王玨雪 萬修華

先天性白內(nèi)障(CC)是指出生前后或出生后1年內(nèi)發(fā)生的白內(nèi)障,是造成兒童失明和弱視的重要原因。有研究顯示,CC的總體患病率為0.63/10 000～9.74/10 000,地區(qū)亞組之間亞洲的患病率最高,為7.43/10 000[1-2]。目前針對CC仍以手術(shù)治療為主,但手術(shù)治療不可避免地會帶來各種術(shù)后并發(fā)癥,如后囊混濁、青光眼等,往往會終生影響患兒視力[3]。CC的病因復(fù)雜,可分為遺傳性CC、非遺傳性CC和特發(fā)性CC,其中遺傳性CC約占22.3%[2]。CC的遺傳方式主要包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X-性連鎖遺傳,其中以常染色體顯性遺傳最多見,占44.0%[4]。目前已知超過52個基因突變可導(dǎo)致非綜合征型遺傳性CC,包括晶狀體蛋白基因、膜蛋白基因、細(xì)胞骨架蛋白基因、編碼轉(zhuǎn)錄因子基因、水通道蛋白基因等[4-5]。CC具有很大的遺傳和表型異質(zhì)性,發(fā)病機制復(fù)雜[5]。對于基因功能的研究有助于揭露其發(fā)病機制,豐富其致病基因譜,因此,本文就其中晶狀體蛋白致病基因及其功能研究進行綜述。

1 晶狀體蛋白基因

目前,在已經(jīng)鑒定出的CC突變基因中,大約50.0%的突變發(fā)生在晶狀體蛋白基因中[6]。晶狀體蛋白是眼晶狀體纖維細(xì)胞的主要組成蛋白,占晶狀體中蛋白質(zhì)含量的90.0%,包括α-晶狀體蛋白、β-晶狀體蛋白和γ-晶狀體蛋白,對維持晶狀體的透明度和折射率起著至關(guān)重要的作用[7]。在不同的應(yīng)力條件下,隨著年齡的增長,β-晶狀體蛋白和γ-晶狀體蛋白開始展開并部分聚集。蛋白質(zhì)在晶狀體中的聚集會增強光的散射,導(dǎo)致患者視力問題,即白內(nèi)障。作為分子伴侶的α-晶狀體蛋白與其底物β-晶狀體蛋白和γ-晶狀體蛋白形成復(fù)合物可以防止這種聚集。晶狀體中的各種蛋白質(zhì)相互作用保持了晶狀體的透明性[8]。

2 α-晶狀體蛋白基因

α-晶狀體蛋白屬于小熱休克蛋白家族,具有分子伴侶特性,由2個亞基組成,包括αA和αB,在人體中的比例為31[7],它們由位于不同染色體上的2個基因CRYAA(21q22)和CRYAB(11q22)編碼,αA-晶狀體蛋白主要存在于晶狀體中,而αB-晶狀體蛋白則廣泛表達(dá)于多種組織器官,包括晶狀體、大腦、腎、肌肉等[9]。晶狀體蛋白聚集或聚合成高分子量復(fù)合物是白內(nèi)障晶狀體混濁產(chǎn)生光散射導(dǎo)致患者視力喪失的主要原因[10]。而α-晶狀體蛋白不依賴 三磷酸腺苷(ATP)也可有效地與受損或部分未折疊的蛋白質(zhì)結(jié)合,抑制蛋白質(zhì)的錯誤折疊和廣泛聚集[10]。

