雄性組逃避潛伏期相比有差異(DAY5:P<0.01；DAY6:P<0.01)(圖2B)。

在空間探索實驗中，應激雌性組穿越平臺次數少于對照雌性組和應激雄性組(P<0.01，P<0.01)(圖2C)。應激雌性組穿越目標象限次數少于對照雌性組和應激雄性組(P<0.0001，P<0.01)(圖2D)。

2.2 海馬區(qū)尼氏染色結果

對照雌性組、對照雄性組與應激雄性組各個區(qū)神經元形態(tài)完整，細胞排列緊密而規(guī)則，核仁清晰，胞漿內尼氏體豐富，而應激雌性組各個區(qū)細胞排列松散，神經元丟失明顯，核仁模糊，尼氏體減少(圖3A)。

應激雌性組CA3區(qū)的神經元數量少于對照雌性組和應激雄性組(P<0.001，P<0.001)(圖3B)。應激雌性組CA1區(qū)的神經元數量少于對照雌性組和應激雄性組(P<0.001，P<0.001)(圖3C)。應激雌性組DG區(qū)的神經元數量少于對照雌性組和應激雄性組(P<0.001，P<0.001)(圖3D)。

A.representative graphs of the swimming trajectory of each group of mice during the six-day positioning cruise experiment；B.escape latency of mice in each group of the positioning cruise experiment；C.the number of times each group of mice crossed the platform in the spatial exploration experiment；D.The number of times each group of mice crossed the target quadrant in the spatial exploration experiment；E.swimming speed of each group of mice in the space exploration experiment; *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with control female group；#P<0.01 compared with stress female group

A.Nissl staining of hippocampal CA3, CA1and DG areas in each group of mice (×200)；B.number of neurons in the CA3 area under the visual field；C.number of neurons in the CA1 area under the visual field；D.number of neurons in the DG area under the visual field；*P<0.001 compared with control female group；#P<0.001 compared with stress female group

2.3 高爾基染色結果

應激雌性組小鼠海馬CA3、CA1區(qū)椎體神經元基底樹突的分支數及基底樹突總長度較對照雌性組和應激雄性組均減少(P<0.05)(圖4A～D)。對DG區(qū)神經元作Sholl分析，結果顯示應激雌性組在20～200 μm的交點數少于其余各組，在距胞體80 μm處交點數少于對照雌性組(P<0.05)，在距胞體80、120、140 μm處交點少于應激雄性組(P<0.05，P<0.05，P<0.01)(圖4E～F)。

2.4 腦組織中m-TOR、p-mTOR蛋白的表達

應激雌性組m-TOR蛋白表達下降，與對照雌性組和應激雄性組相比有差異(P<0.001，P<0.01)，應激雌性組小鼠p-mTOR蛋白表達下降，與對照雌性組和應激雄性組相比有差異(P<0.05，P<0.01)(圖5)。

2.5 血清CRH水平

應激雌性組與對照雌性組和應激雄性組相比CRH水平顯著上升(P<0.05，P<0.01)(圖6)。

3 討論

慢性應激導致大腦特別是海馬功能和結構發(fā)生變化，而海馬在認知功能中起關鍵作用。老年人是易發(fā)生認知衰退的弱勢群體，且以往研究顯示老年女性更易發(fā)生認知衰退[8]，故研究慢性應激是否更易致老年雌鼠學習記憶能力下降有重要意義。

在新物體識別實驗中，小鼠應激前學習記憶力無差異，但應激后雌性組記憶下降明顯。Morris水迷宮進一步證明了慢性應激更易致老年雌鼠學習記憶損傷，這與Nascimento研究連續(xù)3 d束縛應激僅引起6周齡雌性小鼠記憶損傷的結果相似[9]。慢性應激可導致海馬功能和結構的改變[10]，尼氏體是神經元胞體的特征性結構之一， 尼氏體的狀態(tài)是神經元是否受損的重要標志。本研究尼氏染色發(fā)現應激雌性組小鼠海馬CA3、CA1和DG區(qū)神經細胞受損明顯，這與Haixia Wang連續(xù)35 d束縛應激會導致7～8周小鼠神經元損傷的研究結果相似[11]。此外，高爾基染色顯示，應激雌性組海馬CA3、 CA1、DG區(qū)神經元樹突分支減少，神經元復雜程度降低，提示由CUMS引起的海馬神經元病理損傷可能是造成老年雌鼠認知下降的重要原因。本行為學實驗不足之處是數據標準差偏大，影響統(tǒng)計效能，可能是老年鼠個體差異較大引起，其原因還有待進一步研究。

A.number of basal dendrites of vertebral neurons in the CA3 region；B.total length of basal dendrites of vertebral neurons in the CA3 region; C.number of basal dendrites of vertebral neurons in the CA1 region；D.total length of basal dendrites of vertebral neurons in the CA1 region；E.schematic diagram of Sholl analysis of neurons in the DG region；F.number of neurons in the DG area with concentric circle intersection；*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with control female group；#P<0.05，##P<0.01,###P<0.001 compared with stress female group; △P<0.05, △△P<0.01 compared with stree male group

A.Western blot；B.Hippocampal m-TOR protein expression levels in each group of mice； C.Hippocampal p-mTOR protein expression levels in each group of mice；*P<0.05, **P<0.01 compared with control female group；#P<0.01 compared with stress female group

*P<0.05 compared with control female group；#P<0.01 compared with stress female group圖6 各組小鼠血清CRH含量Fig 6 Serum CRH levels of mice in each group

m-TOR在調控細胞增殖的過程中起關鍵作用，激活m-TOR可增加小鼠神經元樹突的數量和功能，故其與學習記憶的改變可能存在密切聯(lián)系[12]。本研究發(fā)現，應激雌性組小鼠海馬m-TOR與p-mTOR蛋白表達水平顯著下降，但應激雄性組小鼠海馬m-TOR與p-mTOR蛋白表達未下降，提示慢性應激可能通過抑制老年雌鼠海馬m-TOR通路進而導致海馬病理損傷。

CRH主要由下丘腦室旁核分泌，在應對壓力的反應中起重要作用，以往研究顯示應激水平的CRH可以抑制體外培養(yǎng)的海馬片樹突生長[13-14]且下調m-TOR水平[15]。本研究發(fā)現，應激雌性組小鼠血清CRH水平濃度顯著上升，提示慢性應激可能通過升高CRH抑制海馬m-TOR的表達，損傷海馬神經元。

綜上所述，慢性應激更易致老年雌性小鼠記憶損傷，其機制可能是慢性應激通過升高CRH抑制海馬m-TOR的表達，損傷海馬神經元，從而導致老年雌鼠更易出現認知損傷。