何藝嵐 成仲夏 王國(guó)棟 王瑞霞 聶海燕 曾芝付 宋永硯

黃斑水腫是視網(wǎng)膜黃斑區(qū)細(xì)胞外液異常聚集引起的眼科常見(jiàn)病,主要由糖尿病視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜分支靜脈阻塞(BRVO)、視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞、年齡相關(guān)性黃斑變性(AMD)等繼發(fā)所致。對(duì)于視網(wǎng)膜病變患者,高血糖、高血脂、高血壓、炎癥、動(dòng)脈硬化等多種因素均可損傷視網(wǎng)膜微血管,增強(qiáng)毛細(xì)血管通透性,破壞血-視網(wǎng)膜屏障,最終導(dǎo)致液體異常積聚在視網(wǎng)膜黃斑外叢狀層和內(nèi)核層之間形成黃斑水腫[1-4]。黃斑水腫可嚴(yán)重?fù)p害患者視功能,導(dǎo)致患者視物變形、視野缺損、視力下降甚至永久性失明。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)能促進(jìn)血管新生,增強(qiáng)血管通透性,在黃斑水腫的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[5-7]。目前臨床上多采用抗VEGF藥物,如阿柏西普、康柏西普、雷珠單抗、貝伐單抗等玻璃體內(nèi)注射治療黃斑水腫,但部分患者療效欠佳[8-9]。抗VEGF藥物屬于單抗藥物,其作用靶點(diǎn)是VEGF,通過(guò)與VEGF特異性結(jié)合抑制其血管增殖活性并降低血管通透性,從而減輕黃斑水腫。理論上,VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)的變異位點(diǎn)可增強(qiáng)或減弱其基因表達(dá),從而影響抗VEGF藥物的療效。本研究探討VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性與抗VEGF藥物治療黃斑水腫療效的相關(guān)性,為臨床精準(zhǔn)治療黃斑水腫和合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2020年9月至2022年3月在成都大學(xué)附屬醫(yī)院經(jīng)熒光素眼底血管造影和光學(xué)相干斷層掃描確診的黃斑水腫患者145例(190眼)作為研究對(duì)象?；颊吲懦龢?biāo)準(zhǔn):(1)既往玻璃體內(nèi)注射過(guò)抗VEGF藥物或激素類(lèi)藥物;(2)兩只患眼經(jīng)抗VEGF藥物治療后一只有效另一只無(wú)效;(3)既往有眼部手術(shù)史者;(4)既往行視網(wǎng)膜激光光凝術(shù)或光動(dòng)力學(xué)治療者;(5)既往有眼部外傷史或其他眼底病史者;(6)屈光間質(zhì)混濁者。本研究經(jīng)成都大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),所有患者均知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 治療方法

治療藥物按醫(yī)師偏好并征得患者同意后進(jìn)行玻璃體內(nèi)注射,每眼注射0.025 mL阿柏西普、康柏西普或雷珠單抗。手術(shù)遵循無(wú)菌原則:常規(guī)消毒后采用4 g·L-1鹽酸奧布卡因滴眼液行表面麻醉,使用無(wú)菌注射器距角膜緣3.5 ～ 4.0 mm處穿刺注射抗VEGF藥物,注射完成輕壓穿刺部位15 s,無(wú)菌敷料包扎患眼。

1.3 分組

采用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)視力表檢查患者最佳矯正視力,根據(jù)治療后視力改善情況進(jìn)行分組,治療后1個(gè)月視力提升5個(gè)字母及以上者納入有效組,視力提升少于5個(gè)字母或無(wú)改善者納入無(wú)效組。

1.4 資料收集

所有患者的資料由兩名研究人員共同收集。(1)一般資料:年齡、性別、體重指數(shù)、吸煙史、飲酒史、高血壓、糖尿病等;(2)眼科指標(biāo):黃斑水腫病程、眼壓、抗VEGF藥物、黃斑水腫類(lèi)型、并發(fā)癥、最小分辨角對(duì)數(shù)(logMAR)視力、黃斑中心凹視網(wǎng)膜厚度(CMT)等;(3)生理生化指標(biāo):丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、尿素、肌酐、尿酸、胱抑素C、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、載脂蛋白B(apoB)、載脂蛋白AI(apoAI)、脂蛋白a[Lp(a)]、同型半胱氨酸(HCY)、血糖、血紅蛋白、糖化血紅蛋白、超敏C反應(yīng)蛋白(hs-CRP)、中性粒細(xì)胞數(shù)、單核細(xì)胞數(shù)等。