2.1 CRYAA基因突變

Litt等[11]首次報道了常染色體顯性遺傳的CRYAA基因突變R116C,突變使精氨酸編碼為半胱氨酸,攜帶的正電荷減少,巰基增加,破壞了αA-蛋白多肽結(jié)構(gòu),損壞分子伴侶功能,從而導(dǎo)致聚合物的疏水性和蛋白質(zhì)沉淀。Devi等[12]研究顯示,R54C突變與常染色體顯性遺傳的先天性核性白內(nèi)障具有相關(guān)性,并伴有小角膜臨床特征表現(xiàn)。Khan等[13]報道的R54C突變引起常染色體隱性遺傳性白內(nèi)障,其中突變純合子的家庭成員患有先天性全白內(nèi)障伴小角膜,并且在突變的雜合子攜帶者中觀察到雙側(cè)點狀白內(nèi)障,這與Devi等[12]的發(fā)現(xiàn)相反。針對熱點突變位54位Arg殘基的不同突變,Khoshaman等[14]研究發(fā)現(xiàn),R54L、R54C及R54P突變蛋白在化學(xué)或熱應(yīng)激下均有淀粉樣蛋白形成傾向,其中R54L突變蛋白顯示出異常差的伴侶蛋白活性。此外,αA-晶狀體蛋白中F71、R12C、R21L、R21W、R116C、R116H和G98R突變蛋白均表現(xiàn)出伴侶活性的損害[15-17]。Ahsan等[18]通過對R54C位點突變的深入研究發(fā)現(xiàn),此突變不會影響晶狀體蛋白的伴侶活性,而是導(dǎo)致核小體的組蛋白濃度增加,影響細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活性,引發(fā)應(yīng)激樣反應(yīng),從而導(dǎo)致αB-晶狀體蛋白易位至細(xì)胞核、細(xì)胞骨架元件的解聚和最終的細(xì)胞死亡等事件。此外,對于其他突變的功能性研究發(fā)現(xiàn),小鼠中CRYAA的突變可以改變晶狀體的代謝狀態(tài),使乳酸代謝增加,碳水化合物代謝減少[19]。這種生理狀態(tài)的改變影響晶狀體周圍的滲透壓及生物代謝狀態(tài)從而促進白內(nèi)障的形成[19]。Li等[20]進一步研究了基因調(diào)控通路的改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn),CRYAA中3個氨基酸殘基的缺失誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá),這些蛋白的高表達(dá)誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡,這可能是促進白內(nèi)障形成的一個機制。因此,針對未折疊蛋白通路的靶向藥物研究有一定的臨床應(yīng)用前景。

2.2 CRYAB基因突變

與CRYAA部分突變位點相似,CRYAB某些突變位點也顯示出晶狀體蛋白分子伴侶特性的損害。Bova等[21]通過體外實驗證明,首個被報道的αB-晶狀體蛋白突變基因R120G破壞了蛋白β-折疊結(jié)構(gòu)的形成,影響分子伴侶特性,導(dǎo)致其與結(jié)蛋白的聚集,這可能是白內(nèi)障形成的潛在機制。此外,影響分子伴侶特性的突變基因還有D140N[22]和D109A[23]。有趣的是,P20S 突變可以通過干擾αA-晶狀體蛋白的伴侶活性參與白內(nèi)障的形成[24]。Hayes等[25]的體外研究發(fā)現(xiàn),αB-晶狀體蛋白C末端的3個基因突變包括450delA、464delCT和Q151X,甚至增加了一些伴侶活性,但其破壞了αB-晶狀體蛋白的穩(wěn)定性,增加其自聚集的傾向,從而導(dǎo)致疾病發(fā)展。αB-晶狀體蛋白在體內(nèi)廣泛表達(dá),已被證實對肌動蛋白和微管蛋白有監(jiān)護和穩(wěn)定作用,還可以防止Bax和Bcl Xs易位到線粒體來保護線粒體完整性,此外,它還通過激活核因子κB(NF-κB)增強抗凋亡蛋白Bcl2的表達(dá)水平,同時阻止caspase-3的成熟和活性,從而抑制細(xì)胞凋亡[26-28]。Raju等[29]研究D109H 和A171T突變發(fā)現(xiàn)了這2種基因突變中凋亡細(xì)胞顯著增加,突變體 D109H 中活性 caspase-3 陽性的細(xì)胞增加,αB-晶狀體蛋白的抗凋亡功能在這些突變體中受到損害。P20S 突變體中也發(fā)現(xiàn)了晶狀體上皮細(xì)胞的凋亡水平顯著增加[24]。其他可能的機制有P20R突變通過改變αB-晶狀體蛋白的親水性和等電點降低突變蛋白的溶解度而導(dǎo)致蛋白自聚集進而產(chǎn)生白內(nèi)障[30]。R11、R56等突變位點的具體功能通路影響還有待進一步研究發(fā)現(xiàn)[18,31]。

3 β-晶狀體蛋白基因

β-晶狀體蛋白和γ-晶狀體蛋白均屬于結(jié)構(gòu)蛋白,統(tǒng)稱為βγ-晶狀體蛋白總科。β-晶狀體蛋白根據(jù)等電點不同可以分為2類:酸性 β-晶狀體蛋白(βA1、βA2、βA3、βA4)和堿性β-晶狀體蛋白(βB1、βB2、βB3) 。酸性β-晶狀體蛋白含有N端和C端延伸,而堿性蛋白僅含有N端延伸。所有的β-晶狀體蛋白均有2個結(jié)構(gòu)域,每個結(jié)構(gòu)域中均有4個“Greek key”基序,這種特殊的結(jié)構(gòu)有助于維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性[7]。βA1-晶狀體蛋白和βA3-晶狀體蛋白由同一基因CRYBA3/A1編碼,CRYBA2、CRYBA4、CRYBB1、CRYBB2和CRYBB3基因分別編碼βA2-晶狀體蛋白、βA4-晶狀體蛋白、βB1-晶狀體蛋白、βB2-晶狀體蛋白和βB3-晶狀體蛋白。

3.1 CRYBA3/A1基因突變

目前發(fā)現(xiàn)的CRYBA3/A1基因突變有IVS3+1 G>A、IVS3+1 G>C、IVS3+1 G>T、IVS3+2 T>G、c.30-2 A>G 5種剪接位點突變,其中c.30-2A>G 突變的可能機制是突變導(dǎo)致成熟 mRNA的異常剪接,產(chǎn)生穩(wěn)定性差和功能失調(diào)的蛋白質(zhì)[32]。Wang等[33]在中國家庭中新發(fā)現(xiàn)的ΔG91缺失突變發(fā)生在“Greek key”基序中,突變體可產(chǎn)生折疊缺陷并導(dǎo)致蛋白質(zhì)溶解度降低,最終產(chǎn)生的臨床表型為非進展性核性白內(nèi)障。Xu等[34]對G91的缺失突變分子機制深入研究發(fā)現(xiàn),βA3-晶狀體蛋白在體內(nèi)保持二聚體與單體平衡狀態(tài),G91缺失突變體疏水表面暴露增加,傾向于形成蛋白單體,突變體的熱穩(wěn)定性、空間穩(wěn)定性和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性均降低,低溫下易形成蛋白質(zhì)聚集體,且聚集體可誘導(dǎo)早期凋亡細(xì)胞比率增加,促使細(xì)胞凋亡。有研究表明,羊毛甾醇在抑制晶狀體蛋白聚集和減少白內(nèi)障形成中起關(guān)鍵作用[35]。

3.2 CRYBA2基因突變

CRYBA2基因在晶狀體上皮細(xì)胞和纖維細(xì)胞中表達(dá),Reis等[36]最先發(fā)現(xiàn)了CRYBA2基因的錯義突變c.148G>A(V50M),此突變產(chǎn)生致病作用的具體分子機制目前尚不清楚。βA2蛋白相關(guān)的突變還包括c.193G>A(G65A)[37]、c.343A>G(N115D)[38],但其具體分子作用機制還需進一步研究探索。