1.5 基因分型

從患者外周血白細(xì)胞中提取基因組DNA,實(shí)驗(yàn)操作參照試劑盒說(shuō)明書(shū)(北京天根生化科技有限公司)進(jìn)行。用PCR擴(kuò)增含有VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)的DNA區(qū)段,引物由成都擎科生物公司合成,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送成都擎科生物公司測(cè)序(表1)。

表1 VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)的PCR引物序列、產(chǎn)物大小及擴(kuò)增條件

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 一般資料

最終共有145例(190眼)黃斑水腫患者參與本研究,其中男91例,女54例;有效組患者64例(81眼),無(wú)效組患者81例(109眼)。有效組患者BRVO發(fā)生率、基線(xiàn)logMAR視力及基線(xiàn)CMT均高于無(wú)效組(均為P<0.05);有效組患者AMD發(fā)生率、LDL-C、apoB、血糖及單核細(xì)胞數(shù)均低于無(wú)效組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。其他指標(biāo)兩組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(表2)。

2.2 遺傳特征

共有83例患者完成血液采集、基因組提取和DNA測(cè)序,其中有效組38例,無(wú)效組45例。有效組患者rs13207351多態(tài)性A等位基因頻率高于無(wú)效組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);有效組患者AA及AG基因型頻率高于無(wú)效組,差異接近于有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.07)。其他多態(tài)性位點(diǎn)基因型及等位基因頻率兩組間比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(圖1和表3)。

圖1 VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)rs13207351多態(tài)性測(cè)序圖

表3 兩組患者VEGF基因型及等位基因分布情況

2.3 VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)rs13207351多態(tài)性不同基因型患者生理生化指標(biāo)比較

AA及AG基因型患者血糖水平均低于GG基因型患者,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。AG基因型患者胱抑素C水平高于AA及GG基因型患者(均為P<0.05)。其他指標(biāo)組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(表4)。

表4 VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)rs13207351多態(tài)性不同基因型患者生理生化指標(biāo)比較

2.4 VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)rs13207351不同基因型患者治療前后視力指標(biāo)、CMT和眼壓比較

AA及AG基因型患者抗VEGF藥物治療后小數(shù)視力、字母視力及l(fā)ogMAR視力均優(yōu)于治療前,且AA基因型患者視力改善程度稍?xún)?yōu)于AG基因型患者(均為P<0.05);AA及AG基因型患者抗VEGF藥物治療后CMT均低于治療前,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。GG基因型患者抗VEGF藥物治療后小數(shù)視力、字母視力及l(fā)ogMAR視力與治療前相比變化均不明顯(均為P>0.05),CMT較治療前有所降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組眼壓治療前后差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P>0.05)(表5)。

表5 VEGF基因啟動(dòng)子區(qū)rs13207351不同基因型患者治療前后視力指標(biāo)、CMT和眼壓比較

3 討論

VEGF家族包含VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE、VEGFF、胎盤(pán)生長(zhǎng)因子和內(nèi)分泌腺源性VEGF等8個(gè)成員,其中VEGFA是主要成員。VEGFA又稱(chēng)為VEGF、血管通透性因子,具有強(qiáng)大的促血管生成作用。rs13207351多態(tài)性位于VEGF基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-1 117 bp處,由G變異成A所生成,次要等位基因A在中國(guó)人群中的頻率為0.23～0.28[10-12]。本研究結(jié)果顯示,rs13207351多態(tài)性與抗VEGF藥物治療黃斑水腫療效顯著相關(guān),A等位基因攜帶者(AA和AG基因型患者)抗VEGF藥物治療后療效較好,視力及CMT均顯著改善,而GG基因型患者治療后視力變化不明顯,CMT雖有所改善,但降低幅度不大。本研究發(fā)現(xiàn),rs13207351多態(tài)性GG基因型患者血糖水平較AA或AG基因型患者顯著升高,這可能是GG基因型患者抗VEGF藥物治療后效果不佳的原因之一。多項(xiàng)研究[11-15]結(jié)果表明,rs13207351多態(tài)性與糖尿病視網(wǎng)膜病變顯著相關(guān),這與本研究中rs13207351多態(tài)性與血糖水平顯著相關(guān)一致。Buroker等[16]通過(guò)JASPAR預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn),rs13207351多態(tài)性位于核因子C、鋅指蛋白ZFX、CpG 結(jié)合蛋白相互作用鋅指蛋白等轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA結(jié)合基序中,可能對(duì)VEGF基因表達(dá)產(chǎn)生影響。