3.3 CRYBA4基因突變

迄今為止,在CRYBA4基因中已經(jīng)報道了10個致病突變基因,包括F94S[39]、L69P[39]、G64W[40]、Y67N[41]、T84N[42]、S93P[43]、A9V[38]、G147V[44]和M14K[42]。CRYBA4基因最初的突變由Billingsley等[39]報道,表型為常染色體顯性白內(nèi)障且伴有先天性小眼球,突變c.317T→C(F94S)是疏水的極性氨基酸突變?yōu)榉菢O性小氨基酸,降低了βA4-晶狀體蛋白單體的穩(wěn)定性;突變c.242T→C (L69P) 則可能是通過破壞β-折疊影響蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性從而致病。G147V突變位于“Greek key”基序IV,是第一個與常染色體隱性遺傳相關(guān)的CRYBA4基因突變[44]。G64W、Y67N、T84N、S93P突變均位于“Greek key”基序II。Wang等[45]報道的c.169T>C(F57L)突變位于β折疊中,可能通過破壞氫鍵降低蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。近期發(fā)現(xiàn)的M14K突變是首個被報道的位于“Greek key”基序I中的突變,疏水性非極性蛋氨酸突變?yōu)橛H水性極性賴氨酸,相應(yīng)區(qū)域的疏水性改變可能會通過影響蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)從而損害蛋白折疊,降低結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性,可能與G64W存在相同的致病分子機制[42]。

3.4 CRYBB1基因突變

CRYBB1基因突變最初由美國醫(yī)生Mackay等[46]報道,G220X-βB1突變體位于外顯子6,突變致使“Greek key”基序IV顯著縮短,降低了突變蛋白在細(xì)菌中的溶解度。目前已報道20余種CRYBB1基因中的突變體,包括常染色體顯性遺傳和隱性遺傳,其中隱性遺傳突變位于外顯子1/2,顯性遺傳突變位于外顯子3/4/6,絕大部分突變位于“Greek key”基序中[42,47-48]。Rao等[49]將Q227X突變體與野生型比較發(fā)現(xiàn),突變在結(jié)構(gòu)上使C末端延伸和“Greek key”基序IV的缺失,這降低了βB1-晶狀體蛋白的熱穩(wěn)定性,還影響在熱應(yīng)激下αA-晶狀體蛋白的分子伴侶功能,干擾其與βB1-晶狀體蛋白間的相互作用。針對導(dǎo)致CC小角膜綜合征的首個突變體X253R的分子機制研究表明,突變體在細(xì)胞中誘導(dǎo)βB1-晶狀體聚集,異常的細(xì)胞內(nèi)聚集體對細(xì)胞存活顯現(xiàn)毒性作用,可誘導(dǎo)細(xì)胞死亡;另一方面,突變體導(dǎo)致C端延長,增加了蛋白的疏水性,降低了蛋白溶解度[50]。與先前研究相似的是,以上突變的細(xì)胞內(nèi)聚集體可以被羊毛甾醇溶解[50]。

3.5 CRYBB2基因突變

βB2-晶狀體蛋白是含量最豐富的β-晶狀體蛋白,目前已發(fā)現(xiàn)30余種突變體,大多數(shù)CRYBB2突變存在于“Greek key”基序 III和IV中[42]。Zhao等[51]對W59C和W151C突變體的研究證實了這2種突變可以降低蛋白質(zhì)穩(wěn)定性,增強其對紫外線敏感性導(dǎo)致聚集并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。同樣地,羊毛甾醇可以有效地溶解蛋白質(zhì)聚集體,是預(yù)防和治療CC的潛在選擇。此外,Li等[20]研究證明,CRYBB2基因突變誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá),而之前的研究證明相關(guān)基因可以誘導(dǎo)晶狀體上皮細(xì)胞凋亡。Chen等[52]對I21N突變的致病機制研究進一步證實了這一點,揭示了誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子通路,其研究還指出,與野生型相比,突變體更傾向于在細(xì)胞核周圍積聚,這可能會阻止晶狀體纖維細(xì)胞的去核過程,從而導(dǎo)致晶狀體混濁。

3.6 CRYBB3基因突變

對于βB3-晶狀體蛋白研究最少,發(fā)現(xiàn)的突變基因也最少,至今共發(fā)現(xiàn)9種突變,其中8種為錯義突變,一種為剪接位點突變,絕大部分突變位于“Greek key”基序中[42,53]。目前沒有針對CRYBB3基因突變的分子機制研究,根據(jù)對其他β-晶狀體蛋白基因突變的研究可以推測,βB3-晶狀體蛋白中“Greek key”基序的破壞對蛋白質(zhì)特性的改變可能與其他β-晶狀體蛋白基因突變有著相似的致病機制。另外,Yu等[42]報道的剪接位點突變c.75+1可以導(dǎo)致外顯子的錯誤連接,影響成熟mRNA的剪接,是其致病的可能機制。

4 γ-晶狀體蛋白基因

γ-晶狀體蛋白家族包括γA-晶狀體蛋白、γB-晶狀體蛋白、γC-晶狀體蛋白、γD-晶狀體蛋白、γE-晶狀體蛋白、γF-晶狀體蛋白和γS-晶狀體蛋白。先天性白內(nèi)障突變主要見于CRYGC基因、CRYGD基因和CRYGS基因[6]。γ-晶狀體蛋白主要分布在晶狀體的核區(qū)域,具有2個結(jié)構(gòu)域,每個結(jié)構(gòu)域含有2個“Greek key”基序,結(jié)構(gòu)分析表明,其所有非極性殘基均堆積在內(nèi)部,而極性殘基則分布于表面,使分子在熱力學(xué)和動力學(xué)上均更加穩(wěn)定[54]。

4.1 CRYGC基因突變

目前已報道近30種CRYGC基因相關(guān)突變,幾乎所有突變均位于“Greek key”基序II和IV中,CRYGC具有高度對稱的內(nèi)部結(jié)構(gòu),突變可能會破壞這種對稱,造成分子內(nèi)的交聯(lián)和相互作用,導(dǎo)致蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定和聚集[6,55]。Xi等[56]對γC-晶狀體蛋白中的G129C突變研究指出,突變可能會改變結(jié)構(gòu)域相互作用界面,從而改變2個結(jié)構(gòu)域的幾何配對形狀,在溫和的變性條件下,增加的結(jié)構(gòu)域運動可能通過結(jié)構(gòu)域交換促進非天然低聚物的形成,這種易于聚集的中間體逃避了αA-晶狀體蛋白的分子伴侶功能,突變體還可以形成淀粉樣蛋白原纖維,對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Fu等[57]對于先前報道的突變體L45P和Y46D研究揭示,生理溫度下2種突變體均形成明顯的聚集體,損害γC-晶狀體蛋白的熱穩(wěn)定性,不過這種聚集可以被αA-晶狀體蛋白抑制;進一步研究證明,突變體L45P和Y46D損害了“Greek key”基序中β-折疊的氫鍵網(wǎng)絡(luò),改變了γC-晶狀體蛋白的二級結(jié)構(gòu),使得突變體在紫外線照射、pH值變化、氧化應(yīng)激和化學(xué)試劑等環(huán)境下具有低溶解度和高聚集傾向,是引起白內(nèi)障的潛在分子機制[58]。

4.2 CRYGD基因突變

研究發(fā)現(xiàn),人體的γD-晶狀體蛋白中存在氧化還原酶活性,帶有氧化還原酶活性的二硫化物可以轉(zhuǎn)移到W42Q突變體N末端暴露的半胱氨酸殘基上,使突變體鎖定在易于聚集的中間狀態(tài),并且溶解度降低[59]。Aguayo-Ortiz等[60]對γD-晶狀體蛋白的10種突變體研究發(fā)現(xiàn),位于“Greek key”基序中的W42R突變是最不穩(wěn)定的突變體。W42R突變體破壞了維持γD-晶狀體蛋白折疊內(nèi)在穩(wěn)定性的疏水區(qū)域,使疏水殘基暴露,非特異性疏水相互作用形成高濃度的二聚體和高級寡聚體,導(dǎo)致晶狀體蛋白的大量聚集[61]。另外,對于P24T突變的研究指出,參與白內(nèi)障形成的蛋白質(zhì)聚集過程可能在性質(zhì)上不同于先前研究的可以被羊毛甾醇逆轉(zhuǎn)的淀粉樣蛋白[62],這種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的變化遠(yuǎn)早于淀粉樣蛋白形成之前,可能是預(yù)防或治療方法研究的新思路。