本研究結(jié)果中,rs2010963、rs25648、rs1570360、rs833061、rs699947和rs144854329等其他6個(gè)VEGF多態(tài)性位點(diǎn)與抗VEGF藥物治療黃斑水腫療效不相關(guān)。在一項(xiàng)來(lái)自西班牙的研究[17]中,研究人員以高度近視合并脈絡(luò)膜新生血管患者為研究對(duì)象,未觀察到rs2010963、rs25648和rs1570360等變異位點(diǎn)與雷珠單抗療效具有相關(guān)性,這與本研究結(jié)果一致。Abedi等[18]在AMD患者中探討了rs3025000、rs3024994和rs3025010等7個(gè)VEGF內(nèi)含子區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)與抗VEGF藥物療效的相關(guān)性,發(fā)現(xiàn)rs3025000位點(diǎn)與抗VEGF藥物療效顯著相關(guān),治療后A等位基因攜帶者的視力改善程度顯著高于CC基因型患者,這從另一個(gè)側(cè)面印證了我們的發(fā)現(xiàn),即VEGF基因變異確實(shí)可能對(duì)抗VEGF藥物的療效產(chǎn)生影響。另外,本研究還發(fā)現(xiàn),rs699947和rs144854329完全連鎖,其基因型及等位基因分布頻率完全相同。

阿柏西普是美國(guó)FDA批準(zhǔn)的用于治療濕性老年性黃斑變性的抗VEGF單抗藥物。康柏西普是我國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)并獲得WHO國(guó)際通用名的全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)生物 I類(lèi)新藥。康柏西普在阿柏西普的基礎(chǔ)上增加了免疫球蛋白樣區(qū)域4,該區(qū)域可增強(qiáng)抗VEGF藥物與VEGF的親和力[19]。阿柏西普、康柏西普和雷珠單抗均可作為誘餌受體與VEGF特異性結(jié)合,從而抑制VEGF介導(dǎo)的血管新生作用。本研究結(jié)果中,阿柏西普、康柏西普和雷珠單抗在有效組與無(wú)效組中的分布頻率無(wú)明顯差異,提示三種抗VEGF藥物治療黃斑水腫的療效相當(dāng)。除rs13207351多態(tài)性外,本研究結(jié)果還顯示,黃斑水腫類(lèi)型及嚴(yán)重程度、代謝、免疫等因素也與抗VEGF藥物療效顯著相關(guān),有效組患者BRVO發(fā)生率、基線(xiàn)logMAR視力及基線(xiàn)CMT均高于無(wú)效組(均為P<0.05);有效組患者AMD發(fā)生率、LDL-C、apoB、血糖及單核細(xì)胞數(shù)均低于無(wú)效組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均為P<0.05)。

本研究具有一定的局限性,未檢測(cè)VEGF基因rs13207351多態(tài)性不同基因型患者血清的VEGF濃度。測(cè)定并比較不同基因型患者血清的VEGF水平可以更好地理解rs13207351多態(tài)性與抗VEGF藥物療效顯著相關(guān)的分子機(jī)制。另外,本研究中對(duì)療效的觀察時(shí)間較短。

4 結(jié)論

VEGF基因rs13207351多態(tài)性與抗VEGF藥物治療黃斑水腫療效顯著相關(guān),此研究結(jié)果可為黃斑水腫的精準(zhǔn)治療和合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。