4.3 CRYGS基因突變

目前,CRYGS已存在9種突變[63-64]。Vendra等[54]對γS-晶狀體蛋白S39C突變體進行分析發(fā)現(xiàn),絲氨酸被半胱氨酸取代,使蛋白表面極性變大,增加了疏水性,從而導(dǎo)致自聚集并產(chǎn)生光散射顆粒。而針對此位點的進一步研究發(fā)現(xiàn),S39C突變并沒有改變晶狀體蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu),而是通過阻止γS-晶狀體蛋白形成二硫鍵連接的二聚體,從而降低了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性[65]。Zhang等[64]在Y67N錯義突變中不僅發(fā)現(xiàn)了突變體局部的疏水性降低,而且在細(xì)胞中的定位也發(fā)生變化,在細(xì)胞膜中顯著增加,而在細(xì)胞質(zhì)中略有減少,這種親水性和定位的改變是其致病的潛在機制。G75位于連接“Greek key”基序I和II中2個β-晶狀體蛋白折疊的環(huán)上,Zhu等[66]對G75V突變體進行蛋白質(zhì)特性研究發(fā)現(xiàn),該突變主要改變γS-晶狀體蛋白的三級結(jié)構(gòu),致使其生物物理特性發(fā)生變化,降低了蛋白質(zhì)的溶解度和穩(wěn)定性,增加其在紫外線照射下的聚集傾向,誘導(dǎo)白內(nèi)障發(fā)生。最新發(fā)現(xiàn)的錯義突變F30S導(dǎo)致蛋白質(zhì)芳香殘基側(cè)鏈周圍的微環(huán)境變化產(chǎn)生增加對紫外線照射的敏感性,誘導(dǎo)聚集并降低蛋白質(zhì)穩(wěn)定性等效應(yīng)[63]。He等[67]研究發(fā)現(xiàn),ATP可以作為水溶劑來維持蛋白溶解度并防止晶狀體蛋白的聚集,而維持眼晶狀體ATP的正常濃度也是未來有希望的CC治療策略。有研究發(fā)現(xiàn),突變體G18V可以消除ATP對不穩(wěn)定聚集的拮抗作用,促進疾病發(fā)生[68]。

5 結(jié)束語

CC病因復(fù)雜,其中遺傳性因素是目前可研究的一個主要因素。本文針對其中晶狀體蛋白基因的突變進展和功能分析進行總結(jié),先天性白內(nèi)障突變基因的主要致病機制為通過改變蛋白質(zhì)的二級或三級結(jié)構(gòu)干擾蛋白質(zhì)的正確折疊從而影響蛋白質(zhì)的溶解度和穩(wěn)定性,形成細(xì)胞毒性的聚集小體,干擾蛋白質(zhì)之間的相互作用并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,消除ATP拮抗聚集效應(yīng)等。目前對于治療新思路的研究主要集中在藥物逆轉(zhuǎn)、維持ATP有效濃度及基因編輯技術(shù)等,實驗主要采用體外模型或者動物模型,在人體中的應(yīng)用問題還需要進一步研究解決。除了羊毛甾醇之外,白內(nèi)障的潛在治療藥物還包括胭脂紅蟲、鄰香蘭素、萘醌色氨酸雜合物、蘆丁、金納米粒子等,這些藥物均經(jīng)研究證實可以在體外抑制晶狀體蛋白的聚集,還需要更多試驗探究其在人體中的藥物轉(zhuǎn)化作用。